劉小霞+夏菁++唐家鋒+周明華+陳地龍+劉澤洪

[摘要]為了研究人參皂苷Rh2對人白血病細(xì)胞K562的凋亡作用，并從自噬角度來探討其機(jī)制。實驗采用CCK8方法檢測人參皂苷單體Rh2對人白血病K562細(xì)胞增殖抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；Hoechest染色觀察細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)；吖啶橙和MDC染色觀察Rh2對細(xì)胞自噬的影響；Western blot和RTPCR檢測Rh2對白血病細(xì)胞自噬重要基因的表達(dá)的影響；運(yùn)用自噬抑制劑（3MA）研究自噬對細(xì)胞增殖和凋亡的影響。CCK8顯示人參皂苷Rh2在低濃度時能有效抑制白血病細(xì)胞增殖，且其抑制作用具有濃度和時間依賴性；FCM和Hoechest顯示Rh2能增加細(xì)胞的凋亡和染色質(zhì)呈凋亡形態(tài)改變；吖啶橙和MDC染色發(fā)現(xiàn)Rh2組細(xì)胞的綠色熒光增強(qiáng)，并出現(xiàn)大量酸性自噬小泡；Western blot和RTPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rh2能上調(diào)Beclin1，LC3A，LC3B，激活型Caspase3和pp38的表達(dá)；運(yùn)用細(xì)胞自噬劑（3MA）會削弱Rh2對K562的增殖抑制和促凋亡作用。人參皂苷Rh2可能通過激活磷酸化的p38，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬途徑，從而抑制K562細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡作用。

[關(guān)鍵詞]人參皂苷Rh2； 白血??； 自噬； 凋亡

白血病是嚴(yán)重危害人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是國內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一。迄今，白血病的治療仍主要采用傳統(tǒng)的大劑量聯(lián)合化療，但此療法副作用甚大，復(fù)發(fā)率很高，尤其對機(jī)體免疫與造血系統(tǒng)有極大的損害。因此，可以從傳統(tǒng)的中藥中尋找天然低毒的藥物來治療白血病。其中人參Panax ginseng CAMeyer是我國傳統(tǒng)中草藥，在腫瘤的治療方面具有很高的藥用價值[1]。S型人參皂苷單體Rh2[（S）Rh2]是人參中天然活性成分之一，是一種從紅參中分離得到的原人參二醇型單糖鏈皂苷單體化合物，其毒性低，相對分子質(zhì)量小，脂溶性好，具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性[2]。

目前大家認(rèn)為，細(xì)胞死亡包括3種類型：即壞死、凋亡和自噬性細(xì)胞死亡，其中，自噬是屬于比較熱門的Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡方式[3]。細(xì)胞程序性死亡中，自噬可能比凋亡扮演更為主動和重要的角色。自噬在腫瘤細(xì)胞起到雙刃劍作用，可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞，也可以殺傷腫瘤細(xì)胞[4]。作者選取人紅白血病K562細(xì)胞株作為研究對象，為了進(jìn)一步弄清楚人參皂苷Rh2對白血病的藥理作用，并從自噬途徑研究人參皂苷Rh2促進(jìn)人白血病細(xì)胞自噬凋亡機(jī)制，為Rh2應(yīng)用于臨床治療白血病奠定實驗和理論基礎(chǔ)。

1材料

11K562細(xì)胞株人紅白血病K562細(xì)胞株購自上海ATCC細(xì)胞庫。每次取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞以5×108個/L接種于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每2～3 d傳代或換液。

12藥品Rh2購自成都曼斯特科技有限公司（純度98%），取200 μL DMSO加入20 mg Rh2使之充分溶解，配制成100 mg·L-1原液，-20 ℃冷凍保存。實驗前用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

13試劑胎牛血清，RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；CCK8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；Annexin VPI雙標(biāo)凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物公司）；吖啶橙，MDC染液，3MA自噬抑制劑（美國Sigma公司）；MAPK通路抗體試劑盒，Beclin1，LC3A/B多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology）；Bcl2，Bax多克隆抗體（美國Epitomics公司）。

14儀器超凈工作臺（Sanyo）；倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus）；低溫離心機(jī)（Sigma）；酶標(biāo)儀，垂直電泳儀，電轉(zhuǎn)儀，ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，PCR儀（BioRad）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）。

2方法

21CCK8 法培養(yǎng)對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，以1×104 個/孔接種于96孔板中。分為空白對照組、藥物組和本底對照組，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔200 μL，（S）Rh2 20～100 μmol·L-1；本底對照組：只加RPMI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24，48，72 h后，每孔加入10 μL CCK8檢測液，輕輕搖勻，孵育25 h 后，用酶標(biāo)儀（波長450 nm）檢測每孔吸光度（A），并計算細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。

22FCM檢測早期凋亡培養(yǎng)對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度分別至5×108 個/L，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。實驗分為4組：Ⅰ組為空白對照組，正常培養(yǎng)；Ⅱ組加入（S）Rh2 60 μmol·L-1；Ⅲ組加入5 mmol·L-1的自噬抑制劑3MA；Ⅳ組同時加入（S）Rh2 60 μmol·L-1和3MA 5 mmol·L-1。每孔3 mL培養(yǎng)液，在37 ℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)24，48 h后，分別收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷001 mol·L-1PBS（pH 72）洗滌2次，4 ℃ 1 200 ×g離心5 min。加入RNA酶和碘化丙啶（PI） 和Annexin V，置于冰上染色處理30 min，每組細(xì)胞2×104個，上流式細(xì)胞儀檢測，重復(fù)實驗3次。

23Hoechst染色取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為5×108 個/L，接種于6孔培養(yǎng)板。實驗分組：空白對照組含01% DMSO的RPMI 1640完全培養(yǎng)液；藥物組60 μmol ·L-1的Rh2培養(yǎng)48 h后，收集空白對照組和藥物組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加甲醇乙醇（3∶1）固定液室溫固定15 min；離心去除固定液加Hoechst染色液避光、室溫染色30 min，PBS洗滌1次，調(diào)整細(xì)胞濃度，滴片，熒光顯微鏡下觀察。

24吖啶橙染色K562細(xì)胞用人參皂苷（S）Rh2 60 μmol·L-1處理24 h后，收集細(xì)胞，新選配制的吖啶橙（2 μ·mL-1），37 ℃避光孵育15 min，在EP管中，用PBS漂洗3次后，調(diào)整細(xì)胞濃度，取一滴細(xì)胞懸液滴到玻片上，待細(xì)胞沉積到玻片上時，吸去上層液體，封片置于熒光顯微鏡下觀察酸性的自噬小泡。50%甘油封片，置于倒置熒光顯微鏡下觀察、采圖，實驗重復(fù)3次。

25Western blot取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度到5×108 個/L，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。實驗分組為對照組和藥物組（S）Rh2（20，40，60 μmol·L-1），置培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。提取蛋白并將各組蛋白濃度調(diào)成4 g·L-1，沸水中煮沸5 min，蛋白完全變性后，冷卻，每個樣品取10 μL加入泳道中，保證每孔中有40 μg待測蛋白樣品，行SDSPAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入抗體MAPK信號通路抗體按1∶500稀釋；Bcl2，Bax，Caspase3（激活型），LC3A和LC3B按1∶1 000稀釋抗體，及Beclin1和βactin按1∶2 000稀釋抗體，4 ℃孵育過夜；用TBST漂洗3次，每次10 min置于脫色搖床上；分別加入以1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，再用TBST漂洗3次，每次10 min置于脫色搖床上；最后在保鮮膜上滴入ECL化學(xué)發(fā)光液，在暗室進(jìn)行X膠片曝光，洗片，膠片晾干后。掃描膠片，Quantity One軟件定量分析，此實驗重復(fù)3次。

26RTPCR參照試劑盒說明書進(jìn)行，Trizol提取細(xì)胞總RNA。采用TAKARA反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA。應(yīng)用TAKARA的SYBRⅡ試劑，PCR反應(yīng)體系為10 μL。檢測自噬重要基因的mRNA 水平。引物由上海生工生物公司提供，引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參基因，用目的基因與GAPDH 的起始拷貝數(shù)比值表示目的基因的相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3次。

3結(jié)果

31CCK8檢測細(xì)胞增殖抑制能力藥物組與對照組比較，人參皂苷（S）Rh2能有效抑制白血病K562細(xì)胞增殖，并呈濃度和時間依耐性且K562細(xì)胞48 h的IC50為60 μmol·L-1。因此，選擇Rh2（60 μmol·L-1）作為實驗研究最大濃度，見圖1。

32流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞凋亡Rh2 （60 μmol·L-1） 處理K562細(xì)胞24 h 后，F(xiàn)CM檢測結(jié)果顯示加藥與對照組比較1）P<005（圖5，6，8同）。

組細(xì)胞早期和晚期凋亡數(shù)量明顯增多，其早期凋亡率分別為（1200±260）%，且隨著濃度的增高，早期凋亡率增高，分別與對照組（318±052）%相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）；晚期凋亡率分別為（1632±345）%，且隨著濃度的增高，晚期凋亡率增高，分別與空白對照組（319±073）%相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）。

33Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡Rh2（60 μmol·L-1）誘導(dǎo)K562細(xì)胞48 h后，用Hoechst染色顯示，細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、核碎裂、核邊集的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，并且細(xì)胞發(fā)出藍(lán)色熒光較對照組細(xì)胞強(qiáng)，見圖2，說明Rh2能誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。

34MDC染色觀察細(xì)胞自噬人參皂苷（S）Rh2（60 μmol·L-1）處理K562細(xì)胞24 h后，用MDC染色后，觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度，見圖3，經(jīng)人參皂苷（S）Rh2誘導(dǎo)后，K562細(xì)胞中的酸性自噬小泡均明顯增加，對照組綠色的自噬小泡基本看不見，說明人參皂苷（S）Rh2能夠增強(qiáng)細(xì)胞自噬。

35吖啶橙染色觀察細(xì)胞自噬人參皂苷（S）Rh2（60 μmol·L-1）處理K562細(xì)胞24 h后，用吖啶橙染色后，觀察細(xì)胞內(nèi)的自噬體，見圖4，細(xì)胞內(nèi)綠色代表酸性自噬小體，紅色代表核仁，經(jīng)人參皂苷（S）Rh2誘導(dǎo)后，K562細(xì)胞中的酸性自噬小泡均明顯增加，對照組綠色的自噬小泡基本看不見。

36RTPCR檢測自噬重要調(diào)控基因的表達(dá)與對照組比較，K562細(xì)胞經(jīng)60 μmol·L-1的（S）Rh2作用24 h后，自噬相關(guān)基因（Atg3，Atg5，Atg7，Atg12）在2種細(xì)胞中變化不明顯，而自噬重要調(diào)控基因Beclin1，LC3A，LC3B的表達(dá)卻明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），見圖5。

37Western blot檢測自噬重要蛋白的表達(dá)與對照組比較，K562細(xì)胞經(jīng)不同濃度的（S）Rh2作用后，Beclin1，LC3A，LC3B蛋白的表達(dá)水平明顯增高，見圖6。人參皂苷（S）Rh2能在分子水平上增加自噬重要的蛋白和基因的表達(dá)，進(jìn)一步確定了（S）Rh2能誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞發(fā)生自噬。

38（S）Rh2通過自噬抑制細(xì)胞增殖作用CCK8檢測細(xì)胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用自噬抑制劑3MA能輕微降低細(xì)胞活力，但是無統(tǒng)計學(xué)意義；單獨(dú)使用（S）Rh2能明顯降低細(xì)胞活力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）；然而在聯(lián)合加入自噬抑制劑3MA和（S）Rh2后，與單獨(dú)加入（S）Rh2組比較，細(xì)胞活力有明顯的回升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），說明

39（S）Rh2通過自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞加入自噬抑制劑時，與對照組比較無明顯改變；單獨(dú)使用（S）Rh2時，細(xì)胞凋亡明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意（P<005）；然而在聯(lián)合加入自噬抑制劑3MA和（S）Rh2后，與單獨(dú)加入（S）Rh2組比較，細(xì)胞凋亡有明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），說明細(xì)胞自噬能增強(qiáng)人參皂苷（S）Rh2對白血病K562細(xì)胞的促凋亡作用，見表2。

310Western blot檢測自噬對（S）Rh2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的影響單獨(dú)運(yùn)用自噬抑制劑3MA后，細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白LC3A/B有下降的趨勢，單獨(dú)運(yùn)用（S）Rh2后，細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白LC3A/B和激活型的Caspase3表達(dá)明顯上升，當(dāng)同時加入自噬抑制劑3MA和（S）Rh2后，細(xì)胞的自噬關(guān)鍵蛋白LC3A/B和激活型Caspase3的表達(dá)比單獨(dú)運(yùn)用（S）Rh2時明顯下降，說明抑制自噬后細(xì)胞凋亡現(xiàn)象減少，自噬可促進(jìn)人參皂苷（S）Rh2誘導(dǎo)K562的凋亡作用，見圖7。

與對照組比較1）P<005，與Rh2組比較2）P<005。

311Rh2通過激活磷酸化p38調(diào)控K562細(xì)胞自噬凋亡10，20，40，60 μmol·L-1Rh2 作用于K562細(xì)胞24 h后，Western blot結(jié)果顯示，p38蛋白的表達(dá)幾乎沒變化，pp38的表達(dá)增加，提示Rh2可能通過激活磷酸化p38調(diào)控K562細(xì)胞自噬凋亡，見圖8。

4討論

目前，許多研究者認(rèn)為自然界中有豐富抗腫瘤的天然藥物，本課題組前期實驗表明人參提取物人參總皂苷和單體能在體外抑制白血病和肝癌細(xì)胞增殖，阻滯周期，促進(jìn)凋亡。其他國內(nèi)外研究人員也研究證實，人參皂苷單體能抑制各種腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[56]。因此采用CCK8法研究人參皂苷單體Rh2對白血病細(xì)胞K562增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)人參皂苷單體Rh2能有效抑制白血病細(xì)胞的增長。通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)人參皂苷單體Rh2能促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，Hoechst染色同樣證明了Rh2能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Rh2能夠

增加Bax/Bcl2的比例，同時激活Caspase3，說明了Rh2能通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞自噬和凋亡密切相關(guān)，凋亡的早期，細(xì)胞出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，會出現(xiàn)自噬。為了探討人參皂苷（S）Rh2對白血病細(xì)胞自噬的關(guān)系，運(yùn)用了吖啶橙和MDC染色。發(fā)現(xiàn)加藥組早期細(xì)胞出現(xiàn)酸性的自噬泡，PCR和Western blot結(jié)果顯示自噬相關(guān)基因和蛋白分子（Beclin1，LC3A和LC3B）的表達(dá)均升高，證明了人參皂苷（S）Rh2能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生自噬。 自噬異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可以從不同生物學(xué)行為影響腫瘤的進(jìn)程，其中有細(xì)胞周期、增殖、凋亡、耐藥、血管生成及腫瘤的治療等方面的調(diào)控[7]。文獻(xiàn)研究報道，自噬和細(xì)胞凋亡的關(guān)系存在兩面性，維持細(xì)胞生存和促進(jìn)細(xì)胞死亡[8]。前面的實驗證明了人參皂苷Rh2既能誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡又能誘導(dǎo)其發(fā)生自噬，那么細(xì)胞自噬和凋亡關(guān)系是怎樣的呢？實驗表明，當(dāng)同時加入自噬抑制劑3MA和Rh2時，與單獨(dú)加入Rh2相比，K562的細(xì)胞凋亡減少和細(xì)胞活力增強(qiáng)。說明抑制細(xì)胞自噬，可削弱人參皂苷Rh2對白血病細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，提示人參皂苷Rh2可以通過誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生自噬，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

目前，MAPK信號通路能調(diào)控自噬和細(xì)胞凋亡[9]。作者前期的研究已經(jīng)證實人參皂苷Rh2誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，3甲基腺嘌呤（3MA）通過抑制ClassⅢ PI3K 的活性抑制自噬，抑制細(xì)胞自噬可以削弱人參皂苷Rh2對K562的抑制增殖和促凋亡作用[10]。為了研究人參皂苷Rh2誘導(dǎo)細(xì)胞自噬凋亡的可能機(jī)制，作者運(yùn)用了Western blot檢測MAPK信號通路的關(guān)鍵的蛋白p38，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2分別能夠激活p38，發(fā)生磷酸化激活。證明了參皂苷Rh2可能能通過激活磷酸化p38調(diào)控K562細(xì)胞自噬凋亡。

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[責(zé)任編輯張寧寧]