蔡 冰 ，張 偉 ，劉 靜 ，劉 屹

（1）渭南市中心醫(yī)院病理科;2）普外科，陜西 渭南，714000;3）陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西 西安，710068）

隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率也在逐年遞增?！吨袊Y(jié)直腸癌診療規(guī)范（2023 年版）》[1]報(bào)道，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率位列我國惡性腫瘤第二位，死亡率位于第五位。2020 年結(jié)直腸癌的新發(fā)病例為55.5 萬，死亡病例為28.6 萬[2]。然而，結(jié)直腸癌診斷和治療中傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物（如CEA 和CA199）不夠敏感，不能為臨床診斷和治療提供準(zhǔn)確的結(jié)腸癌篩查信息[3]。因此，尋找便捷有效的早期篩查的生物標(biāo)志物可以為結(jié)直腸癌早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)提供可靠信息，從而降低其發(fā)病率和死亡率。microRNAs（miRNAs）是一類小的非編碼RNA，通過結(jié)合靶mRNA 序列的3'-非翻譯區(qū)（rn-translation region，UTR）來阻止翻譯或促進(jìn)mRNA 降解，從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)[4]。大量證據(jù)表明，miRNAs 參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，其中miR-218 下調(diào)與結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后相關(guān)[5]，因此，筆者推測(cè)miR-218-5p 在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用。Layilin（LAYN）作為一種廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞的跨膜蛋白，作為透明質(zhì)酸的受體在細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)和遷移的生物過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[6]。此外，LAYN與結(jié)直腸癌預(yù)后和免疫細(xì)胞浸潤（CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和DC 細(xì)胞）水平相關(guān)，提示LAYN 可作為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后和免疫浸潤的生物標(biāo)志物[7]。有趣的是，筆者通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-218-5p 可以靶向結(jié)合LAYN mRNA 3′-UTR。因此，本文通過檢測(cè)結(jié)腸癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞系中miR-218-5p 和LAYN的表達(dá)水平，觀察過表達(dá)miR-218-5p 和LAYN對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系的增殖、凋亡和侵襲的影響，探究miR-218-5p 是否通過靶向調(diào)控LAYN 影響結(jié)腸癌的增殖、凋亡和侵襲，進(jìn)而影響結(jié)直腸癌的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC 購自豐暉生物科技有限公司，人胚腎細(xì)胞293T 購自于普諾賽，人結(jié)腸癌細(xì)胞（SW620、HT-29、HCT-116、SW480、LOVO）購自于普諾賽。

1.1.2 主要試劑DMEM 高糖培養(yǎng)基、McCoy’s 5A 培養(yǎng)基、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑、胎牛血清、青鏈霉素均購自于Thermo Fisher，Ham's F-12K 培養(yǎng)基購自普諾賽生物科技有限公司。pcDNA3.1 質(zhì)粒和pcDNA3.1-LAYN 質(zhì)粒由吉滿生物科技有限公司合成，miR-218-5p mimic、mimic NC、miR-218-5p 引物、U6 引物均由廣州銳博生物定制和合成。用于檢測(cè)細(xì)胞增殖的CCK-8 試劑盒購于MCE，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡的流式凋亡試劑盒購于Solarbio。用于Western blot 檢測(cè)的LAYN 抗體（貨號(hào)：ab192610）和cleaved Caspase3 抗體（貨號(hào)：ab32042）購自Abcam，用于IHC 的LAYN 抗體（貨號(hào)：20 535-1-AP）購自Proteintech。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒購于Takara。miR-218-5p 探針購自生工生物科技有限公司，Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning 生物，用于雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的野生型LAYN載體和突變型LAYN 載體購自吉滿生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染（1）細(xì)胞培養(yǎng)。向500 mL培養(yǎng)基中加入50 mL的胎牛血清和5 mL 青鏈霉素，混勻后即為完全培養(yǎng)基。293T 細(xì)胞、FHC 細(xì)胞、SW480 細(xì)胞和SW620 細(xì)胞用DMEM 高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；HT-29 細(xì)胞、HCT-116 細(xì)胞用McCoy’s 5A 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；LOVO 細(xì)胞用Ham’s F-12K完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細(xì)胞接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿進(jìn)行混勻，并將培養(yǎng)皿放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)箱的環(huán)境條件設(shè)置為37℃、5%CO2。（2）細(xì)胞轉(zhuǎn)染。選擇對(duì)數(shù)期的HT-29 細(xì)胞以60%～70%左右的密度將其接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后，參考轉(zhuǎn)染試劑的操作說明并按照實(shí)驗(yàn)分組將pcDNA3.1-NC 質(zhì)粒、pcDNA3.1-LAYN 質(zhì)粒、miR-218-5p mimic、mimic NC 轉(zhuǎn)染至HT-29 細(xì)胞中。將細(xì)胞放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中4 h 后更換為完全培養(yǎng)基，48 h 后即可進(jìn)行細(xì)胞相關(guān)檢測(cè)。

1.2.2 CCK-8 檢測(cè)向96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種對(duì)數(shù)期的HT-29 細(xì)胞，12 h 后進(jìn)行按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染完成后分別于不同時(shí)間點(diǎn)（0 h、24 h、48 h）向孔中加入10 μL CCK-8 試劑，將96 孔板放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)一步培養(yǎng)4 h。最后，將96 孔板放置于酶標(biāo)儀中測(cè)量波長450 nm處的吸光度。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡HT-29 細(xì)胞用0.25%胰酶消化5 min 后終止消化。將細(xì)胞收集至離心管中進(jìn)行離心，1 000 r/min 離心3 min。離心完成后使用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，PBS 重懸細(xì)胞后向細(xì)胞中加入5 μL Annexin V FITC 作用10 min，加入5 μL PI 作用5 min。最后使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)向結(jié)腸癌組織或細(xì)胞中加入500 μl RIPA 裂解液，使其中的蛋白從細(xì)胞中釋放。裂解充分后在高速低溫離心機(jī)轉(zhuǎn)速12 000 r/min 的條件下進(jìn)行離心5 min，收集裂解液上清并進(jìn)行蛋白濃度的檢測(cè)。將蛋白變性后取30 μg 蛋白進(jìn)行電泳，使用0.45 μm PVDF 膜進(jìn)行轉(zhuǎn)印。將轉(zhuǎn)印好的PVDF 膜放入5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，1 h 后將膜放入配制好的一抗溶液（1∶1 000）中室溫孵育3 h。用1%TBST 洗膜完成后將膜在室溫環(huán)境用羊抗兔的二抗溶液（1∶10 000）孵育1 h。向膜上加入化學(xué)發(fā)光底物孵育5 min，最后將膜放入化學(xué)發(fā)光成像儀中進(jìn)行曝光顯色。使用Image J 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.2.5 RT-qPCR 檢測(cè)用Trizol 試劑將臨床結(jié)腸癌組織樣本和細(xì)胞進(jìn)行裂解提取總RNA。使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的濃度和純度。檢測(cè)組織和細(xì)胞中的miR-218-5p 的表達(dá)水平，使用miR-218-5p 莖環(huán)法引物作為反轉(zhuǎn)錄引物和PCR 引物。取500 ng RNA，將其進(jìn)行DNA 酶消化后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA 作為模板通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)miR-218-5p 的表達(dá)。檢測(cè)到的CT 值用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.2.6 原位雜交（in situ hybridizsation，ISH）將石蠟包埋的組織切片進(jìn)行脫蠟和水化，用蛋白酶K 處理切片20 min。向切片上滴加3% H2O2，室溫避光孵育15 min。PBS 洗滌后向切片上加入200 μL 的預(yù)雜交液放在雜交爐上，65℃下預(yù)雜交1 h。將200 μL 濃度為500 ng/mL 的miR-218-5p 探針雜交液滴加到玻片上在55℃孵育1.5 h。將切片在55℃下振蕩洗滌25 min。用血清BSA封閉切片30 min 后向切片上滴加地高辛標(biāo)記HRP，進(jìn)行DAB 顯色反應(yīng)1 h 后用純水洗滌終止反應(yīng)。進(jìn)行Harris 蘇木素復(fù)染后脫水處理（按照50%、75%、100%乙醇順序）。最后，用中性樹膠封片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè)（immunohistochemistry，IHC）取新鮮組織后用生理鹽水洗滌污垢后將其浸泡入4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋和切片。用60℃烤箱將石蠟切片脫蠟60 min，然后經(jīng)過二甲苯和乙醇水化。用通透液浸潤玻片30 min 后PBS 清洗。使用檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0，0.01M）在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)4 min，重復(fù)2 次。用與二抗同一來源的血清在37℃恒溫箱中封閉30 min。向切片滴加稀釋好的一抗20 μL 在4℃孵育過夜。向切片中滴加二抗20 μL，在37℃孵育1 h。DAB 顯色10 min 后用蒸餾水終止顯色。用Mayer蘇木素染色30 s，水洗，鹽酸酒精分化2 s，流水浸入15 min。然后進(jìn)行乙醇梯度脫水（由低至高：50%、70%、95%、100%）各2 min，二甲苯5 min使切片透明化，最后加入中性樹膠封片，在白光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.8 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞侵襲Matrigel 基質(zhì)膠均勻平鋪在孔徑為8 μm 的Transwell 上室，靜置凝固。將轉(zhuǎn)染過的HT-29 細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)量為5×104個(gè)/孔）接種于Transwell 上室，上室培養(yǎng)基為不含血清的McCoy’s 5A 培養(yǎng)基，下室為含血清的McCoy’s 5A 培養(yǎng)基。將Transwell 培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后將Transwell 上室未侵襲的細(xì)胞用棉簽輕輕擦去，侵襲的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min。用0.5%結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色10 min 后用蒸餾水沖洗，最后在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。

1.2.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)將LAYN 的3′ UTR 區(qū)序列擴(kuò)增到pmirGLO 載體上，用于構(gòu)建LAYN 野生型載體LAYN-WT；將靶向結(jié)合的序列進(jìn)行突變，用于構(gòu)建LAYN 突變型載體LAYN-MUT。將293T 細(xì)胞接種于96 孔板中，細(xì)胞密度為60%。按照轉(zhuǎn)染方法將mimic NC/miR-218-5p mimic 和LAYN-WT/MUT 共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞中。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性，并計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 GraphPad Prism 6.0 進(jìn)行柱形圖繪制及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（mean ± SD）。2 組間比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析。以P＜ 0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-218-5p 和LAYN 在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況。

為了研究miR-218-5p 和LAYN 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平，采用RT-qPCR（P＜ 0.000 1）和ISH 檢測(cè)臨床結(jié)腸癌組織樣本中miR-218-5p 的表達(dá)情況，結(jié)果表明miR-218-5p 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)降低，見圖1A、1B；采用Western blot（P＜ 0.000 1）和IHC（P＜ 0.05）檢測(cè)結(jié)腸癌組織樣本中LAYN 的表達(dá)，結(jié)果表明LAYN 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高，見圖1C、1D、1E、1F。

圖1 miR-218-5p 和LAYN 在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況Fig.1 The expression of miR-218-5p and LAYN in colon cancer tissues and paracancerous tissues

為了研究miR-218-5p 和LAYN 在多種結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，采用RT-qPCR 檢測(cè)臨床結(jié)腸癌細(xì)胞系中miR-218-5p 的表達(dá)。結(jié)果顯示，與FHC 細(xì)胞相比，HT-29、SW480、SW620、HCT-116、LOVO 等結(jié)腸癌細(xì)胞系中的miR-218-5p 表達(dá)水平降低，其中HT-29 細(xì)胞中miR-218-5p 表達(dá)最低（P＜ 0.000 1），見圖2A；采用Western blot 檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞系中LAYN 的表達(dá)，結(jié)果顯示，與FHC 細(xì)胞相比，HT-29、SW-480、SW620、HCT-116、LOVO 等結(jié)腸癌細(xì)胞系中的LAYN 表達(dá)水平升高，其中HT-29 細(xì)胞中LAYN 表達(dá)最高（P＜ 0.000 1），見圖2B～2C。根據(jù)RT-qPCR 和Western blot 檢測(cè)結(jié)果均說明HT-29 在5 種人結(jié)腸癌細(xì)胞系中miR-218-5p 表達(dá)最低并且LAYN蛋白表達(dá)最高，因此選擇HT29 細(xì)胞進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)研究。

圖2 miR-218-5p 和LAYN 在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況Fig.2 The expression of miR-218-5p and LAYN in colon cancer cell lines

2.2 miR-218-5p 對(duì)HT29 細(xì)胞的作用

采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)向HT29 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimic 及其對(duì)照，通過RT-qPCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的HT29 細(xì)胞中miR-218-5p 表達(dá)水平從而驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，與mimic NC 組相比，miR-218-5p mimic 組中miR-218-5p 表達(dá)水平升高（P＜ 0.000 1），見圖3A。

圖3 過表達(dá)miR-218-5p 抑制HT29 細(xì)胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)凋亡Fig.3 Overexpression of miR-218-5p inhibits the proliferation，invasion and induces apoptosis of HT29 cells

在miR-218-5p mimic 轉(zhuǎn)染成功后，采用CCK-8 試劑盒檢測(cè)過表達(dá)miR-218-5p 的HT-29細(xì)胞在不同時(shí)間（0 h、24 h、48 h）的增殖情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-218-5p mimic 組中HT-29 細(xì)胞增殖降低（P＜ 0.05），見圖3B。采用Transwell 檢測(cè)過表達(dá)miR-218-5p 的HT-29 細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-218-5p mimic 組中HT-29 細(xì)胞侵襲能力降低（P＜0.001），見圖3C。采用Annexin V-FITC/PI 檢測(cè)過表達(dá)miR-218-5p 的HT-29 細(xì)胞的凋亡水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-218-5p mimic 組中HT-29 細(xì)胞凋亡水平升高（P＜ 0.01），見圖3D。采用Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase3 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-218-5p mimic 組中HT-29 細(xì)胞中cleaved Caspase3 蛋白表達(dá)水平升高（P＜ 0.001），見圖3E。綜上所述，過表達(dá)miR-218-5p 可以抑制HT-29細(xì)胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)其凋亡。

2.3 miR-218-5p 與LAYN 的靶向關(guān)系

通過Starbase3.0 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)，miR-218-5p和LAYN 具有靶向關(guān)系，見圖4A。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示miR-218-5p mimic 可以抑制野生型LAYN 質(zhì)粒的熒光素酶活性（P＜ 0.01），對(duì)突變型LAYN 質(zhì)粒的熒光素酶活性沒有影響，見圖4B。通過Western blot 檢測(cè)過表達(dá)miR-218-5p 的HT-29 細(xì)胞中LAYN 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-218-5p mimic 組LAYN 表達(dá)水平降低（P＜ 0.01），見圖4C～4D，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-218-5p 靶向下調(diào)LAYN。

圖4 miR-218-5p 靶向LAYNFig.4 miR-218-5p targeted LAYN

2.4 miR-218-5p/LAYN 對(duì)HT29 細(xì)胞的作用機(jī)制

向 HT-29 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染 mimic NC+pcDNA3.1、pcDNA3.1-LAYN+mimic NC、pcDNA3.1-LAYN+miR-218-5p mimic，通 過Western blot 檢測(cè)HT-29 細(xì)胞中LAYN 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與mimic NC+pcDNA3.1 組相比，過表達(dá)LAYN 后LAYN 表達(dá)水平升高（P＜ 0.001），而同時(shí)過表達(dá)LAYN 和miR-218-5p 可以逆轉(zhuǎn)LAYN 的表達(dá)水平（P＜ 0.01），見圖5A～5B。通過CCK-8、Transwell、Annexin V-FITC/PI 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與mimic NC+pcDNA3.1 組相比，過表達(dá)LAYN 后細(xì)胞增殖（P＜0.01）和侵襲能力升高（P＜ 0.001），見圖5C～5D；細(xì)胞凋亡水平降低（P＜ 0.05），見圖6A；而同時(shí)過表達(dá)LAYN 和miR-218-5p 可以逆轉(zhuǎn)LAYN 過表達(dá)引起的細(xì)胞增殖（P＜ 0.05）、侵襲（P＜ 0.05）、凋亡（P＜ 0.05）水平的變化，見圖5C～5D、圖6A。采用Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase3 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與mimic NC+pcDNA3.1 組相比，過表達(dá)LAYN 降低 HT-29 細(xì)胞中cleaved Caspase3 蛋白表達(dá)水平（P＜ 0.001），而同時(shí)過表達(dá)LAYN 和miR-218-5p 可以逆轉(zhuǎn)cleaved Caspase3 蛋白的表達(dá)變化（P＜ 0.05），見圖6B。綜上所述，miR-218-5p 靶向調(diào)控LAYN抑制HT29 細(xì)胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)凋亡。

圖5 miR-218-5p 靶向調(diào)控LAYN 抑制HT29 細(xì)胞增殖、侵襲Fig.5 miR-218-5p inhibited proliferation，metastasis of HT-29 cells by targeting LAYN

圖6 miR-218-5p 靶向調(diào)控LAYN 誘導(dǎo)HT-29 細(xì)胞凋亡Fig.6 miR-218-5p induced apoptosis of HT-29 cells by targeting LAYN

3 討論

結(jié)直腸癌是全球消化系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，也是因癌癥導(dǎo)致死亡的第二大原因[8]。結(jié)直腸癌是由不健康的飲食習(xí)慣、缺乏運(yùn)動(dòng)、肥胖、吸煙、年齡、遺傳易感性和腸道炎癥等因素協(xié)同作用的結(jié)果[9]，具有預(yù)后差、致死性強(qiáng)、缺乏靶向治療藥物、發(fā)病率高等特點(diǎn)。然而，結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。因此，研究結(jié)腸癌的分子表達(dá)特征并尋找診斷和治療靶點(diǎn)勢(shì)在必行。

近年來隨著miRNAs 在結(jié)直腸癌中功能的深入研究，越來越多的證據(jù)表明miRNAs 在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段（包括增殖、凋亡、免疫反應(yīng)、遷移、侵襲）均發(fā)揮了促癌或抑癌作用[10-13]。miR-218-5p 是包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的許多癌癥中的腫瘤抑制因子[14-16]。研究報(bào)道，miR-218-5p在結(jié)腸癌患者的癌組織和結(jié)直腸癌細(xì)胞（包括HT-29 細(xì)胞和HCT116 細(xì)胞）中表達(dá)下調(diào)，同時(shí)過表達(dá)miR-218-5p 通過下調(diào)SKAP1 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[17]。miR-218-5p 可以通過調(diào)控PUM1 抑制癌細(xì)胞惡性增殖和化學(xué)耐藥[18]。筆者的研究結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌組織中miR-218-5p 表達(dá)相比于癌旁組織降低，而在多種結(jié)腸癌細(xì)胞系中，miR-218-5p 的表達(dá)水平相比于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞也降低。通過功能獲得性實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)miR-218-5p 表達(dá)升高后HT-29 細(xì)胞的增殖和侵襲能力降低，凋亡水平升高。因此，筆者的研究也證實(shí)了miR-218-5p 可以抑制結(jié)腸癌的進(jìn)展。有研究報(bào)道[19]，miR-218-5p 通過下調(diào)DPH1降低了SW480 細(xì)胞的增殖和侵襲能力，與miR-218-5p 在HT-29 細(xì)胞中的研究作用一致。

LAYN 的高表達(dá)有助于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、DC 細(xì)胞、T 細(xì)胞衰竭和Tregs 的調(diào)節(jié)[7]；在多種癌癥中也發(fā)現(xiàn)LAYN 促進(jìn)癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)癌癥的轉(zhuǎn)移[20]。以上研究結(jié)果均提示LAYN高表達(dá)與結(jié)腸癌的不良預(yù)后正相關(guān)。筆者研究也發(fā)現(xiàn)，LAYN 在結(jié)腸癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)上調(diào)。目前，miRNAs 與LAYN 的調(diào)控研究尚無報(bào)道。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-218-5p 可以靶向結(jié)合LAYN mRNA 3′-UTR。在HT-29 細(xì)胞中過表達(dá)miR-218-5p 可以抑制LAYN蛋白的表達(dá)水平。推測(cè)miR-218-5p 可能是通過下調(diào)LAYN 影響結(jié)腸癌的遷移、凋亡和增殖。本研究結(jié)果顯示過表達(dá)miR-218-5p 可以抑制HT-29 細(xì)胞的增殖、侵襲并促進(jìn)凋亡，而過表達(dá)LAYN可以部分逆轉(zhuǎn)miR-218-5p 對(duì)HT-29 細(xì)胞的作用?？傊?，miR-218-5p 可以通過靶向調(diào)控LAYN 抑制HT-29 細(xì)胞的增殖、侵襲并促進(jìn)凋亡。

綜上所述，在結(jié)腸癌中miR-218-5p 通過靶向調(diào)控LAYN 的表達(dá)，從分子機(jī)制上影響結(jié)腸癌的進(jìn)展，豐富了miR-218-5p 作為抑癌基因在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制，也為miR-218-5p 成為結(jié)腸癌診斷和治療的生物標(biāo)志物提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)。