肖心儒，范 亮，施宇佳，張 倩，2*

1南京醫(yī)科大學附屬常州市第二人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，江蘇 常州 213003；2南京醫(yī)科大學常州醫(yī)學中心，江蘇 常州 213003

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以不完全可逆的氣流阻塞為特征的肺部狀態(tài)。有呼吸困難、慢性咳嗽或咳痰，存在反復發(fā)作的下呼吸道感染史或有危險因素史的患者均應考慮COPD。目前COPD 的診斷和氣流受限的嚴重程度分級主要由肺功能檢查確定，吸入支氣管舒張劑后1秒鐘用力呼氣量（forced expiratory volume in one second，FEV1）/用力肺活量（forced vital capacity，FVC）<0.7 提示存在不完全可逆的氣流受限即確診COPD［1］。COPD 發(fā)病機制復雜且存在多種表型［2］，當前的診斷方法無法解釋COPD 的病因，難以確定COPD特異性治療靶點。大量研究發(fā)現生物學標志物與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關［3-4］，因此在高危人群和COPD 患者中尋找分子生物學標志物，有助于COPD的診斷與治療。

COPD 的特征在于下呼吸道的異常免疫反應，其進展與形成淋巴濾泡的先天和適應性炎癥免疫細胞對肺的浸潤有關。近年來，越來越多的證據強調了免疫細胞浸潤在COPD發(fā)生發(fā)展中的重要性［5-7］。因此，在免疫細胞成分中尋找有效的COPD 診斷生物標志物是一種很有意義的研究途徑。我們前期研究表明α2 巨球蛋白（alpha 2 macroglobulin，A2M）是COPD的生物標志物且與炎癥反應密切相關［8-9］，本研究進一步探討了A2M 與COPD 中免疫細胞的相關性，并探究其潛在的功能及通路。

A2M 是一種急性期蛋白，當與蛋白酶反應時，A2M被轉化并獲得與細胞因子、生長因子和細胞受體結合的能力［10］。因此，A2M在維持蛋白酶介導的細胞因子和生長因子的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。此外，A2M還參與控制肺蛋白酶活性［11］。肺泡巨噬細胞在肺內局部合成A2M 的能力以及A2M 蛋白酶復合物的吞噬作用在減少肺蛋白酶負荷中可能發(fā)揮了重要作用。我們推測，A2M可能與免疫細胞的肺部浸潤有關。

本研究從GEO數據庫中篩選出一個COPD微陣列數據集。在健康樣本和COPD樣本之間進行差異表達基因（differential expressed gene，DEG）分析。鑒定A2M 在DEG 里的表達，使用CIBERSORT 分析免疫細胞基因表達，CIBERSORT成功地鑒定和定量了在COPD和對照樣本中滲入肺實質的各種免疫細胞，此外，本研究還描述了免疫細胞和A2M 之間的關系。

1 對象和方法

1.1 對象

本研究選取2022 年1 月—2023 年1 月于南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學科就診的25 例穩(wěn)定期COPD 患者作為研究對象。入選標準：①符合2022 年COPD 全球倡議中的診斷標準［12］；②臨床穩(wěn)定至少3 個月，無急性發(fā)作；③年齡≥40 歲。這些患者的影像學檢查結果符合COPD，吸入β2 激動劑后，支氣管擴張試驗呈陰性，FEV1/FVC<70%。本研究中所有COPD 患者根據肺功能分為4組（Ⅰ：FEV1%pred≥80%；Ⅱ：50%≤FEV1%pred<80%；Ⅲ：30%≤FEV1%pred<50%；Ⅳ：FEV1%pred<30%）。所有受試者均需排除感染、支氣管擴張、結核病、哮喘、惡性腫瘤和其他混雜的炎癥性疾病，如關節(jié)炎、結締組織疾病或炎癥性腸病。另選取本院同期進行體檢的健康志愿者26 例作為健康對照組。入選標準：①年齡≥40歲；②肺功能正常。排除標準為：①臨床資料不完整；②有高血壓、糖尿病、呼吸系統疾病、自身免疫性疾病等。本研究獲得常州市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準（2022KY113-01），所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 采集血液樣本

用EDTA抗凝管收集患者和健康對照的靜脈外周血10 mL，其中5 mL 低速離心機3 000 r/min 離心10 min，分離血清，通過ELISA 檢測A2M 蛋白水平；另留存5 mL 全血用于RT-qPCR 測定A2M 的mRNA表達水平。所有受試者的血液樣本均儲存于-80 ℃。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及處理

巨噬細胞系Raw264.7（武漢普諾賽公司）使用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內，DMEM 含有10%胎牛血清和1%雙抗。使用終濃度為50 ng/mL 的白細胞介素（interleukin，IL）-4和IL-13 誘導Raw264.7 細胞24 h 成為M2 型巨噬細胞（細胞形態(tài)為類圓形或紡錘形貼壁）；隨后用脂質體3 000（賽默飛公司，美國）將A2M siRNA（福州尚亞公司）轉染至M2型巨噬細胞；最后分別于轉染48 h和72 h后提取RNA和蛋白用于進一步研究。

1.2.3 ELISA測定

根據制造商的說明，使用ELISA試劑盒（江蘇酶標公司）檢測血漿樣品中A2M的總濃度。在450 nm處獲得標準品和樣品的吸光度值，并比較為每種測定構建的標準曲線，并用于最小化測定間差異。

1.2.4 RT-qPCR檢測

使用RNAliquid 超速全血總RNA 提取試劑盒（北京匯天東方科技有限公司）提取總RNA，實驗步驟按照說明書進行。使用紫外線分光光度計對提取的RNA濃度及純度進行檢測。使用第一鏈cDNA合成試劑盒（南京諾唯贊公司）合成第一鏈互補DNA。使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（南京諾唯贊公司）進行RT-qPCR，以評估m(xù)RNA 表達的程度。用ABI 7300型熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCT法進行數據的相對定量分析。引物由蘇州吉瑪公司提供，序列如下：homo-A2M（F：5?-AGGAAATCGCATCGCACAATG -3?；R：5?-ACGGTGAAAGGGTGCTCTG-3?）；homo-β-actin（F：5?-CGTGGACATCCGCAAAGA-3?；R：5?-GAAGGTGGACAGCGAGGC-3?）；mus-A2M（F：5?-AGGAATCTGCCCGAGCTTCT-3?；R：5?-ATGGCCTTGGTCTTGATCTCC-3?）；mus-β-actin（F：5?-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT -3?；R：5?-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAG-3?）。

1.2.5 Western blot實驗

收集經處理的各組細胞，4 ℃下12 000g離心10 min 后，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液（上海碧云天公司）中裂解30 min。使用BCA 蛋白測定試劑盒（上海碧云天公司）測定蛋白含量。蛋白質樣品經10%凝膠（上海雅酶公司）電泳后轉移到PVDF 膜上，利用快速封閉液（上海碧云天公司）對PVDF膜封閉20 min，加入抗精氨酸酶（arginase-1，Arg-1）和抗內參GAPDH 的一抗（Abcam 公司，英國），4 ℃搖床孵育過夜。次日TBST 洗滌3 次，山羊抗兔IgG二抗（上海碧云天公司）在室溫下孵育1.5 h后，再用TBST 洗滌3 次。使用ECL 顯影液（上海碧云天公司）在化學發(fā)光成像程序系統進行曝光拍照。Image J軟件用于結果分析。

1.2.6 肺功能的測定

本研究使用肺功能儀（耶格公司，德國），根據2019 年肺活量測定標準［13］對受試者進行坐位肺功能檢查，在整個測試過程中操作者持續(xù)觀察容積和流量曲線，并測量FVC、FEV1和FEV1/FVC 以及其他肺功能測試參數并計算預期值，記錄3次測量數值，將最高值認定為基值，同時FVC和FEV1的最佳值和次佳值之間的差異應小于0.10 L。

1.2.7 生物信息學分析

從GEO數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中篩選芯片數據集，選擇標準如下：①數據集必須包含全基因組表達mRNA 微陣列數據；②數據集應包括COPD 患者和正常吸煙者的肺組織標本；③數據集樣本數量必須>20?；谝陨蠘藴?，獲得了GSE38974 基因表達譜數據集，GSE38974 包含來自COPD患者的23個肺組織樣品和來自正常吸煙者的9個肺組織樣品。

1.2.7.1 差異表達基因和富集分析

使用R 軟件“Limma”識別COPD 樣本和健康對照組樣本之間的差異表達基因。以調整后的P<0.05和|log2fold change| ≥1 作為截斷值。使用R 軟件clusterProfiler包進行GO和KEGG分析。

1.2.7.2 GSVA分析

GSVA 能評估每個樣本中通路活性的潛在變化。使用R軟件中的“GSVA”包進行分析，計算所有樣本中通路的富集評分。

1.2.7.3 免疫細胞浸潤的評估

本研究使用“CIBERSORTx”網站（https：//cibersortx.stanford.edu）估算了GSE38974 樣本中22 種免疫細胞的比例。

1.3 統計學方法

使用SPSS26.0 和GraphPad Prism7 對實驗數據進行統計分析。采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗測量數據的正態(tài)性。符合正態(tài)分布的測量數據表示為均數±標準差（），分類變量數據表示為例數（百分率）［n（%）］。組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法檢驗。若符合正態(tài)分布，對連續(xù)變量使用t檢驗。采用Pearson相關分析對正態(tài)分布的資料進行相關性分析。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線確定診斷的靈敏度和特異度，曲線下面積（area under the curve，AUC）確定診斷效果。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象臨床特征

本研究納入25 例穩(wěn)定期COPD 患者及26 例健康對照，兩組年齡、性別、體重指數、吸煙史無統計學差異。與健康對照組比較，COPD 組患者外周血中性粒細胞（neutrophil，NEU）、單核細胞（monocyte，MONO）、嗜酸性粒細胞（eosinophil，EOS）絕對值顯著升高，而淋巴細胞（lymphocyte，LYM）、嗜堿性粒細胞（basophil，BASO）無明顯差異（表1）。由于EOS關系到穩(wěn)定期COPD患者治療方案的擬定，因此我們以EOS在300個/μL為界值進一步進行亞組分析，結果表明，EOS<300個/μL組和EOS≥300個/μL組在年齡、性別、體重指數、吸煙史、FEV1/FVC 和FEV1%pred 均無明顯差異，但EOS≥300 個/μL 組患者的呼出氣一氧化氮（fraction of exhaled nitric oxide，FeNO）水平顯著高于EOS<300個/μL組（表2）。

表1 研究對象臨床特征Table 1 Clinical characteristics of subjects

表2 不同EOS水平COPD患者的臨床特征Table 2 Clinical characteristics of COPD patients with different EOS levels

2.2 COPD患者DEG的鑒定和富集分析

分析COPD 患者中的差異表達基因（圖1A），其中，A2M在COPD組患者中的表達水平下降（圖1B）。GO 富集分析顯示，這些差異表達基因主要涉及白細胞遷移、細胞趨化、受體配體活性、信號受體激活活性、細胞因子活性等（圖1C、D）。KEGG 結果提示，在COPD 發(fā)生過程中，細胞因子-細胞因子受體相互作用、癌癥的轉錄失調、腫瘤壞死因子信號通路、凋亡、脂質與動脈粥樣硬化等信號通路顯著富集（圖1E、F）。

2.3 A2M與COPD免疫浸潤

采用CIBERSORT 方法進行免疫浸潤分析，計算兩組肺組織中22種免疫細胞的相對比例（圖2A）。CD8+T 細胞、激活的自然殺傷（natural killer，NK）細胞、M2 巨噬細胞在COPD 患者肺組織中異常下調，而M0巨噬細胞上調（圖2B）。此外，通過Pearson相關分析發(fā)現A2M與M0巨噬細胞呈負相關，與M2巨噬細胞和靜息肥大細胞呈正相關（圖2C）。

圖2 肺組織浸潤免疫細胞的分布Figure 2 The landscape of lung tissue-infiltrating immune cells

2.4 A2M與COPD免疫相關通路

利用GSVA 和ssGSEA 評估正常樣本和COPD樣本之間KEGG富集通路以及免疫相關通路的差異（圖3A、B），共獲得184個KEGG 通路評分矩陣。各通路在不同亞組中的不同評分提示COPD患者與健康人之間各通路活性存在差異，這可能是決定COPD 發(fā)生發(fā)展的重要因素。此外，Pearson 相關分析揭示了A2M 基因和富集分子途徑之間的相關性（圖3C），結果顯示，A2M 與凋亡、B 細胞受體通路、趨化因子通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用及NK細胞介導的細胞毒性呈負相關。

圖3 COPD相關的免疫信號通路分析Figure 3 Analysis of immune signaling pathways associated with COPD

2.5 COPD患者與健康對照組外周血中A2M的表達

RT-qPCR結果顯示，與對照組相比，A2M mRNA在COPD 患者外周血有核細胞中表達明顯降低（圖4A），ELISA 實驗結果顯示，COPD 患者外周血血漿A2M 的蛋白表達較對照組下降（圖4B）。ROC 曲線評估A2M作為COPD生物標志物的價值（圖4C），當界值（cut-off value）為5.495 時，A2M mRNA 作為COPD 生物標志物的靈敏度為92.0%，特異度為61.5%，AUC為0.815（95%CI：0.698～0.932，P<0.001），此指標作為COPD生物標志物的診斷價值最佳。

圖4 COPD患者與健康對照組外周血中A2M的表達水平Figure 4 Expression levels of A2M in peripheral blood of COPD patients and healthy controls

2.6 A2M與免疫細胞的相關性

進一步驗證25 例COPD 患者外周血中A2M 蛋白水平與免疫細胞的相關性（表3）。結果顯示，A2M 與LYM（圖5A）和MONO（圖5B）呈正相關（P<0.05），與NEU、EOS、BASO、中性粒細胞/淋巴細胞比值（neutrophil-lymphocyte ratio，NLR）、單核細胞/淋巴細胞比值（monocyte-lymphocyte ratio，MLR）無明顯相關。我們前期研究表明A2M 與肺功能相關［9］，因此，本研究進一步分析了GOLD Ⅰ～Ⅱ級和GOLDⅢ～Ⅳ級中A2M 與COPD 患者免疫細胞的相關性（表4），結果顯示，在GOLD Ⅰ～Ⅱ級中A2M與MONO呈正相關。同時，EOS關系到COPD穩(wěn)定期的治療，我們分析了EOS ≥300 個/μL 組和EOS<300 個/μL組中A2M 與COPD 患者免疫細胞的相關性（表4），結果顯示，EOS<300個/μL組中A2M與MONO呈正相關，與EOS呈負相關，EOS≥300個/μL組中A2M與LYM呈正相關，與MLR呈負相關。

圖5 A2M蛋白與免疫細胞的相關性Figure 5 Correlation between peripheral blood A2M protein and immune cells

表3 A2M和COPD患者免疫細胞的相關性Table 3 Correlation between A2M and immune cells in COPD patients

表4 不同分組中A2M和COPD患者免疫細胞的相關性Table 4 Correlation between A2M and immune cells in COPD patients in different groups

2.7 A2M 與巨噬細胞Raw264.7 細胞向M2 型極化的相關性

與正常巨噬細胞相比，IL-4和IL-13共刺激組的M2型巨噬細胞表面標志物Arg-1表達升高（圖6A），提示M2 型巨噬細胞誘導成功。在M2 型巨噬細胞中敲低A2M后，A2M mRNA表達降低（圖6B），且M2型巨噬細胞表面標志物Arg-1表達降低（圖6C）。

圖6 A2M與Raw264.7細胞向M2型極化的相關性Figure 6 Correlation between A2M and M2-type polarization of Raw264.7

3 討論

免疫細胞浸潤錯綜復雜地參與了COPD的發(fā)生和發(fā)展［14-16］。我們前期研究表明A2M是COPD的生物標志物，且A2M與炎癥反應密切相關［8-9］，本研究在前期研究基礎上利用生物信息學分析與臨床相關資料進一步探討了A2M與COPD中免疫細胞的相關性，并探究其潛在的功能及通路。

基于近年來COPD 免疫機制的理論，多種新型免疫調節(jié)藥物可以促進受損氣道的修復或免疫重建，從而降低COPD發(fā)作的頻率和嚴重程度，改善健康狀況和運動耐受性。因此，本研究使用CIBERSORT 評估來確定COPD 患者和健康對照者中免疫細胞浸潤的概況，表征了與COPD 相關的免疫細胞亞型，為COPD的治療提供新思路。

在本研究中，4種類型的免疫細胞均與COPD顯著相關，包括CD8+T 細胞、激活的NK 細胞、M0 巨噬細胞和M2巨噬細胞。這些不同的免疫細胞在肺組織微環(huán)境中可能并不單獨發(fā)揮作用，而是更傾向于與其他細胞相互作用，協同影響COPD 的進程［17］。COPD患者IL-8、IL-17水平明顯升高［18］，這可能是巨噬細胞在煙霧、病原體或其他因素刺激下分泌的，并進一步引起中性粒細胞的募集。這些促炎細胞通過釋放活性氧（reactive oxygen species，ROS）、蛋白酶、一些炎癥因子和趨化因子參與細胞外基質降解、黏液分泌和細胞損傷，從而促進COPD 的發(fā)展［19］。本研究發(fā)現M0 巨噬細胞的比例顯著增加，可以作為極化刺激的儲備。M1 巨噬細胞主要參與促炎反應，然而，在本研究的免疫浸潤分析中未觀察到M1 巨噬細胞在對照組和COPD 組之間存在差異。M2巨噬細胞主要參與抗炎反應，在COPD組中顯著減少，表明其功能可能在COPD 中受損。研究還發(fā)現COPD 患者肺組織中CD8+T 細胞的表達減少。CD8+T細胞主要分泌IL-4和IL-5，這兩種細胞因子都與加重肺氣腫發(fā)展的肺實質組織損傷有關［20］。然而，本研究觀察到的CD8+T 減少與以前的研究不一致。COPD 患者肺部產生γ干擾素的CD8+和CD4+淋巴細胞數量增加［21］。與正常對照組和非吸煙者相比，COPD 患者的CD8+T 細胞亞群頻率顯著增加［22］。這可能由于生物信息學方法和流式細胞術測定之間的差異。此外，COPD 患者肺組織中活化的NK 細胞減少。NK 細胞可以分泌細胞毒性介質，如顆粒酶B和穿孔素，它們可能在誘導肺細胞凋亡中起重要作用，從而促進肺氣腫［23］。有研究表明，NK細胞對COPD患者肺上皮細胞具有細胞毒性作用，并通過IL-1受體亞單位的樹突狀細胞轉運IL-1而得到增強［24］。以上研究均證明了免疫細胞在COPD 發(fā)病中的直接或間接作用，這與本研究結果一致。因此，尋找COPD 免疫療法的潛在靶點具有重要意義。

A2M是控制蛋白酶活性的核心調節(jié)劑，在充當蛋白酶抑制劑、激素、免疫調節(jié)劑和細胞因子中發(fā)揮著重要作用［25］。研究發(fā)現，A2M作為血液中的一種大分子血漿蛋白，可以通過抑制纖溶酶和激肽釋放酶來滅活多種蛋白酶［26］，還可以充當結合生長因子、激素和細胞因子的載體蛋白，如血小板衍生生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子和白細胞介素［27］。Poller 等［28］鑒定了1 例A2M基因突變和部分血清A2M缺乏癥的患者，該患者慢性氣道阻塞發(fā)生早，并迅速進展為極其嚴重的COPD。

本課題組前期研究發(fā)現A2M mRNA在COPD患者外周血中下調［29］，此結果在本研究中得到進一步驗證。本研究發(fā)現，A2M與M0巨噬細胞呈負相關，與M2 巨噬細胞和靜息肥大細胞呈正相關，且A2M與凋亡、B細胞受體通路、趨化因子通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用及NK細胞介導的細胞毒性呈負相關。此外，本研究進一步證實了A2M與淋巴細胞、單核細胞具有顯著相關性。單核細胞作為先天免疫系統的重要組成部分，可以直接發(fā)揮吞噬作用或分化為巨噬細胞進而影響疾病進程［30］。上述發(fā)現提示A2M 可能與巨噬細胞相關，因此，本研究探究了M2型巨噬細胞中A2M的表達水平，并在M2型巨噬細胞中敲低A2M 后進一步驗證A2M 與巨噬細胞極化存在相關性。此外，本研究還探究了NLR和MLR 與A2M 的相關性，NLR 和MLR 都是機體免疫對不同應激刺激反應的指標［31-32］，可以放大中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞對炎癥反應的評價作用。本研究中COPD 組患者的NLR 高于健康對照組，但差異無統計學意義，而COPD 組患者的MLR高于健康對照組（P<0.05）。然而，A2M 與NLR 和MLR 均無明顯相關性，但在EOS≥300 個/μL 組中A2M 和MLR 呈負相關。以上結果提示A2M 在COPD 炎癥和免疫中可能發(fā)揮重要功能，通過對EOS進行亞組分析，本研究發(fā)現EOS ≥300個/μL組較EOS<300 個/μL 組有更高的FeNO 水平，驗證了高EOS 與氣道炎癥相關，且EOS ≥300 個/μL 組中A2M 與淋巴細胞呈正相關，提示A2M 在高EOS 的COPD 中可能是通過淋巴細胞介導炎癥反應的，而在低EOS的COPD中可能是通過單核細胞介導炎癥和免疫反應的。

本研究有一定局限性。首先，樣本量較?。黄浯?，只檢測了外周血中A2M 的表達，其在痰液和肺泡灌洗液中的表達水平尚不清楚，這兩種樣本與氣道炎癥關系更密切；最后，本研究表明A2M 與巨噬細胞向M2型極化的相關性，然而，A2M是否直接影響巨噬細胞向M2型極化仍需進一步研究。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析發(fā)現A2M 在COPD 患者肺組織與外周血中表達降低，且與淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、肥大細胞具有相關性，A2M 可能在巨噬細胞向M2 型極化的過程中發(fā)揮重要作用。這為未來研究COPD的發(fā)病機制以及探索相關的免疫治療奠定了理論基礎。