王 璇, 張曉可, 李 婷, 趙 宇, 張 濤, 潘 永,王慶紅, 章厲劼, 潘淑惠, 金曉峰, 文正常*

（1. 貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550005；2. 貴州省獸藥飼料檢測(cè)所，貴州 貴陽(yáng) 550003）

禽白血病（Avian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（ALV）引起的禽類多種傳染性腫瘤疾病統(tǒng)稱，自然條件下以淋巴白血病最為常見(jiàn)［1-4］。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（Reticulo?endotheliosis，RE）是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）引起的雞、鴨等癥狀不同的綜合征，如免疫抑制、生長(zhǎng)抑制綜合征（矮小綜合征）、慢性淋巴腫瘤等［3，5-6］。雞白?。≒ullo?rum Disease，PD）是由雞白痢沙門菌（SP）引起的傳染性疾病，通常侵害雛雞，但青年雞的感染也有所增加，其典型癥狀為白痢，通常伴隨嚴(yán)重的急性敗血癥［5，7］。AL、RE 和PD 在雞群中非常普遍，不僅能水平傳播，還能垂直傳播，其中垂直傳播的風(fēng)險(xiǎn)最高。病毒通過(guò)遺傳學(xué)方式感染雞后垂直傳播至下一代，感染雞的數(shù)量會(huì)隨世代的更替而不斷增加，造成的損失也越來(lái)越嚴(yán)重。為了解黔東南小香雞種群AL、RE 和PD 的感染情況，對(duì)該雞群進(jìn)行上述3種疫病的血清學(xué)檢測(cè)，便于有效預(yù)防、凈化疫病，更好地保護(hù)黔東南小香雞的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試雞 試驗(yàn)雞群為貴州某種雞場(chǎng)籠養(yǎng)的2 000 余只296 日齡黔東南小香雞種群，采樣前已按既定免疫程序?qū)﹄u群進(jìn)行免疫，未采用任何AL、RE 和PD 疫苗免疫，且在雞群中未見(jiàn)該3種疫病的明顯發(fā)病癥狀。

1.1.2 試劑 禽白血病抗原檢測(cè)及禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒抗體檢測(cè)ELISA 試劑盒均購(gòu)于愛(ài)德士公司；雞白痢抗體（PD-Ab）試劑盒（ELISA）購(gòu)于睿信生物科技有限公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix（0.05 U/μL）DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)、GoldView I 型核酸染色劑等均購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 從雞群中隨機(jī)抽取524只雞，每只雞進(jìn)行翅靜脈無(wú)菌采血，將采集的全血37 ℃斜面靜置2 h，待血清析出后，將血清移至1.5 mL 無(wú)菌EP 管中，于?20 ℃保存待檢。

1.2.2 ALV-p27 抗原檢測(cè) 檢測(cè)使用禽白血病抗原檢測(cè)試劑盒。判定結(jié)果前先確定試驗(yàn)結(jié)果是否有效，當(dāng)試驗(yàn)成立時(shí)，按：

S/P＝（樣品OD650?陰性對(duì)照OD650平均值）/（陽(yáng)性對(duì)照OD650平均值?陰性對(duì)照OD650平均值）計(jì)算，若S/P≤0.20，判為ALV-p27 抗體陰性；若S/P＞0.20，判為ALV-p27抗體陽(yáng)性。

1.2.3 REV 抗體檢測(cè) 按照禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。判定結(jié)果前先確定試驗(yàn)結(jié)果是否有效，當(dāng)試驗(yàn)成立時(shí)，計(jì)算S/P，計(jì)算公式同1.2.2，若S/P≤0.50，判為REV 抗體陰性；若S/P＞0.50，判為REV抗體陽(yáng)性。

1.2.4 雞白痢抗體檢測(cè) 按照雞白痢抗體（PD-Ab）試劑盒（ELISA）試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。判定結(jié)果前先確定試驗(yàn)結(jié)果是否有效，當(dāng)試驗(yàn)成立時(shí)，計(jì)算Cut-Off值，閾值＝陰性對(duì)照OD 值＋0.25，若樣本OD 值大于閾值，判為SP抗體陽(yáng)性，反之，判為陰性。

1.2.5 ALV 的PCR 鑒定 參照參考文獻(xiàn)［8-10］合成禽白血病引物（表1），引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。抽取ALV-p27 抗原檢測(cè)陽(yáng)性雞只的血液樣本，按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA 為模板，用ALV-A、ALV-B、ALV-J引物進(jìn)行PCR鑒定。

表1 引物信息

1）ALV-A 與ALV-B 的PCR 反應(yīng)體系為25 μL：2×Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，滅菌去離子水8.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃3 min；94 ℃45 s，56 ℃45 s，72 ℃45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。

2）ALV-J 的PCR 反應(yīng)體系為50 μL：2×Taq PCR MasterMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA 模板2 μL，用雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

3）PCR 產(chǎn)物保存于4 ℃。產(chǎn)物檢測(cè)：在10 g/L 的瓊脂糖凝膠中加擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL，電流40～60 mA，電壓90 V，電泳25 min 左右，然后在凝膠成像儀下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 AL、RE和PD感染的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)雞群524 份血清進(jìn)行AL、RE 和PD 的單一感染和混合感染檢測(cè)，由表2 可知，檢測(cè)未見(jiàn)三重感染的情況；二重感染以AL+RE情況較為顯著，陽(yáng)性率達(dá)12.98%，AL+PD情況次之，陽(yáng)性率為1.34%，未見(jiàn)有RE+PD的二重感染情況；單一感染以AL 最為嚴(yán)重，陽(yáng)性率達(dá)85.88%，RE 感染次之，陽(yáng)性率為25.57%，PD感染較輕，陽(yáng)性率為3.82%。

表2 雞群AL、RE和PD單一感染和混合感染的檢測(cè)結(jié)果

2.2 ALV的PCR鑒定結(jié)果

用ALV-A、ALV-B、ALV-J 引物對(duì)ALV-p27 抗原檢測(cè)陽(yáng)性的450 份血液樣本DNA 進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果擴(kuò)增出192 份與ALV-J 大小相近的陽(yáng)性條帶（圖1），而未擴(kuò)增出與ALV-A、ALV-B 相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性條帶，經(jīng)測(cè)序比對(duì)為ALV-J 的核酸序列。結(jié)果表明，該場(chǎng)黔東南小香雞種群感染的是J 亞群禽白血病，ALV-J陽(yáng)性率為42.67%。

圖1 部分ALV-J的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

3 討論與結(jié)論

ALV 感染可分為內(nèi)源性和外源性兩種，前者通常會(huì)被遺傳到下一代，但不會(huì)形成感染型病毒顆粒，也無(wú)致病性；而后者會(huì)在雞的基因組中形成感染性的病毒顆粒，具有較強(qiáng)的致病性，并且可通過(guò)垂直或水平的方式傳播［11］。通過(guò)選用禽白血病p27 抗原ELISA試劑盒對(duì)黔東南小香雞種群開(kāi)展禽白血病抗原檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)樣品p27 抗原陽(yáng)性率為85.88%。由于ALV 衣殼蛋白p27 抗原為群特異性抗原，其檢測(cè)結(jié)果只表明雞體處于病毒感染狀態(tài)，但不排除內(nèi)源性ALV 存在感染干擾的可能。外源性禽ALV-A、B、J 亞群PCR 結(jié)果顯示，ALV-J 陽(yáng)性率42.67%，ALV-A 和ALV-B 亞群未檢出，表明黔東南小香雞種群外源性禽白血病感染主要為ALV-J亞群。鑒于目前尚無(wú)有效的疫苗和藥物防治AL 發(fā)生，建議盡早對(duì)種群采取凈化措施，以避免AL進(jìn)一步發(fā)生及流行。

AL、RE 和PD 都可通過(guò)遺傳學(xué)方式在感染雞之后垂直傳播到下一代，感染雞的數(shù)量會(huì)隨世代的更替而不斷增加，從而加劇危害。檢測(cè)結(jié)果顯示，未見(jiàn)RE+PD 的二重感染和三重感染情況，二重感染以AL+RE 情況較為顯著，陽(yáng)性率達(dá)12.98%。有研究資料顯示，AL 和RE 都會(huì)導(dǎo)致雞體致瘤及免疫系統(tǒng)的紊亂。ALV 與REV 能共同阻礙機(jī)體產(chǎn)生抗體，影響中樞免疫器官的發(fā)育，導(dǎo)致體重的升高，促進(jìn)腫瘤的形成，引起腫瘤譜的擴(kuò)展，以及更嚴(yán)峻的免疫抑制等［12］。為保障雞群的健康，建議定期監(jiān)測(cè)種雞場(chǎng)的該3 種疫病，在必要情況下及時(shí)淘汰陽(yáng)性雞只，有效防止疫病的垂直傳播，并增強(qiáng)雞群的抗病力，從而減少疫病的暴發(fā)。