張 婷,李夢瑤,姜雅琦,田 杰,郭東生,甘方良

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院臨床藥理機(jī)構(gòu)辦公室)

復(fù)方磺胺甲噁唑?yàn)榛前芳讎f唑與甲氧芐啶組成的復(fù)方制劑,是一種磺胺類抗菌藥物?；前芳讎f唑(SMZ)通過競爭對氨基苯甲酸而抑制二氫葉酸的合成,甲氧芐啶通過與二氫葉酸還原酶結(jié)合,可逆性的抑制二氫葉酸還原為四氫葉酸。因此,磺胺甲噁唑和甲氧芐啶阻斷了細(xì)菌所必需的核酸和蛋白質(zhì)生物合成的兩個連續(xù)步驟[1]。該藥主要用于急性泌尿道感染、尿路感染、呼吸道感染、皮膚化膿性感染、扁桃體炎,肺炎鏈球菌或流感嗜血桿菌所致的2歲以上小兒急性中耳炎,成人慢性支氣管炎急性發(fā)作以及志賀氏菌病。根據(jù)國家《關(guān)于開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價的意見》[2],本研究以壽光富康制藥有限公司研制的復(fù)方磺胺甲噁唑片和Frontida BioPharm Inc.的原研對照藥(BACTRIM?)進(jìn)行人體生物等效性研究,以表明本品與原研藥品的療效和質(zhì)量一致,從而為該藥的上市臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品

復(fù)方磺胺甲噁唑片受試制劑T(壽光富康制藥有限公司,規(guī)格:磺胺甲噁唑0.4g/甲氧芐啶80mg,批號:15021004);復(fù)方磺胺甲噁唑片參比制劑R(Frontida BioPharm Inc.公司,規(guī)格:磺胺甲噁唑0.4g/甲氧芐啶80mg,批號:7005301)。

1.1.2 儀器

UPLC I-Class液相色譜儀(美國Waters);Xevo TQ-S質(zhì)譜儀(美國Waters);數(shù)據(jù)采集:UNIFI 數(shù)據(jù)處理軟件(美國Waters);XPE105電子天秤(瑞士METTLER TOLEDO);ST16、ST16R離心機(jī)(美國Thermo Fisher);ULTS1368醫(yī)用低溫保存箱(美國Thermo Fisher)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)對象及設(shè)計

空腹試驗(yàn)篩選66例受試者,入組24例健康志愿者,其中男18例,女6例;平均BMI為(22±2)kg/m2。所有受試者均通過體格檢查,并自愿簽署知情同意書。試驗(yàn)方案經(jīng)咸寧市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批件號:咸醫(yī)倫字-Y【2021】008號)。本試驗(yàn)采用單中心、隨機(jī)、開放、單劑量、兩制劑、兩周期、兩序列交叉設(shè)計,為空腹給藥人體生物等效性研究,洗脫期為7d。

1.2.2 給藥方法與血樣采集時間點(diǎn)設(shè)計

給藥當(dāng)天受試者按隨機(jī)方案單次口服磺胺甲噁唑0.4g/甲氧芐啶80mg T制劑或R制劑。240mL常溫水送服,給藥前及給藥后1h內(nèi)禁止飲水。在給藥前(0h)以及給藥后10、20、30、45min和1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、8、12、24、36、48h分別采集靜脈血約4mL;測量給藥前(0h)及給藥后1、6、12、24、48h生命體征,試驗(yàn)全程記錄不良事件。第2周期受試者重復(fù)第一周期過程,按隨機(jī)方案分別服用另一種制劑。

1.2.3 血漿樣本處理

①空白血漿樣品:取空白血漿50μL至96孔聚丙烯板,加入250μL乙腈,將板密封后在振蕩器上振蕩2min,4000rpm,離心15min。取上清液30μL轉(zhuǎn)移到另一個96孔聚丙烯板,加入1000μL稀釋劑混勻,將樣品轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣器中等待進(jìn)樣。②標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品:取標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品50μL轉(zhuǎn)移到96孔聚丙烯板,加入250μL內(nèi)標(biāo)工作液YYMMDD-MIX-IS,將板密封后在振蕩器上振蕩2min,4000rpm,離心15min。取上清液30μL轉(zhuǎn)移到另一個96孔聚丙烯板,加入1000μL稀釋劑混勻,將樣品轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣器中等待進(jìn)樣。③零濃度血漿樣品:取空白血漿50μL至96孔聚丙烯板,加入250μL內(nèi)標(biāo)工作液YYMMDD-MIX-IS,將板密封后在振蕩器上振蕩2min,4000rpm,,離心15min。取上清30μL轉(zhuǎn)移到另一個96孔聚丙烯板,加入1000μL稀釋劑混勻,將樣品轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣器中等待進(jìn)樣。

1.2.4 色譜條件和質(zhì)譜條件

①色譜條件:色譜柱,Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm(2.1×50mm);流動相A:2mL乙酸銨水溶液;流動相B:乙腈;梯度走樣,0～0.6min流動相A∶B=85%∶15%;1.2～1.6min流動相A∶B=10%∶90%;2.0min流動相A∶B=85%∶15%;流速:0.35mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:1μL。②質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI);正離子模式;離子源溫度:150℃;用于定量分析的離子反應(yīng)分別為:磺胺甲噁唑(SMX):SMXm/z 254.10→108.04;內(nèi)標(biāo)磺胺甲噁唑-d4(SMX-d4):m/z 258.06→112.15;甲氧芐啶(TMP):m/z 291.14→230.05;內(nèi)標(biāo)甲氧芐啶-d3(TMP-d3)m/z 294.19→230.04;碰撞能量:SMX 18.0 V,SMX-d4 24.0 V,TMP 22.0 V,TMP-d3 22.0 V。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低定量限(LLOQ)

以待測物與內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)比值(Y)為縱坐標(biāo),以系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品濃度(X)為橫坐標(biāo),以加權(quán)(1/x2)最小二乘法回歸運(yùn)算得磺胺甲噁唑標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.144X+0.00268,r2=0.999143;甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=6.77X+0.00881,r2=0.999216。其中磺胺甲噁唑的LLOQ為0.250μg/mL,線性范圍在0.250～50.000μg/mL;甲氧芐啶的LLOQ為0.010μg/mL,線性范圍在0.010～2.000μg/mL。

1.2.6 選擇性與特異性

使用6個不同來源的正常空白血漿,1個來源的高脂空白血漿和1個來源的溶血空白血漿制備空白血漿樣品及使用6個不同來源的正?？瞻籽獫{配制的定量下限血漿樣品考察選擇性。每種樣品平行1份。其典型SRM色譜圖見圖1,結(jié)果磺胺甲噁唑、甲氧芐啶和內(nèi)標(biāo)磺胺甲噁唑-d4、甲氧芐啶-d3的保留時間分別為0.99、1.32、0.98和1.31min。結(jié)果符合接受標(biāo)準(zhǔn),表明本方法測試人血漿中磺胺甲噁唑和甲氧芐啶具有良好的選擇性,人空白血漿、高脂血漿和溶血血漿對測試無干擾[3-4]。

A.空白血漿樣品;B.最低定量下限樣品;C.零濃度樣品。

1.2.7 精密度、準(zhǔn)確度和回收率

考察濃度為LLOQ、LQC、LMQC、HMQC、HQC(磺胺甲噁唑0.250、0.750、6.250、18.750、37.500μg/mL和甲氧芐啶0.010、0.030、0.250、0.750、1.500μg/mL)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品各6份,按1.2.3中②所述方法處理,進(jìn)樣10μL到色譜/質(zhì)譜系統(tǒng)分析,代入相應(yīng)線性回歸方程計算各樣品濃度測定值,據(jù)此計算各個濃度水平的批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度與精密度。按回歸方程計算實(shí)測濃度和提取回收率。結(jié)果見表1,符合接受標(biāo)準(zhǔn),定量下限測得濃度的均值在標(biāo)示值的80%～120%,其它質(zhì)控濃度標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品測得濃度的均值在標(biāo)示值的85%～115%;批內(nèi)批間變異系數(shù)均小于15%,表明質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的批內(nèi)和批間的精密度和準(zhǔn)確度良好。

表1 血漿樣品批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度測定

1.2.8 樣品穩(wěn)定性

按照1.2.3中②所述方法配置磺胺甲噁唑和甲氧芐啶低、高濃度質(zhì)控樣品,考察血漿樣品分別在室溫下放置0、26、46h,在4℃放置39d,10℃放置48h,-20℃放置30d,-70℃凍融4次的穩(wěn)定性,測得濃度值的變異系數(shù)均小于15%,表明穩(wěn)定性良好。

1.2.9 基質(zhì)效應(yīng)

采用8個來源的空白血漿(6個不同來源的正?？瞻籽獫{、1個來源的溶血空白血漿、1個來源的高脂空白血漿)不加內(nèi)標(biāo)進(jìn)行處理以獲取空白血漿上清液。取質(zhì)控工作溶液(SLQC、SHQC)分別用8個來源的空白血漿上清液配制樣品。磺胺甲噁唑濃度為LQC時,經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)為6.39%;磺胺甲噁唑濃度為HQC時,經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)為8.21%。甲氧芐啶濃度為LQC時,經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)為6.49%,甲氧芐啶濃度為HQC時,經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)為8.23%,表明無明顯正?？瞻籽獫{、溶血空白血漿、高脂空白血漿基質(zhì)效應(yīng),不影響定量分析。

1.2.10 安全性評價方法

基于安全集,按實(shí)際給藥情況進(jìn)行安全性分析。對以下內(nèi)容進(jìn)行臨床安全性評估:①任何自發(fā)報告的和所有直接觀察到的不良事件、嚴(yán)重不良事件;②生命體征任何有臨床意義的改變(參考值范圍90mmHg≤收縮壓<140mmHg,60mmHg≤舒張壓<90mmHg,60次/分≤脈搏(靜息)≤100次/分;以研究醫(yī)生判斷為準(zhǔn));③試驗(yàn)期間體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查、心電圖檢查等有意義的臨床改變(以研究醫(yī)生判斷為準(zhǔn))。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

根據(jù)受試者的個體血藥濃度-實(shí)際采血結(jié)束時間點(diǎn)數(shù)據(jù),采用Phoenix WinNonlin 8.2(Pharsight Corporation,Sunnyvale,CA)軟件,以非房室模型法(NCA模塊)對磺胺甲噁唑和甲氧芐啶的藥動學(xué)參數(shù)(Cmax、AUC0-t和AUC0-∞)等進(jìn)行計算。

2 結(jié) 果

2.1 血藥濃度-時間曲線和藥動學(xué)參數(shù)

受試者單次口服T制劑和R制劑的血藥濃度-時間曲線見圖2?？诜o藥后1～4h各成分的血藥濃度達(dá)到峰值,平均血清半衰期分別為10h和8～10h。藥動學(xué)參數(shù)計算結(jié)果見表2?；前芳讎f唑T制劑和R制劑的Cmax分別為(27.340±3.400)和(28.042±3.527)μg/mL;甲氧芐啶T制劑和R制劑的Cmax分別為(0.845±0.198)μg/mL和(0.838±0.144)μg/mL(P均>0.05)。

表2 空腹受試者和餐后受試者體內(nèi)磺胺甲噁唑和甲氧芐啶的主要藥動學(xué)參數(shù)

圖2 健康受試者空腹口服受試制劑T和參比制劑R

2.2 生物等效性評價

本試驗(yàn)中,針對磺胺甲噁唑,受試制劑與參比制劑Cmax、AUC0-t和AUC0-∞藥動學(xué)參數(shù)最小二乘幾何均值比的90%置信區(qū)間分別為94.41%～100.19%、98.70%～102.46%和98.52%～102.41%;針對甲氧芐啶,受試制劑與參比制劑Cmax、AUC0-t和AUC0-∞藥動學(xué)參數(shù)最小二乘幾何均值比的90%置信區(qū)間分別為92.69%～108.36%、100.97%～106.91%和100.86%～106.48%;均落在80.00%～125.00%判定范圍內(nèi),表明空腹條件下,兩制劑在吸收速度和吸收程度上均生物等效。結(jié)果見表3。

表3 受試者口服受試制劑T和參比制劑R生物等效性分析

2.3 安全性評價

本試驗(yàn)整個過程中兩組均無嚴(yán)重或?qū)е旅撀涞牟涣际录?安全性良好。受試制劑組:在進(jìn)入PKPS的24例受試者中,最終完成兩周期試驗(yàn)有23例。在服藥的23例受試者中,4例受試者共發(fā)生10例次不良事件,轉(zhuǎn)歸為5例次無改變、4例次痊愈和1例次未知,不良事件發(fā)生率為17.4%,不良事件嚴(yán)重程度均為1級。參比制劑組:在服藥的24例受試者中,5例受試者共發(fā)生8例次不良事件,轉(zhuǎn)歸為3例次緩解和5例次痊愈,不良事件發(fā)生率為20.8%。2例次不良事件嚴(yán)重程度為2級,其余6例次不良事件嚴(yán)重程度均為1級。

3 討 論

本試驗(yàn)研究設(shè)計計算得空腹正式試驗(yàn)所需的最終受試者例數(shù)為20例。另考慮約20%的脫落率,空腹正式試驗(yàn)所需的最終受試者例數(shù)確定24例。本試驗(yàn)受試制劑和參比制劑中SMX和TMP幾何均值比的90%CI均落在80.00%～125.00%,表明復(fù)方磺胺甲噁唑片受試制劑和參比制劑具有生物等效性。

SMZ和TMP在口服給藥后1～4h各成分的血藥濃度達(dá)到峰值,本試驗(yàn)0～4h內(nèi)共采血11次,平均血清半衰期分別為10h和8～10h,給藥24h后血液中可檢出SMZ和TMP,給藥3d后達(dá)到穩(wěn)態(tài)狀態(tài),SMZ和TMP均為CYP3A4的底物,根據(jù)人體生物等效性指導(dǎo)原則,考慮代謝酶的影響,在保證藥物代謝完全的基礎(chǔ)下,清洗期選取7d。

本試驗(yàn)受試制劑組和參比制劑組不良反應(yīng)發(fā)生率分別為4.3%、8.3%,1例不良反應(yīng)嚴(yán)重程度為2級,其余均為1級。據(jù)文獻(xiàn)報道[5-7],SMZ和TMP在體內(nèi)代謝受諸多因素的影響,例如機(jī)體因素、肝功能障礙、飲食因素、遺傳因素等,不良反應(yīng)較多,變異較大。本次試驗(yàn)中SMX和TMP的AUC個體間變異最大值分別為3.81%和5.35%。對于長期用藥的病人其代謝產(chǎn)物排泄較慢,已經(jīng)超過體內(nèi)藥物積蓄,為了減少不良事件的發(fā)生,建議臨床用藥時加強(qiáng)藥物監(jiān)測,注意用藥的合理性與安全性[8]。