◎ 林 順，劉 希，王琦文，童 星

（1.佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528511；2.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528000）

γ-谷氨酰肽是由谷氨酰胺或谷氨酸的γ-羧基和氨基酸或肽分子的α-氨基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)所得的一類小分子肽，廣泛存在于自然界中[1]。研究者在不同食物中也發(fā)現(xiàn)了新的γ-谷氨酰肽，如醬油、大豆、奶酪、大蒜、洋蔥、魚制品和酵母抽提物[2]。在19 世紀(jì)90 年代，人們發(fā)現(xiàn)γ-谷氨酰肽是賦予這些食物濃厚風(fēng)味（口感飽滿、連續(xù)性和持續(xù)性）的主要貢獻成分[3]，這也引發(fā)了學(xué)術(shù)界對γ-谷氨酰肽感官特性的各種研究。2010 年，OHSU 等[4]報道了γ-谷氨酰肽是細胞外鈣敏感受體（Calcium-Sensing Receptor，CaSR）激動劑，可以間接增強kokumi 味覺感受。除了味覺作用之外，人們還研究了γ-谷氨酰肽參與人體生理活性的多種機制，發(fā)現(xiàn)其具有抗炎[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、降血壓、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)以及金屬離子螯合[8]作用等，使人們進一步認(rèn)識到了γ-谷氨酰肽的功能與價值[9]。

1 γ-谷氨酰肽的生理活性

1.1 激活kokumi 風(fēng)味感知

CaSR 激活劑包括肽、氨基酸、多胺、陽離子和氨基糖苷類抗生素[8]。BROADHEAD 等[9]提出CaSR的細胞外捕蠅草結(jié)構(gòu)域是γ-谷氨酰肽的結(jié)合位點，這種結(jié)合導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca2+水平升高，產(chǎn)生kokumi 味覺的神經(jīng)信號。很多研究表明CaSR 的活性與γ-谷氨酰肽的kokumi 強度呈正相關(guān)[10]。有研究者使用非洲爪蛙卵母細胞和人胚胎腎（HEK）-293 細胞測試了近百種γ-谷氨酰肽的CaSR 活性及其kokumi 味覺強度，進一步證實了γ-谷氨酰肽的結(jié)構(gòu)特征能夠激活CaSR，并引發(fā)kokumi 感覺[11]。引起高CaSR 活性和醇厚味的肽通常在N 端具有γ-谷氨?；?，在第二個殘基處具有脂肪族、中性、中等大小的取代基，并且優(yōu)選在C 端為甘氨酸的羧基[12]。

1.2 抗炎活性

γ-谷氨酰肽在人體中表現(xiàn)出各種類型的抗炎作用。例如，有研究者將膳食二肽γ-谷氨酰纈氨酸（γ-EV）和γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-EC）鑒定為具有健康促進因子的抗炎肽。其中γ-EV 和γ-EC可 改善葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥、結(jié)腸縮短、體重減輕和組織學(xué)損傷引起的臨床癥狀[13]。γ-EC 能夠保護Wistar 大鼠的肝組織免受鎘和鐵誘導(dǎo)的肝細胞損傷，增加肝組織中的抗氧化能力，減少促炎細胞因子，增加抗炎細胞因子，進而可以調(diào)節(jié)人體代謝疾病的發(fā)生[5-6]。

1.3 改善血糖

二肽基肽酶（Dipeptidyl Peptidase-4，DPP-4）廣泛存在于人和動物體內(nèi)，是一種絲氨酸水解酶，可水解各種肽，包括生長激素釋放激素、腸神經(jīng)肽、胃泌素釋放肽和腸促胰島素[14]，其中腸促胰島素會導(dǎo)致血糖升高，因此被認(rèn)為是針對2 型糖尿病的潛在治療靶點。目前，許多研究人員專注于尋找可以成為有效DPP-4 抑制劑的新型化合物，通過阻止DPP-4 分解胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-Like Peptide-1，GLP-1），進而提高GLP-1 的水平，發(fā)揮控制血糖作用，是目前治療糖尿病的主攻方向之一。例如，有研究篩選了21 種γ-谷氨酰二肽的DPP-4 抑制活性，其中γ-Glu-Met、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Leu和γ-Glu-Tyr 被發(fā)現(xiàn)對DPP-4 表現(xiàn)出競爭性抑制作用[15]，γ-谷氨酰肽也被證明可以以CaSR 依賴的方式改善餐后血糖[16]。

1.4 調(diào)節(jié)膽囊收縮素和抑制食欲活動

膽囊收縮素（Cholecystokinin，CCK）是一種腸腦肽激素，參與刺激蛋白質(zhì)和脂肪的消化。它由胃腸道十二指腸細胞分泌，還參與胰腺生長、胃腸蠕動和抑制胃酸分泌，有助于抑制食欲，從而減少食物攝入。因此，CCK 是控制和預(yù)防肥胖的有效治療靶點。包括γ-Glu-Cys-Gly、γ-Glu-Cys 和γ-Glu-Ala 在內(nèi)的γ-谷氨酰肽可通過變構(gòu)調(diào)節(jié)CaSR，增加細胞內(nèi)cAMP的濃度[9]。因此，γ-谷氨酰肽具有調(diào)節(jié)腸道激素的巨大潛力，能夠抑制食欲和控制食物攝入。

1.5 其他生物活動

SCV-07（γ-Glu-Trp）是一種新型免疫調(diào)節(jié)肽，具有抗結(jié)核病的廣譜免疫調(diào)節(jié)活性，能夠減輕口腔黏膜炎癥狀[17]。γ-谷氨酰肽也存在于人體中，它們在體內(nèi)的積累增加可能與疾病的發(fā)作有關(guān)，因此可以作為診斷某些疾病的指標(biāo)。據(jù)報道，神經(jīng)組織中γ-Glu-Lys的積累增加是神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷指標(biāo)[18]。

2 γ-谷氨酰肽的提取和分離

γ-谷氨酰肽在很多食物中都存在，并且對這些食物濃厚、持續(xù)、復(fù)雜的口感有重要貢獻，很多研究者對其進行了分離和鑒定。UEDA 等[19]使用Duolite C-25 離子交換樹脂和反滲透膜提取分離了大蒜中的kokumi 關(guān)鍵呈味物質(zhì)，然后使用質(zhì)譜和核磁共振對該物質(zhì)進行了鑒定，結(jié)果為(+)-S-甲基-L-半胱氨酸亞砜和γ-L-谷氨酰胺-S-烯丙基-L-半胱氨酸。該研究團隊還采用水提和乙醇提取方法分析發(fā)現(xiàn)了PeCSO和γ-Glu-PeCSO，并證實其為洋蔥特有醇厚風(fēng)味的重要組成[3]。ROUDOT-ALGARON 等[20]采用液體CO2沉淀及檸檬酸鹽緩沖液分離，然后使用凝膠滲透色譜法和反相高效液相色譜純化，并通過質(zhì)譜法進行分析，確定kokumi 風(fēng)味的主要貢獻物為γ-Glu-Leu、γ-Glu-Tyr 和γ-Glu-Phe。另外一些研究應(yīng)用超濾、凝膠過濾色譜和高效液相色譜的組合從干鯡魚片、大豆種子和牛骨髓的水提取物中純化γ-谷氨酰肽[21-23]。

3 γ-谷氨酰肽合成

雖然γ-谷氨酰肽存在于多種食物中，但是含量太低，且提取分離的成本很高，因此采用生物合成法是獲取大量γ-谷氨酰肽最經(jīng)濟、有利的途徑。γ-谷氨酰肽的生物合成主要利用酶的催化作用和微生物發(fā)酵實現(xiàn)，目前文獻報道的可以催化合成γ-谷氨酰肽的酶主要包括谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（EC 2.3.2.2）、谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2）、谷氨酰半胱氨酸合成酶（EC 6.3.2.2）[8]。

3.1 γ-谷氨酰肽生物合成

3.1.1 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（Gamma-Glutamyltransferase，GGT）是一個異二聚體，具有分子量大小不同的兩個亞基，屬于N-末端親核氨基水解酶類，可催化γ-谷氨酰基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)和谷氨酰胺的水解反應(yīng)。發(fā)生反應(yīng)時，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶小亞基N-末端蘇氨酸的活性氧原子攻擊γ-谷氨?；w形成γ-谷氨酰-酶復(fù)合體，當(dāng)親核試劑為氨基酸或肽分子時發(fā)生轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，為水分子時發(fā)生水解反應(yīng)，當(dāng)供體肽的第二個底物充當(dāng)受體，則被稱為自轉(zhuǎn)肽（圖1）[8]。由于這兩種反應(yīng)的最佳pH 值不同，酶可以選擇性地催化其中一種反應(yīng)。利用不同的氨基酸作為γ-谷氨酰受體，可以合成各種γ-谷氨酰肽。例如，SUZUKI 等[1]采用大腸桿菌生產(chǎn)的GGT 合成了γ-Glu-Val、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-谷氨酰乙酰胺。該研究者還將GGT 用于Phe、Val、Leu 和His 的γ-谷氨?；越档推淇辔?，并發(fā)現(xiàn)催化合成γ-Glu-Phe 的最佳反應(yīng)條件為Gln 200 mmol·L-1、Phe 200 mmol·L-1、GGT 0.5 U·mL-1、pH 值為10.4、37 ℃孵育1.5 h，該條件下可得到140 mmol·L-1γ-Glu-Phe，產(chǎn)率為70%。對于大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用，通常會優(yōu)選GGT，這是因為GGT 不需要使用ATP 進行轉(zhuǎn)移反應(yīng)。此外，細菌GGT 已被證明比哺乳動物GGT 更有益，因為它們具有非糖基化蛋白質(zhì)、更高的溶解度和更廣泛的底物選擇性，與哺乳動物GGT 相比，細菌GGT 能夠產(chǎn)生多種γ-谷氨?；衔?。此外，哺乳動物GGT 需要使用谷胱甘肽作為γ-谷氨酰供體，而細菌GGT 可以使用廉價的谷氨酰胺。細菌GGT 對生產(chǎn)藥學(xué)相關(guān)肽也很重要，如通過大腸桿菌GGT 合成的γ-L-谷氨酰-二羥基苯丙氨酸已被證明是一種有前途的帕金森病治療藥物，其能夠增加大腦中的多巴胺水平[24]。大腸桿菌GGT 也被用于以L-谷氨酰胺為供體合成γ-谷氨酰?；撬岷挺?Glu-Trp，對鼠結(jié)核病具有免疫調(diào)節(jié)作用[25]。

圖1 不同酶合成γ-谷氨酰肽作用機制圖

3.1.2 谷氨酰胺酶

谷氨酰胺酶是一種水解酶，廣泛存在于酵母、細菌和真菌等微生物中，主要催化谷氨酰胺水解成谷氨酸。然而，某些谷氨酰胺酶也可以催化γ-谷氨酰部分從谷氨酰胺轉(zhuǎn)移到各種肽或氨基酸以產(chǎn)生γ-谷氨酰肽（圖1）[26]。YANG 等[27]驗證了解淀粉芽孢桿菌（GBA）和米曲霉（GAO）谷氨酰胺酶產(chǎn)生γ-[Glu]n-Phe 肽的轉(zhuǎn)肽酶活性。在Gln 和Phe 的存在下，GAO 合成了γ-Glu-Phe 和γ-Glu-γ-Glu-Phe，GBA合成了γ-[Glu](1 ≤n＜5)-Phe，GBA 在轉(zhuǎn)肽反應(yīng)中對Phe和γ-Glu-Phe的親和力大于GAO。合成γ-[Glu]n-Phe 的最佳條件是pH=10，合成溫度37 ℃，底物為300 mmol·L-1Gln、100 mmol·L-1Phe 和0.05 U·mL-1GBA，保溫時間3 h[28]。TACHIKI 等[29]采用硝基還原假單胞菌（Pseudomonas nitroreducens）源的谷氨酰胺酶，可催化谷氨酰胺中的γ-谷氨酰部分轉(zhuǎn)移到甲基或者乙基上，進而合成了茶氨酸。然而，與GGT 相比，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶有限的活性和較窄的底物特異性，導(dǎo)致谷氨酰胺酶通常不是工業(yè)應(yīng)用的首選酶。

3.1.3 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-Glutamylcysteine Synthetase，γ-GCS）通過連接谷氨酸與半胱氨酸，在谷胱甘肽合成反應(yīng)中催化γ-谷氨酰-半胱氨酸的合成。該酶還能催化其他氨基酸與谷氨酸反應(yīng)，生成不同的γ-谷氨酰肽（圖1）[30]。KOBAYASHI 等[30]報道了在GCS 催化活性中，半胱氨酸的Km值最低，為0.06 mmol·L-1，而其他氨基酸的Km值則更高，為21～1 800 mmol·L-1。表明在產(chǎn)生γ-谷氨酰肽過程中，除半胱氨酸外，其他氨基酸不是GCS 受體的首選。NAKAYAMA 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，從奇異變形桿菌中純化的GCS 能夠合成不同的γ-谷氨酰肽，包括γ-Glu-Val、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Abu、γ-Glu-Lys和γ-Glu-Ala 等，該酶的最佳催化條件為溫度30 ℃、pH=8.5 孵育24 h。然而，該酶的局限性在于需要ATP進行催化，并且在反應(yīng)過程中產(chǎn)生的ADP 和最終反應(yīng)產(chǎn)物可能通過反饋抑制機制導(dǎo)致產(chǎn)率降低[32]。

3.2 γ-谷氨酰肽微生物發(fā)酵

許多發(fā)酵食品都會積累γ-谷氨酰肽，這歸因于原料中微生物或酶的代謝活動。例如，谷物發(fā)酵中的谷胱甘肽是微生物內(nèi)部谷胱甘肽還原酶的催化作用產(chǎn)生的[33]。有研究人員在酵母自溶物中發(fā)現(xiàn)了谷胱甘肽[34]。XIE 等[35]利用羅伊氏乳桿菌γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（Glutamate Cysteine Ligase，GCL）的活性，從以14 種氨基酸為底物的體系中合成了γ-谷氨酰肽，包括γ-Glu-Ala、γ-Glu-Met、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile 和γ-Glu-Phe等。SOFYANOVICH 等[36]報道了在酵母提取物中發(fā)現(xiàn)的γ-EVG 是由釀酒酵母通過兩種途徑合成得到：以谷氨酸、纈氨酸和甘氨酸作為前體，由GCL 和GS 酶的催化作用產(chǎn)生；通過（Dug2p-Dug3p）2 復(fù)合物介導(dǎo)γ-谷氨酰部分從谷胱甘肽轉(zhuǎn)移到二肽Val-Gly 上產(chǎn)生γ-EVG。然而，由微生物發(fā)酵作用產(chǎn)生的γ-谷氨酰肽濃度較低，提取和純化的成本比較高。

4 結(jié)語

γ-谷氨酰肽廣泛存在于天然動植物及日常食物中，不僅可以改善食品的風(fēng)味，提升濃厚感，還具有抗炎、抗氧化、降血壓以及心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)等多方面的生理作用，在食品風(fēng)味提升及天然健康物質(zhì)合成方面有著巨大的應(yīng)用價值。但是，目前除了谷胱甘肽具備工業(yè)化基礎(chǔ)之外，其他結(jié)構(gòu)及功能的γ-谷氨酰肽仍然缺少高效成熟的生產(chǎn)技術(shù)，其在合成過程中仍存在以下科學(xué)難題急需解決。①谷氨酰胺酶受體的轉(zhuǎn)移活性較低，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化效率仍處于實驗室水平，需要通過酶工程和細胞工程技術(shù)構(gòu)建γ-谷氨酰肽催化酶劑的高效表達。②通過基因工程改造載體細胞，優(yōu)化代謝通路，實現(xiàn)微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-谷氨酰肽的工業(yè)化可行路線。③γ-谷氨酰肽通過激活味覺中CaSR 達到增強濃厚感的效果，但其深層的分子作用機制尚不清楚，對于濃厚感風(fēng)味具有協(xié)同作用的物質(zhì)缺少相關(guān)研究。所以，加強γ-谷氨酰肽的深入研究對未來健康食品行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。