孫建宇，郭 華，張云云，崔小川

南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院全科醫(yī)學科，江蘇 無錫 214023

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是動脈粥樣硬化性疾病的獨立危險因素，在動脈粥樣硬化性心臟病患者中的發(fā)生率高達40%～80%［1］。慢性間歇性缺氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）是OSAHS重要的病理生理學特征［2］，引起血液循環(huán)中氧合水平出現(xiàn)周期性變化，引發(fā)脂質代謝紊亂、氧化應激和免疫炎癥改變，并通過其相互作用，最終導致動脈粥樣硬化的發(fā)生。

動脈粥樣硬化的起始改變是內皮損傷和功能障礙，隨后受損組織分泌一系列促血管生成因子趨化成血管細胞至損傷部位修復內皮損傷以及形成新生血管［3］。血管生成性T 淋巴細胞（angiogenic T lymphocyte，Tang）是T 淋巴細胞亞群之一，也是一類成血管細胞，其主要細胞表面標志物包括CD3、CD31、CXCR4，通常被標記為CD3+CD31+T 淋巴細胞。研究表明，Tang 可通過分泌促血管生成因子白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）和粒細胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）促進內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）增殖、分化，參與損傷血管內皮修復或新生血管形成［4］。Weil 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，心腦血管疾病患者外周血中Tang 水平降低。迄今尚未有CIH 暴露下Tang 對早期動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展影響的相關性研究。

本研究擬通過建立CIH 大鼠動脈內皮損傷模型，觀察CIH暴露下大鼠血管病變及外周血Tang表達水平的變化，為進一步尋求OSAHS相關性動脈粥樣硬化性疾病的干預及治療策略提供線索。

1 材料和方法

1.1 材料

16 只成年雄性健康Sprague Dawley（SD）大鼠（體重210～230 g）購買于常州卡文斯實驗動物有限公司。實驗于南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院實驗動物中心進行。實驗過程嚴格按照《實驗動物的飼養(yǎng)和使用指南（第八版）》要求執(zhí)行。此實驗獲得南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院動物保護倫理委員會的批準（實驗倫理號：220214501）。

FITC 熒光Anti-CD3 抗體、FITC 熒光Anti-CD31抗體、FITC 熒光Anti-CD34 抗體（Santa Cruz 公司，美國），CD133 抗體（Abcam 公司，美國），F(xiàn)ITC 標記山羊抗兔IgG（Biosharp 公司，北京），高密度脂蛋 白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三酯（triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）酶聯(lián)免疫試劑盒（上海酶聯(lián)生物）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及CIH大鼠模型制備

16只SD大鼠標號稱重后隨機分為2組：正常飼養(yǎng)組（RA組）和間歇性缺氧組（IH組），每組8只。飼養(yǎng)條件為：每4只大鼠飼養(yǎng)在1個鼠籠中，大鼠可自由取食足夠的滅菌飼料及干凈飲用水，室溫保持在20～24 ℃，室內保持相對安靜，噪音小于50 dB，室內照明12 h 調整1 次，保持通風換氣。因自然界中大鼠習性為晝伏夜出，本實驗在大鼠白天睡眠時將IH 組大鼠放入CIH 倉（無錫市懷信生物公司）進行間歇性缺氧實驗8 h，其余時間則放回正常動物房內，與RA組大鼠在相同環(huán)境下飼養(yǎng)。每日上午8點將IH 組大鼠置于CIH 倉中，在電腦控制儀上將循環(huán)模式設置為：每2 min 1 個循環(huán)，40 s 內氧氣濃度降到8%之后穩(wěn)定20 s，然后氧氣濃度在40 s 內恢復到21%之后維持20 s。將CIH 倉內氧氣濃度維持在8%時，經大鼠耳朵測量其血氧飽和度，能夠降低至80%以下，可以模擬重度OSAHS 患者夜間呼吸暫停時的缺氧情況，且2 min 循環(huán)1 次的模式，達到了睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)≥30 次的重度OSAHS 診斷標準。IH 組大鼠每日循環(huán)8 h 后取出，置于正?？諝猸h(huán)境下飼養(yǎng)，連續(xù)間歇性缺氧6周，共42 d。

1.2.2 大鼠胸主動脈HE染色

使用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）對大鼠進行腹腔注射麻醉，進行心臟穿刺取血，每只大鼠取約5 mL 全血，置于4 ℃冰箱內待下一步檢測；開胸將大鼠胸主動脈剝離，截取胸主動脈，分離好的組織用預冷的PBS 將表面沖洗干凈，固定、脫水、透明、滲透、包埋、切片、脫蠟、復水、染色后用中性樹膠封存。在光鏡下觀察大鼠胸主動脈的病理改變，并測量平均動脈內中膜厚度（intima-media thickness，IMT）。

1.2.3 HDL-C、LDL-C、TG、TC、Hcy水平檢測

取大鼠全血3 000 r/min 離心15 min，分離血清后，通過ELISA法檢測HDL-C、LDL-C、TC、TG及Hcy。

1.2.4 流式細胞術檢測

取大鼠全血裂紅后進行流式雙標檢測Tang 及EPC 占單個核細胞（mononuclear cell，MNC）比例，檢測指標分別為CD3+CD31+和CD34+CD133+。調整細胞懸液濃度至1×106個/mL，取樣本1 mL分別加入1 μg未稀釋CD3、CD31 抗體置于4 ℃孵育30 min，加入1 mL PBS 上機檢測Tang 水平；另外，再取1×106個/mL 的細胞樣本1 mL加入1 μg CD34抗體，4 ℃孵育30 min，然后加入1 μg 未稀釋CD133 抗 體4 ℃孵育1 h，因本實驗所用CD133 抗體非熒光抗體，故再加入1 μg CD133相對應的二抗（FITC標記山羊抗兔IgG）4 ℃孵育30 min，隨后加入1 mL PBS上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 CIH大鼠胸主動脈內中膜增厚

經過6 周的間歇性缺氧暴露后，取大鼠胸主動脈切片做HE 染色，IH 組病理切片中未見動脈斑塊及脂質空泡（圖1A），胸主動脈內中膜厚度IH組［（121.275±30.896）μm］對比RA 組［（84.075±7.452）μm］顯著增厚（P<0.01，圖1B）。

圖1 間歇性缺氧暴露可導致大鼠胸主動脈內中膜增厚Figure 1 Intermittent hypoxia exposure caused a thickening of thoracic aorta IMT in rats

2.2 CIH大鼠Hcy、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平改變

使用ELISA 方法測定大鼠血清中Hcy、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。IH組比RA組Hcy水平顯著升高（P<0.05，圖2A）。TG、HDL-C、LDL-C、TC 水平，IH 組對比RA 組差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖2B～E）。

圖2 RA組與IH組大鼠Hcy、TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平Figure 2 Levels of Hcy，TC，TG，HDL-C，and LDL-C in rats in the RA and IH groups

2.3 CIH大鼠Tang水平顯著升高

與RA 組相比，IH 組Tang/MNC 比值增高［（22.975±1.866）%vs.（15.713±1.746）%］，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001，圖3A、B）；IH組EPC/MNC的比值增高［（0.040±0.028）%vs.（0.028±0.012）%］，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖3C、D）。

圖3 RA組與IH組大鼠Tang及EPC水平Figure 3 Levels of Tang and EPC in rats from the RA and IH groups

3 討論

作為動脈粥樣硬化的獨立危險因素，長期CIH暴露會導致動脈粥樣硬化斑塊的產生［6］。動脈粥樣硬化病變通常是從動脈內膜開始，經過脂質和復合糖類沉積、內皮損傷及血小板聚集、血栓形成，進而成纖維細胞增生及鈣質沉著，并伴有動脈內中膜的重構和鈣化，導致動脈壁增厚變硬、血管腔狹窄［7］。Cuspidi 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化斑塊和管腔狹窄反映的是動脈粥樣硬化過程的更晚期階段，而在動脈粥樣硬化早期階段，血管內皮損傷后，血管發(fā)生適應性重構導致的IMT增厚應是更重要標志。有研究證實，中重度OSAHS患者頸動脈內中膜厚度與缺氧程度成正比，CIH能夠導致Hcy顯著升高，造成血管內皮損傷，并導致血脂代謝異常［9］。而本研究在進行動脈內皮損傷大鼠造模過程中發(fā)現(xiàn)，在IH組大鼠中并未觀察到血清HDL-C、LDL-C、TG、TC顯著變化，但發(fā)現(xiàn)IH組相比RA組，血清Hcy水平顯著升高且胸主動脈IMT顯著增厚，而IH組大鼠胸主動脈病理切片血管壁完整、未見動脈斑塊及脂質空泡，證實CIH暴露6周的大鼠動脈為應對血管內皮損傷發(fā)生了內膜適應性重構，處于動脈粥樣硬化的早期階段。

循環(huán)EPC 水平是血管內皮損傷與修復平衡的衡量標準之一，在具有各種心血管疾病危險因素如高血壓、肥胖、血脂異常、糖尿病等疾病的患者中會降低［3］。本研究檢測了造模后大鼠循環(huán)Tang及EPC水平，發(fā)現(xiàn)IH組大鼠Tang水平顯著升高，IH組大鼠EPC 雖表達升高，但與RA 組大鼠EPC 水平比較無統(tǒng)計學差異。有文獻報道，Tang 可促進EPC 增殖，維持循環(huán)中EPC的水平［4］。由此推測，在大鼠動脈粥樣硬化早期階段，可能由于IH 組大鼠Tang 水平顯著升高，保證了循環(huán)中EPC 的水平，進而有效維持了血管損傷與修復的平衡。

此外，Tang 表面表達CXCR4 受體，CXCR4 是穩(wěn)態(tài)趨化因子基質細胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1，SDF-1α）的特異性受體，Tang 向外周血中的趨化反應受到SDF-1α的調節(jié)。研究表明，SDF-lα的上游調控因子是缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1），在缺氧條件下HIF-1進入細胞核與靶基因的缺氧反應應答元件結合，上調SDF-1α的表達并釋放入血［10］。因此推測CIH 暴露后，缺氧誘導HIF-1/SDF-1α/CRCX4 信號軸激活，細胞內HIF-1水平升高，上調SDF-1α表達并釋放入外周血中，趨化更多的Tang 進入循環(huán)，這可能是本研究觀察到Tang水平升高的原因，是值得進一步研究的方向。

本研究尚存在不足，未能探討Tang細胞水平改變對動脈粥樣硬化的具體作用及其機制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在間歇性缺氧暴露下，大鼠循環(huán)Tang 水平升高可能參與血管早期發(fā)生適應性重構改變過程，與早期動脈粥樣硬化有關。本研究為OSAHS 相關性動脈粥樣硬化性疾病的干預及治療策略提供線索。