李俊 崔蕾 李曉杰 曹愛蘭 張麗軍 杜文娟

摘要? ［目的］建立HPLC法測(cè)定葫蘆七不同部位（根、莖、葉）中7種倍半萜類化合物的含量。［方法］采用Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水（40∶60）；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；進(jìn)樣體積10 μL。［結(jié)果］7種被測(cè)成分在測(cè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.999 0）；平均回收率在95.18%～97.61%，RSD在0.41%～1.60%；被檢測(cè)的7種倍半萜類成分在葫蘆七根、莖、葉不同部位中的含量差異明顯，根中所含化合物的種類相對(duì)較多，含量相對(duì)較高。［結(jié)論］該方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于葫蘆七藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞? 葫蘆七；HPLC法；不同部位；倍半萜；含量測(cè)定

中圖分類號(hào)? R284? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A? 文章編號(hào)? 0517-6611（2024）01-0187-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.01.041

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Determination of Seven Sesquiterpenes in Different Parts of Ligularia fischeri by HPLC Method

LI Jun1，2，3， CUI Lei1，2，3， LI Xiao-jie2，3，4 et al

（1.Traditional Chinese Medicine Research Department，Shaanxi Chinese Medicine Institute （Shaanxi Pharmaceutical Information Centre），Xianyang，Shaanxi 712000;2.Shaanxi Province “Four Subjects and One Combination” Traditional Chinese Medicine Extraction and Separation and Preparation Process Engineering Technology Research Center， Xi’an， Shaanxi 710075;3.Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine and Natural Medicine Research and Development in Shaanxi Province， Xi’an， Shaanxi 710075;4. Shaanxi Pharmaceutical Holding Pharmaceutical Research Institute Co.， Ltd.， Xi’an， Shaanxi 710075）

Abstract? ［Objective］To establish a HPLC method determinate seven sesquiterpenes in different parts of Ligularia fischeri. ［Method］Chromatographic column was Kromasil C18 （4.6 mm）×250 mm， 5 μm）， mobile phase was acetonitrile water （40∶60）;column temperature was 35 ℃;detection wavelength was 240 nm;injection volume was 10 μL.［Result］The linearity of seven sesquiterpenes was good in the range of their mass concentration （R2≥0.999 0）;the average recovery rates were 95.18%-97.61%， RSDs were 0.41%-1.60%.The content of seven sesquiterpenoids detected in different parts of the root， stem and leaf of Ligularia fischeri were significantly different. The content and kinds of compounds in roots were higher than that in other parts. ［Conclusion］The method was fast， simple and accurate，and can be used for the quality control of Ligularia fischeri.

Key words? Ligularia fischeri;HPLC method;Different parts;Sesquiterpene;Content determination

基金項(xiàng)目? 陜西省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022SF-300） 。

作者簡(jiǎn)介? 李俊（1990—），女，湖北十堰人，主管藥師，碩士，從事中藥新藥及中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

收稿日期? 2023-02-08；修回日期? 2023-03-09

秦嶺太白山藥用植物種類繁多，起源古老，素有“藥山”和“寶山”之稱，是天然中草藥種質(zhì)基因庫，被稱為“中國(guó)天然植物園”，素有“秦地?zé)o閑草”的美譽(yù)。目前查明的藥用植物就有800多種，大多數(shù)為草本雙子葉植物，其中的草藥習(xí)慣上以“七”字命名，較為著名的就屬“太白七藥”［1］。太白七藥因其獨(dú)特的療效在民間享有一定信譽(yù)，在陜西大部分地區(qū)廣為流傳，主治多種疾病，療效顯著，具有重要的研究?jī)r(jià)值［2］，千百年來為陜西地區(qū)的農(nóng)村和山區(qū)的醫(yī)療保健事業(yè)發(fā)揮著不可低估的作用。

葫蘆七作為太白七藥的一種，是菊科橐吾屬植物腎葉橐吾［Ligularia fischeri（Ledeb）Turcz.］的干燥根及根莖，又名蹄葉橐吾（中藥志）、馬蹄葉（東北）、葫蘆七（陜西）、馬蹄當(dāng)歸（貴州）等，具有散寒潤(rùn)肺、溫肺下氣、鎮(zhèn)咳祛痰、理氣活血等功能，用于治療慢性支氣管炎、風(fēng)寒咳嗽氣喘、百日咳、肺癰、咯血、咽喉炎癥等，在民間有廣泛的應(yīng)用［2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，腎葉橐吾具有抗氧化、抗炎、增強(qiáng)免疫力、抗菌、抗?jié)兊人幚碜饔?。研究發(fā)現(xiàn)從不同產(chǎn)地的腎葉橐吾中分離得到的化合物主要是艾里莫酚烷型及桉葉烷型倍半萜，除此之外還有一些二萜、三萜、黃酮、甾體、酚類、生物堿類等化合物［3-11］。艾里莫酚型倍半萜是腎葉橐吾報(bào)道最多的一類成分，其結(jié)構(gòu)型大致可分為呋喃型、艾里莫酚烷型、艾里莫酚內(nèi)酯型3類［9-17］。除了化學(xué)成分的研究，近年來對(duì)腎葉橐吾的研究還包括微量元素、藥理作用等方面，對(duì)其質(zhì)量控制的研究報(bào)道比較少。因此，為了進(jìn)一步研究應(yīng)用和開發(fā)陜西這一特色藥用植物，有必要對(duì)其中的倍半萜類成分進(jìn)行分析和含量測(cè)定。前期在對(duì)葫蘆七進(jìn)行化學(xué)成分研究中，從葫蘆七中提取分離得到了7種倍半萜類化合物，該研究建立了 HPLC 法測(cè)定葫蘆七中這7種倍半萜類化合物的含量，并比較了不同部位（根、莖、葉）中這7種倍半萜類化合物的含量差別，以期進(jìn)一步明確腎葉橐吾的藥用部位，并為其資源的開發(fā)利用與藥材質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

1.1.1? 儀器。

Shimadzu LC 2010AHT型高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；KH-250E型超聲波清洗器（昆山禾利超聲儀器有限公司）； EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；AE240電子分析天平（中國(guó)梅特勒-托利多儀器廠）；UV-1800紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.1.2? 試劑。

乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；水為娃哈哈純凈水。

試驗(yàn)所用的7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品7α-H-11-羥基-艾里莫芬-1（10）-烯-2-酮（化合物1）、8β，10β-二羥基艾里莫芬-7（11）-烯-12，8α-內(nèi)酯（化合物2）、10β-羥基艾里莫芬-7（11）-烯-12，8α-內(nèi)酯（化合物3）、6β-羥基艾里莫芬-7（11）-烯-12，8β-內(nèi)酯（化合物4）、6α-羥基艾里莫芬-7（11）-烯-12，8α-內(nèi)酯（化合物5）、8α-羥基艾里莫芬-1（10），7（11）-二烯-12，8β-內(nèi)酯（化合物6）、 8β-羥基艾里莫芬-7（11）-烯-12，8α-內(nèi)酯（化合物7）均為從葫蘆七中分離得到，并經(jīng)波譜技術(shù)鑒定，HPLC峰面積歸一法測(cè)定，純度均大于98%，化合物結(jié)構(gòu)式見圖1。

1.1.3? 試材。

研究所用葫蘆七藥材采自陜西省西安市鄠邑區(qū)，植物標(biāo)本由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院劉霞教授鑒定為菊科腎葉橐吾［Ligularia fischeri（Ledeb）Turcz.］。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 色譜條件。

色譜柱為Kromasil C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B）=40∶60，等度洗脫，流速 1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，柱溫? 35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.2? 對(duì)照品貯備液的制備。

分別精密稱取化合物1、2、3、4、5、6、7各6.0、9.1、6.0、8.0、5.2、1.3、5.2 mg于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制濃度分別為1.20、1.82、1.20、1.60、1.04、0.26、1.04 mg/mL的對(duì)照品貯備液。各對(duì)照品貯備液置于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.2.3

對(duì)照品溶液的制備。分別精密量取各單一對(duì)照品儲(chǔ)備液500 μL，置5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。分別精密量取2 000、500、200、100、40、20、10、4 μL置于2 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得8個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液。

1.2.4? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。7個(gè)倍半萜對(duì)照品分別按“1.2.3”方法配制成不同濃度的對(duì)照品溶液。各對(duì)照品不同濃度的對(duì)照品溶液分別吸取10 μL注入液相色譜儀中，按“1.2.1”色譜條件，依次分析，測(cè)得各峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)、對(duì)照品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.5? 供試品溶液的制備。

取葫蘆七根、莖、葉粗粉各5 g，精密稱定，加入甲醇200 mL，超聲提取2次，每次1 h（功率300 W，頻率45 kHz），濾過，合并2次濾液，減壓蒸干，加入甲醇超聲使其成混懸液，將其轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 對(duì)照品與樣品的高效液相色譜圖

分別精密吸取各單一對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0.120 mg/mL（化合物1）、0.182 mg/mL（化合物2）、0.120 mg/mL（化合物3）、0.160 mg/mL（化合物4）、0.104 mg/mL（化合物5）、0.026 mg/mL（化合物6）、0.104 mg/mL（化合物7）的混合對(duì)照品溶液，在“1.2.1”色譜條件下，進(jìn)樣混合對(duì)照品溶液及“1.2.5”項(xiàng)下葫蘆七供試品溶液，色譜圖見圖2。

2.2? 線性關(guān)系考察

以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。各對(duì)照品的線性回歸方程見表1。通過計(jì)算確定各目標(biāo)化合物的檢測(cè)限（S/N=3）和定量限（S/N=10）。試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），各化合物在考察濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.999 0）。

2.3? 精密度試驗(yàn)

按“1.2.1”色譜條件，分別對(duì)質(zhì)量濃度為0.012 0 mg/mL（化合物1）、0.018 2 mg/mL（化合物2）、0.012 0 mg/mL（化合物3）、0.016 0 mg/mL（化合物4）、0.010 4 mg/mL（化合物5）、0.002 6 mg/mL（化合物6）、0.010 4 mg/mL（化合物7）的混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算精密度，RSD分別為0.38%、1.32%、1.08%、1.73%、0.42%、1.01%、1.38%，表明儀器精密度良好。

2.4? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取葫蘆七根粗粉5.0 g，精密稱定，按“1.2.5”方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18 h進(jìn)樣分析，記錄各組分色譜峰的峰面積。經(jīng)計(jì)算，7個(gè)組分各自色譜峰峰面積的RSD分別為0.68%、0.91%、1.10%、0.78%、0.93%、1.20%、1.30%，表明供試品溶液在室溫下18 h內(nèi)不會(huì)發(fā)生較大變化。

2.5? 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取葫蘆七根粗粉5.0 g共6份，精密稱定，按“1.2.5”方法制備供試品溶液，依次測(cè)定藥材中7種倍半萜化合物的含量。結(jié)果顯示，6份樣品測(cè)出7個(gè)組分色譜峰峰面積的RSD分別為0.55%、0.76%、1.08%、0.89%、1.01%、0.98%、0.85%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6? 加樣回收率

取已知含量的葫蘆七根粗粉6份，每份約2.5 g，精密稱定，再分別精密加入質(zhì)量濃度分別為1.20 mg/mL（化合物1）、1.82 mg/mL（化合物2）、1.20 mg/mL（化合物3）、1.60 mg/mL（化合物4）、1.04 mg/mL（化合物5）、0.26 mg/mL（化合物6）、1.04 mg/mL（化合物7）的對(duì)照品溶液適量，按照“1.2.5”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，試驗(yàn)結(jié)果見表2。從表2可以看出，平均加樣回收率在95.18%～97.61%，RSD在0.41%～1.60%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.7? 樣品測(cè)定

分別精密稱取葫蘆七的根、莖、葉粗粉5.0 g，按照“1.2.5”方法制備供試品溶液，按照“1.2.1”色譜條件，對(duì)7個(gè)目標(biāo)化合物進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算各目標(biāo)化合物的含量，結(jié)果見表3。從表3可以看出，只有化合物3和化合物6在葫蘆七藥材的根、莖、葉中均能檢測(cè)到，其中化合物3在各個(gè)部位的含量從高到低依次為葉、莖、根，化合物6在各個(gè)部位的含量從高到低依次為根、莖、葉；其他化合物只在葫蘆七的部分部位被檢測(cè)到，其中化合物1和化合物4僅在根中含有，化合物2、化合物5和化合物7在根、葉中含有；被檢測(cè)的7種倍半萜類成分在葫蘆七根、莖、葉不同部位中的含量差異明顯。根中可以檢測(cè)到7種化合物（化合物1、2、3、4、5、6、7），葉中能檢測(cè)到5種（化合物2、3、5、6、7）；莖中僅能檢測(cè)到2種化合物（化合物3、6）。比較各個(gè)部位所含化合物發(fā)現(xiàn)，根中所含化合物的種類相對(duì)較多，含量相對(duì)較高。在民間有將腎葉橐吾地下部分根和根莖入藥的習(xí)慣，有本草依據(jù)和相當(dāng)長(zhǎng)的用藥歷史，可追溯到宋代蘇頌著的《圖經(jīng)本草》，該研究更是為這一傳統(tǒng)用藥習(xí)慣提供了試驗(yàn)依據(jù)。

3? 討論

3.1? 波長(zhǎng)選擇

對(duì)各對(duì)照品進(jìn)行全波長(zhǎng)（190～400 nm）掃描，綜合考慮和比較各目標(biāo)化合物在紫外下的最大吸收波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)在 240 nm下7個(gè)目標(biāo)化合物均有較強(qiáng)的紫外吸收，所以選擇240 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2? 流動(dòng)相選擇

為了使各目標(biāo)化合物的色譜峰得到更好的分離，應(yīng)選擇一個(gè)合適的流動(dòng)相體系。該研究考察了甲醇-水和乙腈-水的流動(dòng)相系統(tǒng)，后者的洗脫效果好于前者，所以采用乙腈-水系統(tǒng)，經(jīng)過多次試驗(yàn)最終確定乙腈-水為40∶60，峰形良好。

4? 結(jié)論

目前，葫蘆七藥材一直未列入陜西省地方標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家藥典，限制了其進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用，致使葫蘆七產(chǎn)業(yè)的發(fā)展較慢，急需建立葫蘆七藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。該研究首次對(duì)葫蘆七中7 種倍半萜類成分進(jìn)行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同部位中各成分含量差異較大，同一部位不同化合物間的含量差異也很大；其中根中所含化合物的種類相對(duì)較多，含量相對(duì)較高，該研究結(jié)果為其在民間將根和根莖入藥的這一傳統(tǒng)用藥習(xí)慣提供了試驗(yàn)依據(jù)。該研究建立的 HPLC 測(cè)定方法簡(jiǎn)便快速、分離度好、結(jié)果穩(wěn)定可靠，可以為葫蘆七藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］龔寧波，王樹春，張麗，等.“太白七藥”植物群的X射線衍射Fourier指紋圖譜鑒別研究［Ｊ］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29（10）：713-716.

［2］郭增軍，卜筱茜，王軍憲，等.陜西 “七藥”植物資源及研究概要［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志，2006，15（2）：79-81，124.

［3］樸香蘭，秘效媛，樸惠善，等.蹄葉橐吾中脂溶性成分的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（10）：2410-2411.

［4］李俊平.千里光及蹄葉橐吾化學(xué)成分研究［D］.鄭州：鄭州大學(xué)，2010.

［5］尤婷婷，姜 燕，張海悅，等.蹄葉槖吾葉多糖提取工藝優(yōu)化及單糖組成研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016，28（1）：136-141.

［6］PIAO X L，MI X Y，JANG Y P，et al.Determination of hyperoside and 2″-acetylhyperoside from Ligularia fischeri by high performance liquid chromatography［J］.Food chemistry，2011，129（1）：213-216.

［7］李俊平，王彩芳，劉婷，等.河南蹄葉橐吾根的化學(xué)成分研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011，23（6）：1014-1016.

［8］WANG W S，GAO K，YANG L，et al.Eremophilenolides from Ligularia fischeri［J］.Planta medica，2000，66（2）：189-191.

［9］PARK H J，KWON S H，YOO K O，et al.Sesquiterpenes from the leaves of Ligularia fischeri var.spiciformis［J］.Planta Medica，2000，66（8）：783-784.

［10］DENG M C，DONG W W，JIAO W，et al.New eremophilane sesquiterpenes from the roots of Ligularia fischeri［J］.Helvetica chimica acta，2009，92（3）：495-501.

［11］XIE W D，WENG C W，LI X，et al.Eremophilane sesquiterpenoids from Ligularia fischeri［J］.Helvetica chimica acta，2010，93（10）：1983-1989.

［12］XIE W D，LIU Y H，WENG C W，et al.Fischelactone B：A new eremophilane dimer from Ligularia fischeri［J］.Journal of the Chinese chemical society，2011，58（3）：412-414.

［13］ZHANG W J，LI X H，SHI Y P.A pair of epimeric spirosesquiterpenes from the roots of Ligularia fischeri［J］.Journal of natural products，2010，73（2）：143-146.

［14］GUO Z，WENG C W，LIU W X，et al.A new norsesquiterpenoid from the roots of Ligularia fischeri［J］.Journal of chemical research，2010，34（7）：390-391.

［15］WANG W S，ZHU Q X，GAO K，et al.Sesquiterpenes from Ligularia fischeri［J］.Journal of the Chinese chemical society，2000，47（6）：1291-1293.

［16］鄧美彩，焦威，董瑋瑋，等.蹄葉橐吾根的化學(xué)成分研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21（5）：776-778，836.

［17］LEE K T，KOO S J，JUNG S E，et al.Structure of three new terpenoids，spiciformisins a and b，and monocyclosqualene，isolated from the herbs of Ligularia fischeri var.spiciformis and cytotoxicity［J］.Archives of pharmacal research，2002，25（6）：820-823.