陳建榮,徐雨茶,陽麗艷,黃艷冰,楊登峰,潘麗霞**

(1.廣西科學(xué)院,非糧生物質(zhì)能技術(shù)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530007;2.廣西科學(xué)院,廣西海洋科學(xué)院(廣西紅樹林研究中心),廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530007)

蝦蟹是世界漁業(yè)生產(chǎn)的重要產(chǎn)品,近年來每年蝦蟹總產(chǎn)量高達(dá)1 000萬噸,蝦蟹在剝離可食部分后會(huì)產(chǎn)生大量固體廢棄物,包括頭部、殼體和尾部[1],這些固體廢棄物在生產(chǎn)和消費(fèi)過程中不可避免。然而,這些廢棄物在環(huán)境保護(hù)和資源利用方面具有巨大的潛力。蝦殼中含有約50%的蛋白質(zhì)、20%的幾丁質(zhì)以及天然抗氧化劑蝦青素等有價(jià)值的組分,這些組分在蝦殼中相互緊密結(jié)合,不能被動(dòng)物有效消化吸收利用[1,2]。傳統(tǒng)的強(qiáng)酸堿等加工工藝破壞了蝦蟹殼中的蛋白質(zhì)和其他有價(jià)值組分,會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和生物資源浪費(fèi)[3]。在一些發(fā)達(dá)國家,處理蝦蟹殼廢棄物花費(fèi)了高昂的成本[4]。因此,如何綜合利用蝦蟹殼廢棄物是亟需解決的問題,同時(shí),如何降解動(dòng)物難以消化吸收的幾丁質(zhì)為高值的益生幾丁寡糖也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一。

幾丁質(zhì),又稱甲殼素,是一種含氮多糖,由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-Nacetyl-D-glucosamine,Glc-NAc) 聚合而成,它是自然界中除纖維素外的第二大生物質(zhì),在甲殼類動(dòng)物的外骨骼和大多數(shù)真菌的細(xì)胞壁中存在[5]。與纖維素等多糖不同,幾丁質(zhì)是N-乙酰-D-氨基葡萄糖經(jīng)β-1,4糖苷鍵聚合形成的含氮多糖,地球上幾丁質(zhì)的含氮量超過人類通過Haber-Bosch方法(氮肥合成的方法)固定的氮?dú)饪偭?其產(chǎn)物N-乙酰-D-氨基葡萄糖及幾丁寡糖具有較好的生理功能。在哺乳動(dòng)物中,N-乙酰-D-氨基葡萄糖是透明質(zhì)酸和關(guān)節(jié)滑液合成的重要前體[6]。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)(包括轉(zhuǎn)錄因子)存在N-乙酰葡萄糖胺修飾,并調(diào)控了眾多的免疫激活、代謝調(diào)節(jié)等通路,這些機(jī)制賦予了幾丁寡糖豐富的生物學(xué)活性,包括美顏、緩解關(guān)節(jié)炎、血糖調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗炎作用等[7-9]。因此,越來越多的人開始關(guān)注幾丁質(zhì)及其水解產(chǎn)物的價(jià)值。

目前工業(yè)上對(duì)蝦蟹殼廢棄物的利用主要是通過化學(xué)法去除蝦蟹殼廢棄物中的礦物質(zhì)和蛋白質(zhì),再生產(chǎn)幾丁質(zhì)、殼聚糖和幾丁寡糖等物質(zhì)。Percot等[10]對(duì)現(xiàn)有化學(xué)法生產(chǎn)幾丁質(zhì)的條件進(jìn)行了優(yōu)化,最終獲得了脫礦度和脫蛋白度都很高的幾丁質(zhì),但是處理過程中仍然會(huì)大量使用鹽酸和氫氧化鈉,不僅對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染,而且導(dǎo)致幾丁質(zhì)N-乙酰值的變化從而影響產(chǎn)品品質(zhì)。為了解決化學(xué)法降解蝦蟹殼中蛋白質(zhì)等物質(zhì)存在的問題,人們開始利用酶法和微生物法降解蝦蟹殼。酶法包括使用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和消化酶等,但酶的成本較高、提取效率低。微生物法主要通過發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的蛋白酶和有機(jī)酸實(shí)現(xiàn)脫蛋白和脫礦,從而使幾丁質(zhì)暴露出來[3,7,11]。

微生物處理法的優(yōu)點(diǎn)在于實(shí)現(xiàn)資源重新利用的同時(shí)不會(huì)產(chǎn)生過多對(duì)環(huán)境有害的物質(zhì),這種方法有潛力解決蝦蟹殼廢棄物處理的問題。然而,目前微生物處理法還處在探索階段,限制了其實(shí)際應(yīng)用。此外,微生物降解蝦蟹殼涉及的過程也相對(duì)復(fù)雜,需要進(jìn)一步研究和優(yōu)化[8,12]。因此,本研究旨在尋找能夠高效降解蝦蟹殼的微生物,有效地將蝦蟹殼廢棄物轉(zhuǎn)化為有用的產(chǎn)物,如生物肥料、動(dòng)物飼料或生物能源;優(yōu)化目標(biāo)微生物降解蝦蟹殼廢棄物的降解條件,實(shí)現(xiàn)蝦蟹殼廢棄物的綜合利用,減輕對(duì)環(huán)境的負(fù)荷。因此,研究蝦蟹殼降解微生物對(duì)資源利用和環(huán)境保護(hù)都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑和原料

蝦殼為溫州洞頭特產(chǎn)蝦殼(購自洞頭特產(chǎn)漁夫之家淘寶店),50℃烘箱烘干剪碎后過40目篩,滅菌烘干備用。

1.2 菌種土樣來源

將新鮮的土樣樣品活化并篩選出能高效降解幾丁質(zhì)的細(xì)菌。這些土樣樣品分別從廣西河池市天峨縣川洞,巴馬瑤族自治縣長壽村,盤陽河流域,都安瑤族自治縣桃花水母天窗、九靈天窗,百色市樂業(yè)石圍天坑群等地采集。

1.3 培養(yǎng)基配方

配方中含有糖的培養(yǎng)基滅菌溫度為115℃,時(shí)間為持續(xù)15 min;而其他培養(yǎng)基的滅菌溫度為121℃,時(shí)間為持續(xù)20 min。

(1)液體富集培養(yǎng)基1 000 m L:FeSO4·7 H2O 0.01 g,MgSO4·7H2O 0.6 g,膠體幾丁質(zhì)10 g,K2HPO40.7 g,KH2PO40.3 g,初始p H 值7.0。

(2)分離培養(yǎng)基1 000 m L:K2HPO40.3 g,NaCl 0.1 g,FeSO4·7 H2O 0.01 g,NH4Cl 0.1 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO40.7 g,膠體幾丁質(zhì)10 g,瓊脂15-20 g,初始p H 值7.0。

(3)種子培養(yǎng)基1 000 m L:葡萄糖4 g,KH2PO40.7 g,K2HPO40.3 g,MgSO4·7 H2O 0.6 g,酵母粉2 g,蛋白胨2 g,p H 值7.0。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)基1 000 m L:果糖2 g,KH2PO40.7 g,K2HPO40.3 g,MgSO4·7H2O 0.6 g,酵母粉0.5 g,牛肉膏4 g,蛋白胨4 g,初始p H 值8.0。

1.4 富集培養(yǎng)

取1 g土壤樣品加入30 m L 無菌水中,30℃、200 r/min培養(yǎng)6 h,充分混合后,取上清液置于富集培養(yǎng)基中,30℃、150 r/min恒溫?fù)u床下培養(yǎng)3 d,得到富集的菌樣。

1.5 幾丁質(zhì)降解菌的篩選與純化

平板透明圈法是篩選幾丁質(zhì)菌的一種高效方法,即在固體培養(yǎng)基中加入溶解性差、可被微生物利用的營養(yǎng)成分,造成渾濁、不透明的培養(yǎng)基背景,待篩選的菌落附近就會(huì)形成透明圈,透明圈的大小反映了菌落降解此物質(zhì)的能力[13,14]。吸取富集菌的培養(yǎng)液按10-3-10-4梯度稀釋后,每個(gè)稀釋梯度取100μL 均勻地涂覆在分離培養(yǎng)基中并于30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng),定期觀察。挑取菌落周圍出現(xiàn)透明圈較大的菌落進(jìn)行4區(qū)劃線純化。

1.6 菌株的鑒定

以27F 和1492R 作為引物,以菌體作為模板。按表1配制成25μL的體系后進(jìn)行PCR 反應(yīng)擴(kuò)增并對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。選出有目的片段的PCR 產(chǎn)物,送至生工生物工程(上海)股份限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果提交美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)官網(wǎng)上的BLAST 對(duì)16S r DNA 序列進(jìn)行分析,確定菌株的分類地位。實(shí)驗(yàn)使用25μL體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,程序建立如表2所示,反應(yīng)共30個(gè)循環(huán)。

表2 PCR 程序Table 2 PCR procedure

1.7 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌種直徑比的測(cè)定

將篩選到的菌種接種于種子培養(yǎng)基中,25℃、180 r/min培養(yǎng)12 h,用牙簽蘸取少量菌液接種于分離培養(yǎng)基中并于30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng),定期測(cè)量透明圈和菌株的大小,并通過兩者的比值確定該菌株的直徑比。

1.8 幾丁質(zhì)粗酶活力測(cè)定

1.9 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株降解蝦殼條件的優(yōu)化

取蝦殼烘干并剪碎后過40目篩,滅菌后烘干備用。將C.aquatilegxas1菌種接種于種子培養(yǎng)基中,25℃、180 r/min培養(yǎng)12 h,接種于100 m L 發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h后,按照2%的添加量加入過篩后的蝦殼進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)條件優(yōu)化,通過不同培養(yǎng)條件發(fā)酵后蝦殼的損耗量選擇最佳培養(yǎng)條件。

1.9.1 氮源對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株降解蝦殼能力的影響

以不加蝦殼廢棄物的發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照組,在溫度為30℃、p H 值為7的發(fā)酵條件下發(fā)酵7 d,選擇牛肉膏(0.8%)、蛋白胨(0.8%)、麥芽提取物(0.8%)以及牛肉膏+蛋白胨(0.4%+0.4%)作為氮源,探究不同氮源對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株降解蝦殼能力的影響,每組設(shè)3個(gè)平行樣,其他培養(yǎng)基成分為葡萄糖2 g/L,KH2PO40.7 g/L,K2HPO40.3 g/L,MgSO4·7 H2O 0.6 g/L,酵母粉0.5 g/L。

1.9.2 碳源對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株降解蝦殼能力的影響

在溫度為30℃、p H 值為7的發(fā)酵條件下發(fā)酵7 d,選擇葡萄糖、果糖、蔗糖以及麥芽糖作為碳源探究不同碳源對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株降解蝦殼能力的影響,每組設(shè)3個(gè)平行樣,其他培養(yǎng)基成分為KH2PO40.7 g/L,K2HPO40.3 g/L,MgSO4·7 H2O 0.6 g/L,酵母粉0.5 g/L,牛肉膏4 g/L,蛋白胨4 g/L。

1.9.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株降解蝦殼能力的影響

在溫度為30℃、p H 值為7的發(fā)酵條件下,確定最優(yōu)碳源和氮源后,設(shè)置發(fā)酵時(shí)間分別為3、5、7、9 d,每組設(shè)3個(gè)平行樣,探究不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株降解蝦殼能力的影響。

1.9.4 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株降解蝦殼能力的影響

在p H 值為7、最優(yōu)碳源和氮源的發(fā)酵條件下發(fā)酵9 d,設(shè)置發(fā)酵溫度分別為20、25、30、37℃,每組設(shè)3個(gè)平行樣,探究發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株降解蝦殼能力的影響。

1.9.5 發(fā)酵接種量對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株降解蝦殼能力的影響

在溫度為20℃、p H 值為7、最優(yōu)碳源和氮源的發(fā)酵條件下發(fā)酵9 d,設(shè)置發(fā)酵接種量分別為0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%,每組設(shè)3個(gè)平行樣,探究發(fā)酵接種量對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株降解蝦殼能力的影響。

1.9.6 初始p H 值對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株降解蝦殼能力的影響

在溫度為20℃、最優(yōu)碳源和氮源、接種量為2.0%的條件下發(fā)酵9 d,設(shè)置發(fā)酵初始p H 值分別為6.0、7.0、7.2、8.0,每組設(shè)3個(gè)平行樣,探究初始p H值對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株降解蝦殼能力的影響。

1.10 蝦殼降解率的測(cè)定

稱取經(jīng)過發(fā)酵處理或未經(jīng)發(fā)酵處理的蝦殼0.2 g,烘干,稱重,得到經(jīng)過發(fā)酵處理或未經(jīng)發(fā)酵處理的干蝦殼的重量,根據(jù)公式計(jì)算發(fā)酵處理后蝦殼的降解率。計(jì)算公式如下:

式中,X為蝦殼的降解率,m0為未經(jīng)發(fā)酵處理的干蝦殼的質(zhì)量,m為經(jīng)過發(fā)酵處理的干蝦殼的質(zhì)量。

1.11 微生物降解蝦殼過程中的生長曲線及p H 值變化

將C.aquatilegxas1菌種接種于種子培養(yǎng)基中,30℃、160 r/min培養(yǎng)24 h,得到活化菌液。取活化菌液以2.0%接種量接種于100 m L發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后得到菌液,在所得菌液中加入2 g蝦殼,20℃發(fā)酵培養(yǎng)9 d,每12 h 取發(fā)酵液,檢測(cè)發(fā)酵液的OD600和p H 值。

1.12 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

在最佳條件下發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束后,離心,棄上清,沉淀為樣品蝦殼。以未經(jīng)過發(fā)酵處理的相同質(zhì)量的蝦殼為對(duì)照,利用凱式定氮法[16]檢測(cè)兩種蝦殼中蛋白質(zhì)的含量。具體檢測(cè)方法:將蝦殼(經(jīng)過發(fā)酵處理的樣品蝦殼或未經(jīng)過發(fā)酵處理的蝦殼)分別用15 m L 1 mol/L NaOH處理4 h(攪拌2 h,60℃干燥箱放置2 h)進(jìn)行脫蛋白處理,處理結(jié)束后12 000 r/min離心10 min,取上清液作液體樣品;用等量的1 mol/L NaOH 為空白對(duì)照;在實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組分別加入3 g催化劑(硫酸銅和硫酸鉀)和10 m L 濃硫酸進(jìn)行消化,然后放入消化爐中,蓋上漏斗蓋子,同時(shí)打開水閥循環(huán)吸收氣體;冷卻之后將50 m L 水倒入消化管中(加水前先將樣品搖勻),然后每個(gè)管加入過量NaOH;打開自動(dòng)定氮儀,首先用水清洗一遍機(jī)子,然后開始過樣品,同時(shí)放置裝有硼酸的接收瓶(每個(gè)樣5 min),最后在裝有硼酸的接收瓶里加入指示劑進(jìn)行鹽酸滴定、空白滴定,液體顏色由藍(lán)變紅即為滴定終點(diǎn)。計(jì)算公式如下:

式中,X為蛋白質(zhì)含量,V1為空白對(duì)照滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)溶液(m L),V2為樣品滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)溶液(m L),c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L),m為樣品質(zhì)量(g),0.014為氮的毫摩爾質(zhì)量(g/mmol),F為蛋白質(zhì)系數(shù),100 為單位換算系數(shù)。根據(jù)公式計(jì)算脫蛋白率。

脫蛋白率(%)=(未經(jīng)發(fā)酵處理的蝦殼中蛋白質(zhì)的含量-樣品蝦殼中蛋白質(zhì)的含量)/未經(jīng)發(fā)酵處理的蝦殼中蛋白質(zhì)的含量×100%。

1.13 幾丁質(zhì)含量的測(cè)定

根據(jù)張恒[17]的方法提取幾丁質(zhì)。分別稱取經(jīng)過發(fā)酵處理或未經(jīng)發(fā)酵處理的蝦殼0.2 g 與15 m L 1 mol/L NaOH 溶液混合后放到攪拌器上攪拌30 min,接著放入干燥箱內(nèi)干燥2.5 h,重復(fù)兩次;然后離心機(jī)離心(12 000 r/min、5 min),倒掉上清后用水將蝦殼反復(fù)離心清洗至中性;再取15 m L 2 mol/L HCl溶液和蝦殼一起倒入小燒杯中常溫?cái)嚢? h,結(jié)束后離心機(jī)12 000 r/min離心5 min,棄上清液并用去離子水反復(fù)沖洗并離心,直至p H 為中性,最后放入干燥箱內(nèi)干燥后稱重,得到經(jīng)過發(fā)酵處理或未經(jīng)發(fā)酵處理的蝦殼中幾丁質(zhì)的含量。其中用NaOH 和HCl溶液處理的目的是分別去除蝦殼中的蛋白質(zhì)和鈣離子。計(jì)算幾丁質(zhì)的回收率。

幾丁質(zhì)的回收率(%)=(未經(jīng)發(fā)酵處理的蝦殼中幾丁質(zhì)的含量-經(jīng)發(fā)酵處理的蝦殼中幾丁質(zhì)的含量)/未經(jīng)發(fā)酵處理的蝦殼中幾丁質(zhì)的含量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾丁質(zhì)降解菌的篩選及其分離純化

樣品經(jīng)富集培養(yǎng)、分離純化后得到了4株具有降解幾丁質(zhì)能力的細(xì)菌。表3是經(jīng)過篩選得到的4株菌株的測(cè)序鑒定結(jié)果,其中粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescensgxas3 與S.marcescensstrain 27F 相似性為98.41%,蠟樣芽孢桿菌B.cereusgxas5與B.cereusstrain NS26相似性為99.36%,嗜麥芽糖窄食單胞菌Stenotrophomonasmaltophiliagxas7與S.maltophiliastrain BF4-4相似性為99.45%,水生幾丁質(zhì)菌C.aquatilegxas1 與C.aquatilestrain PS4R-81相似性為97.5%。

表3 菌株測(cè)序鑒定結(jié)果Table 3 Results of sequencing identification of strains

2.2 菌落透明圈及粗酶活力測(cè)定

如表4所示,B.cereusgxas5的直徑比最大,為4.8,其次為C.aquatilegxas1 和Serratiamarcescensgxas3,Stenotrophomonasmaltophiliagxas7最小。

表4 菌落透明圈直徑Table 4 Diameter of colony transparent circle

選擇B.cereusgxas5、Serratiamarcescensgxas3和C.aquatilegxas1進(jìn)行粗酶活力測(cè)定,探究不同菌株的產(chǎn)酶情況,結(jié)果如圖1所示。這3株菌在不同時(shí)期其產(chǎn)酶活力也不同,其中S.marcescensgxas3在發(fā)酵72 h時(shí)粗酶活力最高,達(dá)到0.20 U/m L;B.cereusgxas5 在發(fā)酵36 h 時(shí)粗酶活力最高,達(dá)到0.158 U/m L;C.aquatilegxas1在發(fā)酵96 h時(shí)粗酶活力最高,達(dá)到0.244 U/m L。

圖1 幾丁質(zhì)高效降解菌株粗酶活力Fig.1 Crude enzyme activity of chitin-degrading strain

2.3 蝦殼最適降解發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 氮源的優(yōu)化

氮源對(duì)發(fā)酵降解蝦殼廢棄物的降解率如圖2所示。采用菌株C.aquatilegxas1處理蝦殼,培養(yǎng)基以牛肉膏+蛋白胨為氮源時(shí)的降解能力最強(qiáng),為48%,比牛肉膏、蛋白胨和麥芽提取物分別高4%、4%和2%,因此選擇牛肉膏+蛋白胨(0.4%+0.4%)為發(fā)酵氮源。

圖2 氮源對(duì)蝦殼降解的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on shrimp shell degradation

2.3.2 碳源的優(yōu)化

由圖3可知,4種碳源對(duì)菌株C.aquatilegxas1的產(chǎn)量和生長狀況的影響存在差異,其中以果糖作為碳源為C.aquatilegxas1提供能量時(shí)對(duì)蝦殼的降解率最高,為50%,而以麥芽糖和葡萄糖作為碳源時(shí)對(duì)C.aquatilegxas1的影響較大,其中蔗糖對(duì)蝦殼的降解率最低,為37%。因此選擇果糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

圖3 碳源對(duì)蝦殼降解的影響Fig.3 Effects of carbon sources on shrimp shell degradation

2.3.3 發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

發(fā)酵時(shí)間對(duì)蝦殼降解影響較大。如圖4所示,當(dāng)菌株C.aquatilegxas1對(duì)蝦殼發(fā)酵到第9 d時(shí),降解能力最優(yōu)。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蝦殼降解的影響Fig.4 Effects of fermentation time on shrimp shell degradation

2.3.4 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

發(fā)酵溫度對(duì)蝦殼降解的影響如圖5所示。當(dāng)溫度為20℃時(shí),菌株C.aquatilegxas1對(duì)蝦殼的降解能力最優(yōu)。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)蝦殼降解的影響Fig.5 Effects of fermentation temperatures on shrimp shell degradation

2.3.5 發(fā)酵接種量的優(yōu)化

發(fā)酵接種量對(duì)蝦殼降解的影響如圖6所示。當(dāng)發(fā)酵接種量為2.0%時(shí),菌株C.aquatilegxas1對(duì)蝦殼的降解能力最強(qiáng);當(dāng)菌液接種量小于2.0%時(shí),C.aquatilegxas1對(duì)蝦殼的降解能力有所下降。因此,采用C.aquatilegxas1降解蝦殼時(shí),最佳菌液接種量為2.0%。

圖6 發(fā)酵接種量對(duì)蝦殼降解的影響Fig.6 Effects of fermentation inoculation amount on shrimp shell degradation

2.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)基初始p H 值的優(yōu)化

微生物在生長代謝過程中會(huì)引起培養(yǎng)環(huán)境p H值的變化,p H 值過高或過低都會(huì)影響其進(jìn)一步的生長。如圖7所示,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基初始p H 值分別為6.0、7.0、7.2、8.0時(shí),菌株C.aquatilegxas1對(duì)蝦殼的降解能力差別較小。當(dāng)初始p H 值為8.0 時(shí),C.aquatilegxas1對(duì)蝦殼的降解能力最強(qiáng),為46%。

圖7 發(fā)酵培養(yǎng)基初始p H 值對(duì)蝦殼降解的影響Fig.7 Effects of initial p H values of fermentation media on shrimp shell degradation

2.4 菌株C.aquatile gxas1降解蝦殼過程中的生長狀況及p H 值變化

如圖8所示,C.aquatilegxas1在降解蝦殼過程中,OD600值在加入蝦殼的第1天至第2天呈快速上升趨勢(shì),第2天至第7天緩慢上升,菌株生長趨于穩(wěn)定。如圖9所示,p H 值在加入蝦殼的前兩天呈快速上升趨勢(shì),之后呈緩慢上升趨勢(shì)。

圖8 菌株C.aquatile gxas1降解蝦殼的生長曲線Fig.8 Growth curve of strain C .aquatile gxas1 in the treatment of shrimp shell

圖9 菌株C.aquatile gxas1降解蝦殼的p H 值變化曲線Fig.9 p H value variation curve of strain C.aquatile gxas1 in the treatment of shrimp shell

2.5 菌株C.aquatile gxas1發(fā)酵蝦殼最優(yōu)試驗(yàn)

單因素優(yōu)化試驗(yàn)得出,C.aquatilegxas1發(fā)酵蝦殼試驗(yàn)最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為果糖、氮源為牛肉膏+蛋白胨,最優(yōu)發(fā)酵條件初始p H 值為8.0、接種量為2.0%、發(fā)酵天數(shù)為9 d、發(fā)酵溫度為20℃。在最優(yōu)條件下進(jìn)行菌株降解蝦殼試驗(yàn),最終得出C.aquatilegxas1對(duì)蝦殼的降解率為60%,其中幾丁質(zhì)回收率為87%、脫蛋白率為76.77%。

3 討論

與傳統(tǒng)對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重的化學(xué)法和能耗高的物理法相比,利用微生物發(fā)酵法降解蝦蟹殼廢棄物中的幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)是一種更綠色環(huán)保、成本更低的方法,可進(jìn)一步作為未來實(shí)現(xiàn)綠色降解蝦蟹殼廢棄物的方向。本研究篩選到一株能夠降解幾丁質(zhì)的菌株C.aquatilegxas1并探究其降解蝦蟹殼的能力。通過單因素優(yōu)化試驗(yàn)確定了培養(yǎng)基的最佳碳源為果糖(0.2%),最佳氮源為牛肉膏+ 蛋白胨(0.4% +0.4%);最優(yōu)發(fā)酵條件初始p H 值為8.0,接種量為2.0%,培養(yǎng)溫度為20℃。在上述最優(yōu)條件下,菌株C.aquatilegxas1在第9 d時(shí)達(dá)到蝦殼最大降解率60%,其中,脫蛋白率為76.77%,幾丁質(zhì)回收率為87%,優(yōu)于銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa[18]、植物乳桿菌和蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis[19]。表5列舉了近年來微生物降解蝦殼廢棄物的一些研究。Li等[20]利用發(fā)酵乳桿菌L.fermuntum使蝦殼脫蛋白率、脫礦率以及幾丁質(zhì)回收率分別為89.48%、85.11%和16.30%。菌酶連用、連續(xù)發(fā)酵或共發(fā)酵可提高蝦殼的脫蛋白率和脫礦率。Zhang等[21]利用S.marcescensB742 和L.plantarumATCC 8014對(duì)蝦殼進(jìn)行處理,蝦殼的脫礦率和脫蛋白率分別為93%和94.50%。Zhang等[22]采用枯草芽孢桿菌B.subtilis和巴氏醋桿菌A.pasteurianus、Liu等[23]采用鼠李糖乳桿菌L.rhamnoides和戊酸芽孢桿菌B.amyloliquefaciens對(duì)蝦殼進(jìn)行共發(fā)酵,蝦殼的脫礦率和脫蛋白率均達(dá)到90%以上。影響微生物降解蝦殼的因素主要包括發(fā)酵p H 值、接種量、溫度、預(yù)處理和發(fā)酵時(shí)間等。嚴(yán)金紅等[26]研究發(fā)現(xiàn),不同有機(jī)酸對(duì)蝦殼的軟化程度不同。Rao等[27]通過調(diào)節(jié)發(fā)酵初始p H 值以及調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中糖的添加量,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中p H 值的變化對(duì)蝦殼中灰分和蛋白質(zhì)的去除有較大影響。

表5 微生物降解蝦殼國內(nèi)外研究Table 5 Domestic and foreign research on microbial degradation of shrimp shell

本研究只測(cè)定了菌株C.aquatilegxas1發(fā)酵蝦殼后的蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)含量變化,其脫礦率及產(chǎn)物等仍需要進(jìn)一步分析。除此之外,連續(xù)發(fā)酵或共發(fā)酵也被用于降解蝦殼,未來仍需進(jìn)一步探究C.aquatilegxas1與其他菌株連續(xù)發(fā)酵或共發(fā)酵對(duì)蝦殼降解率的影響,為微生物降解蝦蟹殼提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

對(duì)來源于廣西河池市和百色市的土壤進(jìn)行富集培養(yǎng),分離純化后得到4株能夠降解幾丁質(zhì)的菌株Serratiamarcescensgxas3、B.cereusgxas5、Stenotrophomonasmaltophiliagxas7以及C.aquatilegxas1。對(duì)Serratiamarcescensgxas3、B.cereusgxas5以及C.aquatilegxas1 進(jìn)行粗酶活力測(cè)定發(fā)現(xiàn)C.aquatilegxas1 的酶活力在96 h 時(shí)最高,為0.244 U/m L。

利用C.aquatilegxas1對(duì)蝦殼進(jìn)行降解,通過對(duì)比處理前后蝦殼的干重以及蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)含量的變化發(fā)現(xiàn)C.aquatilegxas1對(duì)蝦殼具有較好的降解能力。利用單因素試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示C.aquatilegxas1發(fā)酵蝦殼的最優(yōu)條件是以果糖(0.2%)作為碳源、牛肉膏+蛋白胨(0.4%+0.4%)作為氮源,發(fā)酵溫度為20℃、培養(yǎng)基初始p H 值為8.0、接種量為2.0%,在此條件下發(fā)酵9 d時(shí)C.aquatilegxas1 對(duì)蝦殼的降解率最大,為60%,其中脫蛋白率為76.77%,幾丁質(zhì)回收率為87%。研究結(jié)果表明,在優(yōu)化條件下,C.aquatilegxas1對(duì)蝦殼具有較好的降解能力,可以用于廢棄蝦蟹殼的資源化利用,為實(shí)現(xiàn)綠色降解蝦蟹殼廢棄物提供了研究思路。本研究結(jié)果將有助于減少蝦蟹殼廢棄物對(duì)環(huán)境的污染,促進(jìn)蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。