樓江濤 彭一一 王春曉 許梅萍 余新平

作者單位：1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 省部共建眼視光學(xué)和視覺科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325027；2中山大學(xué)中山眼科中心 眼科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省眼科視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510060 （彭一一，現(xiàn)工作于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院 武漢市婦幼保健院；王春曉，現(xiàn)工作于洛陽市第三人民醫(yī)院）

斜視發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，近年研究表明眼外肌的異?？赡軈⑴c了斜視的發(fā)生和發(fā)展，如斜視患者存在眼外肌附著點(diǎn)異常，Pulley結(jié)構(gòu)的異常等改變。斜視矯正手術(shù)時(shí)獲取的眼外肌病理研究發(fā)現(xiàn)眼外肌存在肌肉萎縮、肌纖維減少而間質(zhì)增多，膠原纖維組織增生[1]的情況；電子顯微鏡下還發(fā)現(xiàn)眼外肌的線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常[2]。也有研究發(fā)現(xiàn)斜視患者的活化衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量存在異常[3]。

然而，既往研究混雜了不同年齡段患者的眼外肌，動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)出生后早期的眼外肌存在一個涉及肌肉形態(tài)的發(fā)育[4]、神經(jīng)的發(fā)育完善[5]和肌球蛋白重鏈的構(gòu)成重整[6]等復(fù)雜發(fā)育過程。但這些研究未明確探究幼年至青春期的眼外肌特點(diǎn)；且眼外肌的分層不夠詳細(xì)（眼外肌的眶層可進(jìn)一步分成內(nèi)、外2 層[7]）；同時(shí)這些研究主要以大/小鼠為研究對象，由于其眼外肌較小，限制了其在斜視研究領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用，如眼外肌手術(shù)相關(guān)的研究。相較之下，兔眼外肌能彌補(bǔ)以上不足。

斜視手術(shù)治療的主要實(shí)施對象為幼年和青春期階段的人群，目前對該時(shí)期眼外肌的發(fā)育特點(diǎn)，尤其是衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量等情況尚不明確。因此本研究擬以幼年和青春期的新西蘭大白兔為研究對象，探究不同發(fā)育階段的兔眼外肌的組織學(xué)是否存在不同。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

分別選取2周齡、4周齡、3月齡新西蘭大白兔各4只作為2周齡、4周齡組和3月齡組，雌雄不限。兔子購自杭州余杭科聯(lián)兔業(yè)專業(yè)合作社，于16～20 ℃、50%濕度環(huán)境下，使用兔專用飼料飼養(yǎng)，自由進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（wydw2021-0309）。

1.2 眼外肌的獲取及切片制備

對兔子予以過量麻醉（賽拉嗪，20 mg/kg）安樂死，頸動脈放血后，取完整長度的右眼上直肌，0.9%氯化鈉溶液沖洗，組織固定液中固定24 h。

眼外肌常規(guī)脫水，石蠟包埋，沿垂直肌纖維走行方向連續(xù)切片（2 μm），取6 張中腹部的切片，1張用于HE染色，剩余5張用于免疫組織化學(xué)染色。

1.3 試劑

MyHC1（fast-2X亞型）、MyHC14（slow-tonic亞型）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；MyHC3（emb亞型）購自英國Abcam公司；MyHC8（neo亞型）購自美國Bio-Techne公司；MyoD購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.4 蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-eosin staining，HE 染色）

將切片脫蠟至水；蘇木素染色（蘇木素染色5 min，鹽酸水溶液分化2 s，氨水水溶液返藍(lán)15～30 s，水洗）；伊紅染色（95%乙醇脫水，伊紅染液染色5～8 s）；切片脫水，中性樹膠封片。切片掃描。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

切片脫蠟至水；置于檸檬酸抗原修復(fù)液（pH=6.0）中，于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)；加入3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；加入封閉血清；加入一抗（一抗?jié)舛龋篗yHC1—1:3 000，MyHC3—1:300，MyHC8—1:200，MyHC14—1:2 000，MyoD—1:200），4℃孵育過夜；加入二抗；DAB顯色；復(fù)染細(xì)胞核；脫水封片。切片掃描。DAB顯色后細(xì)胞呈現(xiàn)棕色表示陽性。

1.6 研究指標(biāo)

1.6.1 肌纖維平均橫截面積 每張切片隨機(jī)選擇至少2個包含眶、球?qū)拥母弑兑曇?，用圖像處理軟件Image J分析肌纖維的橫截面積。

1.6.2 肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain, MyHC）表達(dá)情況 MyHC根據(jù)出現(xiàn)表達(dá)的先后順序大體上可分成未成熟亞型（emb亞型、neo亞型）和成熟亞型（如fast、slow亞型，eom-specific亞型等）。研究認(rèn)為MyHC的構(gòu)成決定了肌肉的收縮性質(zhì)和抗疲勞特性[8]。本研究為探究MyHC表達(dá)隨年齡的改變，選取了emb和neo 2種未成熟亞型以及快纖維亞型（fast-2X）和慢纖維亞型（slow-tonic）4種代表性亞型進(jìn)行研究。每張切片隨機(jī)選擇至少2 個高倍視野，計(jì)算表達(dá)各MyHC的肌纖維占視野內(nèi)總肌纖維的比例。

1.6.3 活化衛(wèi)星細(xì)胞的比例 每張切片隨機(jī)選擇至少2個高倍視野，計(jì)算MyoD+細(xì)胞核數(shù)量與視野內(nèi)肌纖維數(shù)量的比值作為計(jì)數(shù)活化衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量的指標(biāo)[9]。

在分析MyHC的構(gòu)成及活化衛(wèi)星細(xì)胞比例時(shí)，本研究參考Lucas的實(shí)驗(yàn)方法[7]，將眶層進(jìn)一步分為外眶層和內(nèi)眶層。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)研究。應(yīng)用SPSS 26.0或GraphPad Prism 8.4.3進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。對于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)（經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，P≥0.05），以±s表示；非正態(tài)分布則以M（QR）表示。符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)則采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)，用Bonferroni法進(jìn)行事后檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)改變

2 周齡時(shí)，內(nèi)、外眶層之間沒有明顯的界限，肌束形態(tài)不夠明顯。隨著年齡的增加，內(nèi)、外眶層與球?qū)又g的界限逐漸清晰。其中，外眶層的延續(xù)性一直較好，而內(nèi)眶層和球?qū)觿t逐漸形成由肌外膜包裹的肌束（圖1）。肌纖維的平均橫截面積隨年齡的增加而增加，2周齡組、4周齡組、3月齡組分別為118.50（100.55）、151.54（190.32）、207.56（282.96） μm2（P＜0.001）。

圖1.兔眼外肌的組織形態(tài)改變Figure 1.Morphological changes of extraocular muscles in rabbits

2.2 MyHC表達(dá)的變化

MyHC1 主要在內(nèi)眶層和球?qū)颖磉_(dá)，在外眶層表達(dá)較少（圖2A-C），但其在內(nèi)眶層（P=0.250）和球?qū)樱≒=0.340）的表達(dá)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在外眶層的表達(dá)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。采用Bonferroni法校正顯著性水平的事后檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2周齡組的表達(dá)水平較4 周齡組（P=0.011）和3 月齡組（P＜0.001）的表達(dá)水平低。4周齡組和3月齡組的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1.發(fā)育期兔眼外肌的MyHC的表達(dá)情況Table 1.The expression of MyHC in developing rabbits' extraocular muscles

圖2.兔眼外肌中MyHC1、MyHC14表達(dá)的變化Figure 2.Changes of the expression of MyHC1, MyHC14 of extraocular muscles in rabbits

圖3.兔眼外肌中MyHC3、MyHC8表達(dá)的變化Figure 3.Changes of the expression of MyHC3, MyHC8 of extraocular muscles in rabbits

圖4.3月齡組兔眼外肌中典型的活化衛(wèi)星細(xì)胞Figure 4.Typical activated satellite cells in extraocular muscle in 3-month-old group of rabbits

MyHC14 主要在球?qū)永w維中表達(dá)，且相較MyHC1、MyHC3、MyHC8為弱表達(dá)，而眶層纖維幾乎沒有表達(dá)。其在3組眼外肌的球?qū)拥谋磉_(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.147），見圖2D-F和表1。

MyHC3 在外眶層的所有纖維中均有表達(dá)，在內(nèi)眶層和球?qū)拥牟糠掷w維中表達(dá)（圖3A-C）。

MyHC3 在內(nèi)眶層和球?qū)拥谋磉_(dá)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。在內(nèi)眶層，2 周齡組（P＜0.001）與4 周齡組（P=0.040）的表達(dá)水平較3月齡組高。2 周齡組和4 周齡組之間的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.101）。在球?qū)?，同樣?周齡組與4 周齡組的表達(dá)水平均較3 月齡組高（均P＜0.001），而2 周齡組與4 周齡組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.054）。見表1。

MyHC8 在3 組兔眼外肌的所有肌纖維中均有表達(dá)，不隨年齡的增長而改變（圖3D-F）。

2.3 活化衛(wèi)星細(xì)胞比例的變化

圖4 顯示眶層的活化衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量多于球?qū)印?周齡組外眶層、內(nèi)眶層和球?qū)拥幕罨l(wèi)星細(xì)胞比例分別為2%（3%）、0%（1%）、0%（0%）；4周齡組分別為4%（5%）、1%（9%）、0%（1%）；3月齡組分別為20%（13%）13%（16%）、13%（5%）。內(nèi)、外眶層和球?qū)拥幕罨l(wèi)星細(xì)胞比例組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。在校正顯著性水平之前，均表現(xiàn)為2周齡組與4周齡組的數(shù)量低于3月齡組（均P＜0.05）。只有4 周齡組和3 月齡組的內(nèi)眶層的活化衛(wèi)星細(xì)胞比例在用Bonferroni法校正顯著性水平后，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.065）。

3 討論

斜視在人群中的患病率為3%～6%，是常見的眼科疾病。目前斜視的發(fā)病機(jī)制尚不明確，認(rèn)為與融合機(jī)制、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、屈光與調(diào)節(jié)及眼外肌等的異常有關(guān)。眼外肌作為特殊的骨骼肌，在形態(tài)上可以分為內(nèi)、外眶層和球?qū)覽7]；同時(shí)有MyHC構(gòu)成復(fù)雜[8]，終身存在活化衛(wèi)星細(xì)胞[10]等特點(diǎn)。

MyHC是肌球蛋白的主要組成成分，其構(gòu)成主要決定了肌纖維的收縮特性，對眼外肌完成精確的眼位調(diào)控具有重要意義[8]。衛(wèi)星細(xì)胞是肌肉組織的干細(xì)胞，是眼外肌再生修復(fù)的主要細(xì)胞來源。與肢體骨骼肌不同，即使在正常生理狀態(tài)下，眼外肌也存在活化衛(wèi)星細(xì)胞[9]。二者能較好地體現(xiàn)眼外肌的功能特點(diǎn)和修復(fù)能力。既往對發(fā)育期個體眼外肌的變化特點(diǎn)尚不明確，限制了我們對斜視發(fā)病及治療后變化的機(jī)制探索。

本研究發(fā)現(xiàn)處于發(fā)育期的2周齡至3月齡兔眼外肌存在組織學(xué)上的差異。隨著年齡增長，眼外肌形態(tài)逐步發(fā)育完善、肌纖維增粗，內(nèi)、外眶層和球?qū)又g的界限愈發(fā)明顯；未成熟亞型MyHC（MyHC3）表達(dá)減少，成熟亞型MyHC（MyHC1）表達(dá)增加；并伴有活化衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量的持續(xù)增加。理清發(fā)育期個體的眼外肌組織學(xué)特點(diǎn)將為更深入地探究斜視的發(fā)病機(jī)制打下基礎(chǔ)，也能為臨床斜視手術(shù)干預(yù)時(shí)機(jī)的選擇提供新的思路。

3.1 MyHC構(gòu)成隨發(fā)育變化的特點(diǎn)

本研究發(fā)現(xiàn)MyHC構(gòu)成在發(fā)育期兔的眼外肌內(nèi)、外眶層和球?qū)哟嬖谧兓悍从砮mb未成熟亞型的MyHC3在內(nèi)眶層和球?qū)拥谋磉_(dá)逐漸減少，反映fast-2X成熟亞型的MyHC1在外眶層的表達(dá)逐漸增加；而反映neo亞型的MyHC8 和slow-tonic成熟亞型的MyHC14則沒有顯著改變。這種變化可能是對眼外肌精細(xì)運(yùn)動功能的適應(yīng)性改變[8]。

以往研究比較幼年和成年等階段大、小鼠，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加，未成熟亞型（MyHC3 和MyHC8）的表達(dá)減少[11]，而成熟亞型（如fast、slow等亞型）的表達(dá)增加[12]。但這些研究均未考慮青春期這一特殊階段。在年齡選擇上，本研究著眼于幼年期和青春期的兔子，更符合臨床上斜視手術(shù)的受眾群體的年齡分布。同時(shí)，本研究根據(jù)前人經(jīng)驗(yàn)[7]，將眼外肌的眶層進(jìn)一步分成內(nèi)、外眶層，這種更精細(xì)的分層一方面細(xì)化了MyHC的發(fā)育特點(diǎn)，另一方面也為更精準(zhǔn)地探究眼外肌運(yùn)動的調(diào)控機(jī)制做了鋪墊。

本研究中，MyHC8（neo亞型）表達(dá)穩(wěn)定，并未隨MyHC3（emb亞型）表達(dá)減少。這可能是同Zhou等[11]針對小鼠的研究類似，即neo亞型表達(dá)的減少要較emb亞型晚。既往基于大鼠的研究[13]發(fā)現(xiàn)，MyHC14（slow-tonic亞型）在出生前為高水平表達(dá)；出生2周后，表達(dá)水平下降，最終僅在少數(shù)纖維中分散表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，slow-tonic亞型也在球?qū)永w維中分散表達(dá)，但不隨發(fā)育改變，說明在兔眼外肌中，該亞型的發(fā)育性改變可能出現(xiàn)在出生后2周內(nèi)或3個月之后。

MyHC的表達(dá)受復(fù)雜機(jī)制的調(diào)控，目前認(rèn)為，可能和遺傳因素[14]、神經(jīng)支配[15]、機(jī)械刺激[12]、激素水平[16]（如性激素、甲狀腺激素）等因素相關(guān)。在未來研究中，同期探究其神經(jīng)發(fā)育改變及激素水平變化將有利于增進(jìn)對MyHC不同亞型表達(dá)的調(diào)控機(jī)制的理解。

3.2 活化衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量隨發(fā)育的變化特點(diǎn)

通常認(rèn)為Pax7 是衛(wèi)星細(xì)胞的特異性標(biāo)記，活化的衛(wèi)星細(xì)胞則特異性地表達(dá)MyoD[17]。目前少有研究探究眼外肌的活化衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量與年齡的關(guān)系，尤其與發(fā)育不同階段的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)活化衛(wèi)星細(xì)胞在發(fā)育期兔的眼外肌中隨著年齡的增長而增多。

Formicola等[18]探究了成年和老年小鼠眼外肌的衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)老年小鼠的衛(wèi)星細(xì)胞少于成年小鼠。本研究以幼年（2周齡）至性成熟期（3月齡）的新西蘭大白兔眼外肌為研究對象，發(fā)現(xiàn)2周齡和4周齡兔眼外肌的活化衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量沒有差異，且數(shù)量極少（0～1%）。3月齡時(shí)，活化衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量顯著增加。3 月齡兔正處于性成熟期，對應(yīng)于人類的青春期[19]，該階段是發(fā)育成熟的一個重要時(shí)期，提示該階段個體的眼外肌組織修復(fù)能力可能更強(qiáng)。

此外，衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量受性激素水平[20]、甲狀腺激素水平[21]、胰島素樣生長因子-2表達(dá)量[22]等的影響，仍有待進(jìn)一步研究以上激素和生長因子是否參與了活化衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量的改變。同時(shí)，3月齡之后，活化衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量是仍舊保持高水平還是隨著發(fā)育成熟而進(jìn)一步發(fā)生改變，也需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。

3.3 視覺輸入在眼外肌發(fā)育過程中所起的作用

以往研究發(fā)現(xiàn)眼外肌的發(fā)育受視覺刺激的影響。一方面，眼瞼張開時(shí)機(jī)是促進(jìn)眼外肌發(fā)育的一個關(guān)鍵期[8,12,23-24]。不同類型的MyHC的表達(dá)量發(fā)生改變：成熟亞型MyHC（如fast ⅡA/ⅡX亞型）的表達(dá)只有在眼瞼張開后才出現(xiàn)[12]，未成熟亞型（如emb亞型）則在這個階段開始表達(dá)減少[23]；同時(shí)伴隨著α-輔肌動蛋白3、伴肌動蛋白的出現(xiàn)和表達(dá)增加[23]。此外，nm MyHC ⅡB的表達(dá)位置由肌膜下向球?qū)拥募±w維過渡[24]。另一方面，眼外肌的正常發(fā)育也需要正常的視覺刺激。暗室飼養(yǎng)會引起涉及能量代謝、蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)代謝、肌肉相關(guān)等基因的改變[25]。同時(shí)暗室飼養(yǎng)導(dǎo)致大鼠眼外肌的fast/slow亞型MyHC的表達(dá)下降[26]；單眼視覺信息剝奪導(dǎo)致眼外肌肌纖維構(gòu)成的改變[27]，滑車神經(jīng)變細(xì)[28]。此外，MyHC的表達(dá)也受前庭-眼反射的調(diào)控[27]?？梢姰惓５囊曈X經(jīng)驗(yàn)可能會直接擾亂眼外肌的正常發(fā)育，從而誘發(fā)斜視的發(fā)生。而斜視所致的異常視覺經(jīng)驗(yàn)對眼外肌發(fā)育的影響也值得進(jìn)一步探討。

新西蘭大白兔一般在2 周齡左右張開眼瞼[29]，本研究結(jié)果表明新西蘭大白兔在睜眼后至成年前的快速發(fā)育階段，眼外肌的各生物學(xué)特性也存在發(fā)育性改變，提示幼年至青春期可能是眼外肌發(fā)育成熟的一個重要時(shí)期。當(dāng)然，本研究尚存在諸多不足。首先，本研究未納入眼瞼張開前及成年后兔眼外肌的特點(diǎn)，在未來實(shí)驗(yàn)中納入發(fā)育前期（眼瞼張開前，如剛出生或1周齡）和成年兔（6月齡～1歲齡）及其他年齡段兔為研究對象，將進(jìn)一步明確各發(fā)育階段眼外肌的特點(diǎn)。其次，本研究是建立在動物實(shí)驗(yàn)上，因此所得結(jié)論可能不能完全照搬至人類；但這為人類的相關(guān)研究打下了基礎(chǔ)。

綜上，發(fā)育期兔的眼外肌也存在發(fā)育性改變，無論是肌肉的組織形態(tài)還是MyHC的構(gòu)成及活化衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量均發(fā)生了顯著變化。本研究結(jié)果為斜視發(fā)病機(jī)制的探究提供了一定思路。同時(shí)，在未來實(shí)驗(yàn)中，可以兔眼外肌為模型，探究不同發(fā)育階段的眼外肌的手術(shù)效果，為臨床斜視手術(shù)干預(yù)時(shí)機(jī)提供更多參考。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明樓江濤：收集數(shù)據(jù)，參與選題、設(shè)計(jì)及資料的分析和解釋；撰寫論文；對編輯部的修改意見進(jìn)行修改。彭一一：收集數(shù)據(jù)，參與選題、設(shè)計(jì)。王春曉：收集數(shù)據(jù)。許梅萍、余新平：選題、 設(shè)計(jì)，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，對編輯部的修改意見進(jìn)行核修