韋明杰, 叢 健

(云南華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證有限公司，云南 昆明 650000)

藍(lán)莓（Blueberry）為被子植物門(mén)（Magno?liophyta），雙子葉植物綱（Magnoliopsida），杜鵑花目（Ericales），杜鵑花科（Ericaceae），越橘屬（Vaccinium）越橘亞屬V. （Vac?cinium）。原生于北美洲與東亞，現(xiàn)階段人工培育藍(lán)莓，果實(shí)較大，水分較多，但花青素含量相對(duì)偏低。藍(lán)莓是一種具有較強(qiáng)抗氧化性的水果［1］，對(duì)衰老、癌癥和心臟疾病能發(fā)揮其抗氧化作用；此外，藍(lán)莓具有緩解視疲勞、改善視力的功效，并能在一定程度上延緩腦神經(jīng)衰老，從而增強(qiáng)人體記憶力［2］。研究表明，藍(lán)莓多糖具有強(qiáng)抗氧化性、抗疲勞性、抑制有害菌生長(zhǎng)等多種生物活性的功效［3］，因而被應(yīng)用于各種營(yíng)養(yǎng)保健飲品中。目前國(guó)內(nèi)已有很多學(xué)者將藍(lán)莓多糖提取作為重點(diǎn)研究課題，研究方法多以浸提法為基礎(chǔ)，也有將纖維素酶法和超聲波輔助法從提取花色苷后的藍(lán)莓殘?jiān)刑崛《嗵牵?］的報(bào)道，但超聲輔助提取藍(lán)莓多糖的報(bào)道較少。為藍(lán)莓多糖在食品加工中的應(yīng)用提供參考，以經(jīng)高濃度乙醇脫脂的藍(lán)莓為原料，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取藍(lán)莓多糖的工藝，選定最優(yōu)的提取條件組合，以保障提取完全的同時(shí)，有效節(jié)約資源與成本。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮藍(lán)莓果：于昆明永輝超市海樂(lè)世界店購(gòu)買(mǎi)，采購(gòu)后至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行清洗、搗碎。

試劑：葡萄糖（AR，500 g/瓶）、苯酚（AR，500 mL/瓶）、無(wú)水乙醇（AR，500 mL/瓶，≥99.7%）、水楊酸，購(gòu)于凱諾商貿(mào)有限公司，天津大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；硫酸（AR，500 mL/瓶，95%～98%），購(gòu)于凱諾商貿(mào)有限公司，西隴化工股份有限公司生產(chǎn)；硫酸亞鐵：購(gòu)于天津科密歐試劑有限公司；DPPH（2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基），購(gòu)于安徽酷爾生物工程有限公司。

儀器：KQ-600VDE 超聲清洗機(jī)，昆山舒美超聲儀器有限公司；UV-2600 紫外分光光度計(jì)，日本島津公司Shimadzu；MS105DU電子天平，瑞士梅特勒公司；N-1300D-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會(huì)社北京代表處EYELA；TD5ZLD5-2B 臺(tái)式離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藍(lán)莓多糖的提取 取新鮮藍(lán)莓搗碎，用無(wú)水乙醇脫脂，將脫脂后的藍(lán)莓渣烘干研粉備用。稱(chēng)取25 g 脫脂藍(lán)莓，放置在加有純水的超聲清洗機(jī)中，利用超聲波震蕩輔助提取，反復(fù)提取3次。合并3 次的提取液，并濃縮到100 mL ，隨后使用95%乙醇調(diào)整至混合液含醇量約80%，4 ℃條件下醇沉，取出后離心，取沉淀物用少量純水進(jìn)一步溶解，將溶解物離心過(guò)濾，得上清液，濃縮并二次醇沉，醇沉后用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，最后得到藍(lán)莓粗多糖。

1.2.2 藍(lán)莓多糖含量檢測(cè) 將葡萄糖濃度（C）和檢測(cè)吸光度（A）分別作為X/Y 坐標(biāo)，引入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（A＝10.167C＋0.001 2，R2＝0.999 8）。將上述1.2.1 所得的多糖配制成固定濃度（1.0 mg/mL），依據(jù)文獻(xiàn)［3］的方法進(jìn)行檢測(cè)。將測(cè)出的吸光度值A(chǔ)帶入回歸方程，求多糖含量，以計(jì)算多糖提取率［5］。計(jì)算公式：

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1）料液比。固定提取條件為超聲功率60 W 、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間85 min，分析在液料比為1∶5（g/mL，下同）、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 下藍(lán)莓多糖提取率的變化。

2） 提取溫度。 固定料液比1∶25（g/mL）、超聲功率65 W 、提取時(shí)間90 min，分析在提取溫度為55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃時(shí)藍(lán)莓多糖提取率的變化。

3）提取時(shí)間。固定料液比1∶25、超聲功率60 W、提取溫度85 ℃時(shí)，分析提取時(shí)間為70 min、75 min、80 min、85 min、90 min 時(shí)藍(lán)莓多糖提取率的變化。

4） 提取功率。 固定料液比1∶25（g/mL）、提取時(shí)間85 min、提取溫度60 ℃，分析提取功率為55 W、60 W、65 W、70 W、75W時(shí)藍(lán)莓多糖提取率的變化。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上做響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，固定料液比1∶25（g/mL），以提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、超聲功率（C）為變量因子，設(shè)置3 個(gè)水平，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，其因素水平表見(jiàn)表1。

表1 超聲輔助提取藍(lán)莓多糖的響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Origin 2018 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響

從圖1可知，不同料液比、提取溫度、提取時(shí)間及超聲功率下，藍(lán)莓多糖提取率的變化。

圖1 不同料液比、提取溫度、提取時(shí)間及提取功率下的藍(lán)莓多糖提取率

2.1.1 料液比 料液比從1∶5（g/mL）增加至1∶25（g/mL），藍(lán)莓多糖提取率明顯提升，并在料液比為1∶25達(dá)到峰值，為9.47% ；料液比從1∶25 增加至1∶40（g/mL），隨料液比增大，藍(lán)莓多糖的提取率不再有顯著變化?？紤]到試劑的損耗和提取工作時(shí)長(zhǎng)，最優(yōu)選取料液比1∶25（g/mL）進(jìn)行提取操作。在后續(xù)的單因素試驗(yàn)時(shí)統(tǒng)一選取料液比1∶25（g/mL）進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1.2 提取溫度 藍(lán)莓多糖的提取率隨提取溫度的升高呈上升趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值，為10.15% 。繼續(xù)升高提取溫度至65 ℃時(shí)，藍(lán)莓多糖的提取率反而略有下降，但總體趨于平穩(wěn)，考慮能耗和升溫時(shí)長(zhǎng)等因素，提取溫度以60 ℃為宜。

2.1.3 提取時(shí)間 提取時(shí)間75～85 min時(shí)，藍(lán)莓多糖的提取率明顯提升，并在提取85 min 時(shí)達(dá)到最大值，為10.46%。但在提取時(shí)間超過(guò)85 min時(shí)，多糖提取率不再提升，長(zhǎng)時(shí)間提取會(huì)造成時(shí)間浪費(fèi)，于工藝優(yōu)化不利。因此，最佳提取時(shí)間選擇85 min。

2.1.4 超聲功率 超聲功率由55 W上升至75 W，藍(lán)莓多糖的提取率隨超聲功率增大而呈上升趨勢(shì)，在提取功率60 W 時(shí)達(dá)最大值，為10.52% 。但超聲功率超過(guò)60 W，藍(lán)莓多糖的提取率會(huì)下降，當(dāng)功率超過(guò)70 W 后，提取率降低明顯。因此藍(lán)莓多糖提取的最適宜超聲功率為60 W。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化藍(lán)莓多糖的提取工藝

2.2.1 回歸模型的建立與顯著性分析 從表2可知不同處理的藍(lán)莓多糖提取率。對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析得線性回歸方程模型為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)各處理參數(shù)及其藍(lán)莓多糖提取率

Y＝10.58+0.20A+0.095B+0.13C－0.040AB+0.17AC－0.025BC－0.25A2－0.14B2－0.53C2

從表3 可知，回歸模型F＝37.86，模型P＜0.000 1，回歸方程極顯著，失擬項(xiàng)F＝0.873 3（F＞0.05）不顯著，判定該回歸方程是可信的，具備預(yù)測(cè)試驗(yàn)真實(shí)性的能力。模型擬合度為97.99%，可信度超過(guò)90%，綜上數(shù)據(jù)可知，該模型用于預(yù)估藍(lán)莓多糖提取率具有可行性。單因素溫度的P＜0.01，極為顯著；F值排序FA＝46.43＞FC＝20.11＞FB＝10.74，因此，各因素對(duì)藍(lán)莓提取率的影響依次為A＞C＞B。

表3 響應(yīng)面回歸方程方差及顯著性分析

2.2.2 不同因素的交互作用 由圖2 可看出，提取時(shí)間與提取溫度交互作用時(shí)，在提取功率60 W 不變時(shí)，藍(lán)莓多糖提取率在提取溫度升高的條件下隨之增大，在提取溫度60 ℃、提取時(shí)間85 min，響應(yīng)面圖出現(xiàn)一個(gè)最高點(diǎn)，即藍(lán)莓多糖提取率達(dá)到最大值，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。在提取時(shí)間85 min 不變的條件下，藍(lán)莓多糖提取率隨提取溫度和提取功率增大而提高，在功率達(dá)60 W 時(shí)，提取溫度在60 ℃等高線上出現(xiàn)極值點(diǎn)，即藍(lán)莓多糖提取率的最大值。60 ℃提取溫度基礎(chǔ)上繼續(xù)升高提取溫度，藍(lán)莓多糖提取率略顯下降，但同一條件下增大提取功率，藍(lán)莓多糖提取率卻呈明顯下降趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度恒定為60 ℃，提取功率與提取時(shí)間的交互作用下，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)莓多糖提取率增高，但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)85 min 后，藍(lán)莓多糖提取率無(wú)顯著的變化，和單因素試驗(yàn)結(jié)果相符，表明提取時(shí)間80 min 后延長(zhǎng)提取，對(duì)藍(lán)莓多糖提取率提升影響不明顯，同響應(yīng)面方差分析結(jié)果一致。但藍(lán)莓多糖提取率會(huì)隨著提取超聲功率增大而提高，當(dāng)超聲功率達(dá)60 W 時(shí)，出現(xiàn)峰值，隨后增大超聲功率，藍(lán)莓多糖提取率反而明顯降低。通過(guò)以上分析可知，在料液比1∶25（g/mL）的條件下，提取溫度、時(shí)間、功率中某兩個(gè)單因素不改變，提取溫度對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響是最大的，其次是提取功率，而提取時(shí)間達(dá)到一定時(shí)間后，對(duì)藍(lán)莓多糖提取率影響甚微，方差分析結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)論，進(jìn)而證明所建模型的可靠性。

圖2 不同因素交互作用的響應(yīng)面

2.2.3 最佳提取條件的確定 驗(yàn)證響應(yīng)面回歸方程，求一次偏導(dǎo)。聯(lián)立方程，可解出理論最優(yōu)參數(shù)，結(jié)合試驗(yàn)情況，將參數(shù)調(diào)整為整值，得到藍(lán)莓多糖優(yōu)化提取工藝參數(shù)為提取溫度60 ℃、超聲功率60 W、提取時(shí)間85 min。經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)，藍(lán)莓多糖平均提取率為10.61%，將該理論參數(shù)代入模型，計(jì)算出提取率理論值為10.58%。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)超聲輔助提取藍(lán)莓多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，超聲輔助提取藍(lán)莓多糖的最佳工藝為料液比1∶25（g/mL），提取溫度60 ℃、超聲功率60 W、提取時(shí)間85 min。該工藝條件下，藍(lán)莓多糖的平均提取率實(shí)際值為10.61%，與響應(yīng)面模型計(jì)算出的提取率理論值為10.58%進(jìn)行對(duì)比，相差較小，表明建立的回歸模型可靠，適用于藍(lán)莓多糖的優(yōu)化提取。