胡伍清,畢慧玲,苗聰秀

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院生殖遺傳科,山西省衛(wèi)生健康委員會(huì)生殖工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)治 046000)

1 卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)

1.1 POF病因?qū)W 卵巢功能下降包括卵巢儲(chǔ)備功能減退、早發(fā)性卵巢功能不全及POF三個(gè)不同階段,這是一個(gè)逐漸進(jìn)展的過(guò)程。POF是早發(fā)性卵巢功能不全的終末階段,其臨床表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)、經(jīng)量減少甚至閉經(jīng)、雌激素水平下降、FSH升高、不孕不育等。POF病因可能包括遺傳因素和醫(yī)源性因素,遺傳因素:染色體及相關(guān)基因異常,如BMP15、BMPR1A/1B、PGRMC1、FSHR、CYP11、FOXL2、GDF9、MCM8等;醫(yī)源性因素:放化療、盆腹腔手術(shù)以及自身免疫性因素等[1-2]。因其病因復(fù)雜,許多未知的因素仍在進(jìn)一步探索中。有研究證明,DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response,DDR)是調(diào)控生殖衰老的主要生物途徑,DDR存在于整個(gè)生命過(guò)程中,調(diào)控卵巢儲(chǔ)備及其耗竭,尤其是關(guān)鍵基因的功能喪失或變異。該研究發(fā)現(xiàn),FMR1異常是引起POF的主要單基因病因,這為揭開POF的本質(zhì)向前邁進(jìn)了一大步[3]。

1.2 POF的治療 POF的治療方法包括:激素替代療法(hormone replacement therapy,HRT)、體外激活療法(in vitro activation,IVA)、贈(zèng)卵體外受精胚胎移植(in vitro fertilization with oocyte donation,IVF-OD)、干細(xì)胞治療等。HRT是治療POF的推薦方法[4-5]。但有研究表明,長(zhǎng)期HRT會(huì)增加患者患子宮內(nèi)膜癌、靜脈血栓栓塞的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)無(wú)法從根本上逆轉(zhuǎn)卵巢功能減退[6-7]。卵巢儲(chǔ)備減少的部分POF患者,可通過(guò)IVA方法獲得成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET),然而IVA需要有一定數(shù)量的卵巢卵泡儲(chǔ)備,而且影響其臨床應(yīng)用的最大問(wèn)題是效率極低問(wèn)題,不是所有的POF患者都適用此方法,且不能改變與年齡相關(guān)的卵母細(xì)胞質(zhì)量下降[8]。IVF-OD利用捐獻(xiàn)的卵子進(jìn)行IVF-ET,是治療POF患者不孕的方法之一,但I(xiàn)VF-OD治療無(wú)法使患者擁有與自身基因相同的后代,且研究表明通過(guò)IVF-OD獲得的妊娠,妊娠期高血壓疾病、子癇前期、胎兒出生體重不足和早產(chǎn)等的風(fēng)險(xiǎn)增加[9]。干細(xì)胞技術(shù)一直以來(lái)被視為“再生醫(yī)學(xué)技術(shù)”,可促進(jìn)組織修復(fù)與再生,被認(rèn)為是未來(lái)治療POF的最有效方法[10]。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchyal stem cells,MSCs)

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞特性 干細(xì)胞是一類未分化的細(xì)胞或原始細(xì)胞,在特定條件下可激發(fā)其分化潛能,定向分化為組織或器官,具有極強(qiáng)的組織修復(fù)潛能。干細(xì)胞治療技術(shù)被譽(yù)為繼藥物治療和手術(shù)治療之后的第三次醫(yī)學(xué)革命,是近年來(lái)國(guó)際醫(yī)學(xué)前沿重點(diǎn)發(fā)展領(lǐng)域[11]。MSCs是中胚層來(lái)源的一類多能型干細(xì)胞,是干細(xì)胞家族的重要成員,MSCs除了具有多項(xiàng)分化潛能外,還具有自發(fā)趨向損傷組織、促進(jìn)局部組織血管生成,調(diào)節(jié)周圍細(xì)胞微環(huán)境以及免疫調(diào)節(jié)功能[12-13]。它們可從人體許多不同組織中,如骨髓、臍帶、外周血、脂肪組織、胎盤和經(jīng)血中分離培養(yǎng)獲得,可實(shí)現(xiàn)體外建系、擴(kuò)增,同時(shí)MSCs不表達(dá)或僅表達(dá)極低水平的主要組織相容性復(fù)合物和T細(xì)胞共刺激因子從而表現(xiàn)出低免疫原性,解決了異體細(xì)胞治療最主要的免疫排斥問(wèn)題[14]。MSCs可提供一個(gè)必要的微環(huán)境,以促進(jìn)卵泡發(fā)育[15]。因此,MSCs治療有望成為許多難治性疾病,如克羅恩病、移植抗宿主病、POF等最有前景的治療方法,且已初見成效[16-17]。一項(xiàng)I期臨床試驗(yàn)中對(duì)9例POF患者進(jìn)行了MSCs治療,在研究期間和隨后長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月的隨訪中,根據(jù)患者體格檢查、相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和超聲檢查評(píng)估患者術(shù)后狀態(tài),均未觀察到全身或局部不良反應(yīng),進(jìn)一步驗(yàn)證了其治療的安全性[18]。

2.2 MSCs歸巢 MSCs的療效取決于MSCs歸巢效率,MSCs歸巢受植入方式、組織釋放的選擇素、細(xì)胞趨化因子(如SDF-1、MCP-1、MCP-3)、生長(zhǎng)因子等MSCs表達(dá)的受體類型(如CD44、CD24、CCR2)以及分泌的整合素的綜合影響,只有一小部分MSCs能到達(dá)并停留于目標(biāo)組織[19]。研究證明,靜脈注射MSCs制劑時(shí)大多數(shù)MSCs被滯留在毛細(xì)血管組織中無(wú)法遷移到損傷部位[20];或在到達(dá)目標(biāo)組織之前被脾巨噬細(xì)胞吞噬清除而影響治療效果[21]。細(xì)胞支架可為MSCs提供適合的3D空間,并確保MSCs最大限度遷移到靶組織。因此,間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞支架成為治療POF的研究熱點(diǎn)[22]。

3 組織工程學(xué)(tissue engineering,TE)與細(xì)胞支架

3.1 細(xì)胞支架 TE是一門應(yīng)用生命科學(xué)、材料學(xué)和工程學(xué),幫助受損組織重建,恢復(fù)其生理結(jié)構(gòu)和功能的新興學(xué)科,主要由種子細(xì)胞、支架和生物活性物質(zhì)三個(gè)重要部分構(gòu)成。一個(gè)理想的支架除了無(wú)毒無(wú)害的基本要求之外,還應(yīng)給細(xì)胞提供足夠的三維生長(zhǎng)空間,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、參與信號(hào)傳遞,且在愈合過(guò)程中或之后逐漸被人體吸收[23]。在支架制造選材中,細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)因具有較高的生物相容性、生物降解性以及在體內(nèi)快速重塑的可能性成為制造細(xì)胞支架較為理想的材料[24]。ECM主要由蛋白質(zhì)包括膠原蛋白、纖維蛋白、彈性蛋白等,以及多糖,包括海藻酸鹽、透明質(zhì)酸(hualuronic acid,HA)、殼聚糖(chitosan,CS)等組成。這些物質(zhì)為周圍細(xì)胞提供機(jī)械支持,同時(shí)協(xié)調(diào)多種細(xì)胞信號(hào)傳遞,在組織中的細(xì)胞之間發(fā)揮通信聯(lián)絡(luò)作用并參與組織修復(fù)[25]。在組織工程中這些天然聚合物可制作成水凝膠的形式包裹細(xì)胞,為細(xì)胞提供適合的生長(zhǎng)空間[26]。

3.2 各類支架 臨床上常用的幾種細(xì)胞支架包括膠原蛋白支架、纖維蛋白支架、CS支架、海藻酸鹽支架等。

3.2.1 膠原蛋白支架 膠原蛋白是動(dòng)物組織中最豐富的可利用的蛋白質(zhì),具有抗原性低、生物相容性好、生物降解性高等特點(diǎn),在TE中得到廣泛應(yīng)用[27]。膠原蛋白支架可支持多種組織和細(xì)胞類型,并為細(xì)胞錨定、遷移和移植提供合適的位置。Jing等[28]研究發(fā)現(xiàn),脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)與膠原蛋白支架共培養(yǎng)會(huì)增加ADSCs中FGF2、VEGF、TGFb1和HGF的表達(dá)。同時(shí)膠原蛋白支架也會(huì)與ADSCs相互作用,形成三維微環(huán)境,使ADSCs存活率增加,并在卵巢周圍聚集,分泌更多的生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生成因子,最終增加卵泡顆粒細(xì)胞和血管的生成。然而膠原蛋白支架的缺點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度低,降解過(guò)快,影響細(xì)胞在組織的停留時(shí)間,這會(huì)影響到該支架在臨床應(yīng)用中的治療效果。

3.2.2 纖維蛋白支架 纖維蛋白在生物體內(nèi)普遍存在,可對(duì)血管生成和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)起到積極作用,有極強(qiáng)的黏附性能,免疫原性較低,易塑形,可制備成具有復(fù)雜幾何形狀的支架,因此纖維蛋白也成為構(gòu)造細(xì)胞支架材料的不二之選,尤其在體外組織器官的重建中具有很大的潛力[29]。在一項(xiàng)小鼠自體卵泡移植實(shí)驗(yàn)中,用纖維蛋白支架作為載體攜帶血小板裂解物包裹卵泡后進(jìn)行移植,取得了較好的效果[30]。但纖維蛋白支架的缺點(diǎn)是需要多種聚合物進(jìn)行聚合反應(yīng),纖維蛋白原濃度、凝血酶濃度和離子強(qiáng)度的變化都會(huì)影響纖維蛋白支架的性能,導(dǎo)致支架外觀、機(jī)械性能和穩(wěn)定性發(fā)生不同程度變化。

3.2.3 CS支架 CS是甲殼素N-脫乙?；漠a(chǎn)物,主要來(lái)源于甲殼類動(dòng)物的外殼,CS降解后產(chǎn)生的氨基酸,對(duì)人體無(wú)害且可被完全吸收。CS來(lái)源豐富且具有極好的彈性、柔韌性、可生物降解、良好的生物相容性、無(wú)毒、親水、抗菌和促進(jìn)傷口愈合等特性,使其在生物材料中占據(jù)了獨(dú)特的地位[31]。但CS的制備和降解需要一定范圍的PH,且機(jī)械性能較弱,難以維持一定的形狀,這也在一定程度上限制了其應(yīng)用。

3.2.4 海藻酸鹽支架 海藻酸鹽是一種主要存在于海洋藻類細(xì)胞壁和細(xì)胞黏膠質(zhì)中的親水性多糖,水合反應(yīng)后呈凝膠狀[32]。海藻酸鹽作為一種多用途聚合物,具有資源豐富、生物相容性好、處理簡(jiǎn)單、凝膠性質(zhì)溫和且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)。以海藻酸鹽為基礎(chǔ)的水凝膠和支架在生物活性制劑的控釋系統(tǒng)、癌癥治療和抗菌劑等多個(gè)領(lǐng)域已進(jìn)行了廣泛的研究[33]。盡管如此,海藻酸鹽支架同樣表現(xiàn)出機(jī)械性能弱和不易控制其形態(tài)的缺點(diǎn)。

3.2.5 HA細(xì)胞支架 HA是構(gòu)成ECM的多糖類物質(zhì),在許多生理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,如調(diào)節(jié)血管壁的通透性,蛋白質(zhì)、電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn),細(xì)胞黏附、遷移和增殖等,并在醫(yī)學(xué)的眼科、骨科、皮膚科、心血管科及神經(jīng)科等學(xué)科有著廣泛的研究應(yīng)用[34]。HA具有不錯(cuò)的黏彈性和一定的生理調(diào)節(jié)功能,在TE中一直受到科學(xué)家們的青睞。HA細(xì)胞支架已被證實(shí)可在一定程度上延長(zhǎng)MSCs在卵巢組織的停留時(shí)間,進(jìn)而增強(qiáng)其旁分泌功能[35]。同時(shí)也由于HA的生物學(xué)特性導(dǎo)致其在體內(nèi)植入后較其他種類支架更易被機(jī)體吸收。由于單一材料的支架各有其局限性,通過(guò)結(jié)合不同材料的優(yōu)點(diǎn)來(lái)提高細(xì)胞支架的理化和生物性能的新型復(fù)合材料也在不斷的研發(fā)中[36]。

4 MSCs與細(xì)胞支架及在POF的研究應(yīng)用

4.1 MSCs/細(xì)胞支架與卵泡體外培養(yǎng) 卵巢作為調(diào)節(jié)女性內(nèi)分泌及生殖功能的性腺,內(nèi)含許多始基卵泡,經(jīng)逐步生長(zhǎng)發(fā)育,從始基卵泡發(fā)育成為次級(jí)卵母細(xì)胞從卵巢內(nèi)排出。在月經(jīng)周期中發(fā)育的眾多卵泡里,只有一個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡可發(fā)育成熟,因此女性一生中約有400～500個(gè)卵泡可完全發(fā)育成熟而排卵,卵巢中留存的卵泡數(shù)量和質(zhì)量反應(yīng)了卵巢儲(chǔ)備功能。POF患者往往伴有不同程度的卵泡數(shù)量減少和(或)質(zhì)量下降,卵巢儲(chǔ)備功能的變化是評(píng)價(jià)POF療效的重要參考指標(biāo)之一。體外卵泡培養(yǎng)有望成為一種獲得成熟卵母細(xì)胞用于受精的有效方法[37],也為將來(lái)用于改善POF患者卵巢功能,保存生育能力帶來(lái)希望[38]。Rajabi等對(duì)卵泡體外培養(yǎng)方法的優(yōu)化進(jìn)行了一系列的研究,分別制備好0.25%海藻酸鈉和0.75%的膠原蛋白凝膠支架,用于卵泡和人經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞(human menstrual blood mesenchymal stem cells,MenSCs)體外三維共培養(yǎng),連續(xù)觀察12d后分析結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明海藻酸鈉支架共培養(yǎng)組比膠原蛋白共培養(yǎng)組卵泡存活率更高,且激素測(cè)定發(fā)現(xiàn)卵泡的雌二醇和孕酮的分泌量顯著增加,但兩組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,并且該研究還發(fā)現(xiàn)MenSCs下調(diào)了卵泡Mater基因的表達(dá),明顯上調(diào)Gdf9和Bmp15表達(dá),而海藻酸鹽支架和膠原蛋白支架對(duì)卵泡的基因表達(dá)無(wú)影響[39]。雖然海藻酸鹽支架在卵泡體外培養(yǎng)具有一定的優(yōu)勢(shì),但有研究認(rèn)為,從海藻酸鹽支架共培養(yǎng)系統(tǒng)獲得的卵母細(xì)胞發(fā)育能力較低,減數(shù)分裂紡錘體組裝可能受到干擾。Hassani等[40]進(jìn)行了卵泡體外培養(yǎng)的相關(guān)研究,指出與0.5%、1.5%濃度的CS支架相比,1%濃度的CS支架孔隙分布更均勻,降解率高,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,且機(jī)械性能強(qiáng),最適合供給卵泡細(xì)胞體外三維培養(yǎng)。1%濃度CS支架組與0.7%濃度海藻酸鹽支架組比較,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)CS和海藻酸鹽各組中卵泡形態(tài)、成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量和類固醇激素分泌情況,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)卵泡發(fā)生、內(nèi)分泌和凋亡相關(guān)基因的表達(dá),結(jié)果表明1%CS支架組的卵泡成活率、卵泡直徑、雌二醇分泌、Cyp19a1、Lhcgr基因表達(dá)均高于0.7%海藻酸鹽支架組,且海藻酸鹽支架組卵母細(xì)胞紡錘體紊亂的比例(42.1%)顯著高于1%CS支架組(16.6%)。因此,Hassani等認(rèn)為1%CS支架相比0.7%海藻酸鹽支架更適用于卵泡的體外三維培養(yǎng)。

4.2 MSCs/細(xì)胞支架與卵巢組織移植 POF病因復(fù)雜,癌癥患者放化療過(guò)程中可導(dǎo)致卵泡凋亡引起POF。有POF風(fēng)險(xiǎn)且有生育要求的癌癥患者,可通過(guò)胚胎凍存、卵母細(xì)胞凍存和卵巢組織凍存等,或進(jìn)行卵巢原位干細(xì)胞治療來(lái)保留其生育功能。然而卵巢組織在移植后會(huì)有大量卵泡凋亡,移植過(guò)程仍有許多問(wèn)題需解決。為了提高卵巢組織移植后卵泡的存活率,Dolmans等將ADSCs嵌入纖維蛋白支架中并移植到免疫缺陷小鼠的腹膜壁下部的1/3處,然后將卵巢組織移植到細(xì)胞支架,移植后第3、7和14d對(duì)種植體中的PO2進(jìn)行監(jiān)測(cè)和分析。結(jié)果表明,通過(guò)與ADSCs/纖維蛋白支架的結(jié)合,移植組織在早期獲得了更高的血氧水平,組織血管生成增加,卵泡存活率升高[41]。

4.3 MSCs/細(xì)胞支架原位注射療法 MSCs原位注射療法,更易被接受,操作簡(jiǎn)單,更有望應(yīng)用于POF的臨床治療中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,MSCs治療能改善卵巢功能并提高生育能力。Ding等[42]研究發(fā)現(xiàn),膠原支架/臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UC-MSCss)通過(guò)磷酸化FOXO3a和FOXO1促進(jìn)小鼠原始卵泡激活,并抑制卵泡凋亡。隨后的臨床試驗(yàn)中,招募14例POF患者,將UC-MSCs或膠原支架/UC-MSCs移植到卵巢中,3個(gè)月后超聲檢查卵巢的體積和血流量來(lái)評(píng)估卵巢恢復(fù)情況。與移植前相比,移植后卵巢體積增加,且卵巢中未見間質(zhì)增生及其他卵巢異常結(jié)構(gòu)。3個(gè)UC-MSCs組的病例和3個(gè)膠原支架/UC-MSCs組的病例超聲顯示卵巢可見明顯血流信號(hào)(62.5%,5/8)膠原支架/UC-MSCs組患者移植后卵泡增生,膠原支架/UC-MSCs組中的1例和UC-MSCs組中的1例在接受移植后的一年內(nèi)成功妊娠。一項(xiàng)UC-MSCss聯(lián)合HA治療POF模型小鼠實(shí)驗(yàn)中,使用人GAPDH基因特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè),在體內(nèi)對(duì)UC-MSCss進(jìn)行了14d的追蹤以評(píng)估HA對(duì)移植的UC-MSCss在卵巢中停留時(shí)間的影響,添加HA組中,UC-MSCss移植后7d仍能觀察到PCR產(chǎn)物,而在無(wú)HA組中,3d后就檢測(cè)不到陽(yáng)性條帶。結(jié)果表明,HA在很大程度上延長(zhǎng)了UC-MSCss在卵巢中的停留時(shí)間。在POF小鼠模型中,將UC-MSCss/HA移植到卵巢后,cKit、p-cKit、p-AKT、p-S6K和p-rpS6表達(dá)水平有所恢復(fù),HE染色顯示卵巢中卵泡數(shù)增加,不同階段的卵泡占比均有上升,并驗(yàn)證了UC-MSCss增強(qiáng)HGF、VEGF、SCF和EGF等細(xì)胞因子的分泌,其中HGF通過(guò)激活PI3K-Akt通路促進(jìn)卵泡存活,且HA還協(xié)調(diào)增強(qiáng)UC-MSCss的旁分泌功能,并促進(jìn)這一過(guò)程[35]?？偟膩?lái)說(shuō),MSCs聯(lián)合細(xì)胞支架移植到卵巢內(nèi),可有效治療POF,改善卵巢內(nèi)分泌及生殖功能,提高女性的生育能力。

5 結(jié)論與展望

綜上所述,MSCs聯(lián)合細(xì)胞支架是治療POF的有效方法,各類細(xì)胞支架的使用無(wú)論從卵泡體外培養(yǎng)、卵巢組織移植或原位注射中均提高了MSCs療法的療效,且在體外卵泡培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中1%CS支架更具優(yōu)勢(shì)。雖然這一治療方法得到了學(xué)術(shù)界的認(rèn)可,但仍有許多問(wèn)題需更進(jìn)一步研究。目前的研究驗(yàn)證了MSCs通過(guò)旁分泌或自分泌、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)控基因表達(dá)等多種方式發(fā)揮治療作用[43],然而細(xì)胞之間的作用精細(xì)復(fù)雜,因治療涉及患者健康安全問(wèn)題,其治療機(jī)制、對(duì)機(jī)體的遠(yuǎn)期影響等仍需進(jìn)一步研究,探索優(yōu)化MSCs移植方案,以確定最佳注射部位以及MSCs的最佳治療劑量。盡管對(duì)MSCs的研究已深入到臨床實(shí)驗(yàn)階段,然而現(xiàn)有的MSCs制劑標(biāo)準(zhǔn)主要針對(duì)安全性(如病原體檢測(cè))和細(xì)胞類型(如分子標(biāo)記物)進(jìn)行檢測(cè),仍缺乏針對(duì)MSCs功能評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)。如何能快速選取功能強(qiáng)大的MSCs也將成為未來(lái)研究需攻克的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前支架制造材料種類繁多,制備方法各異,如何能構(gòu)造出安全、高效、性價(jià)比高的支架尚無(wú)定論。隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,相信在不久的將來(lái)MSCs治療能為眾多飽受POF煎熬的患者帶來(lái)福音。