蘇丹燕，唐文甜，楊謹(jǐn)旭，劉 華，李邦勝，趙應(yīng)鼎，黃云超

（昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院胸外一科，云南 昆明 650118）

隨著生物材料被廣泛應(yīng)用于臨床，各種形式的植入手術(shù)已經(jīng)成為臨床治療中不可或缺的重要組成部分，雖使成千上萬(wàn)的患者從中獲益，但其帶來(lái)的高植入失敗率和再次手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)的危害同樣不可忽視[1]。一旦治療失敗，患者不得不進(jìn)行完全清創(chuàng)或者植入物置換手術(shù)，這不僅給患者帶來(lái)嚴(yán)重的健康損害和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還制約著全球衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展[2-3]。生物材料作為外源性材料，細(xì)菌在其表面定植而導(dǎo)致的生物膜相關(guān)感染（biofilm-associated infections，BAI）是植入物手術(shù)失敗的主要原因，但目前尚無(wú)特異性的靶向藥物，尋找靶向生物膜的抗感染藥物已成為一種研究熱點(diǎn)[4]。

抗生物膜治療仍是一個(gè)非常具有挑戰(zhàn)性的難題，為此，大量研究者致力于抗生物膜的研究，構(gòu)建了聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）、硅膠等生物材料表面細(xì)菌生物膜感染模型[1，5-9]，發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)信號(hào)可能是生物材料植入相關(guān)感染的潛在治療靶點(diǎn)。細(xì)菌常常黏附于生物材料表面，形成細(xì)菌生物膜（bacterial biofilms，BF），因其結(jié)構(gòu)的特殊性及致密性，常常能夠有效抵御機(jī)體的防御反應(yīng)及抗生素的滲透，是導(dǎo)致慢性持續(xù)性感染的根源之一[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，生物膜感染占人類微生物感染的80%[12]，細(xì)菌定植在尿管導(dǎo)管的概率是每天5%～10%[13]。大腸桿菌是引起以生物材料為中心植入感染的優(yōu)勢(shì)菌種之一，在術(shù)后生物材料植入感染中的檢出率為1.6%～2.4%[14]。研究表明大腸桿菌生物膜形成過(guò)程中還受到新型群體感應(yīng)信號(hào)分子吲哚的調(diào)控[15]。本文重點(diǎn)就大腸桿菌生物膜、吲哚的微生物代謝及其對(duì)大腸桿菌生物膜的調(diào)控進(jìn)行綜述，為臨床靶向藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 大腸桿菌生物膜概述

1.1 細(xì)菌生物膜定義

細(xì)菌生物膜是細(xì)菌為了適應(yīng)環(huán)境黏附在生物或非生物表面通過(guò)分泌多種胞外聚合物（主要是胞外多糖）包裹菌體從而保護(hù)膜內(nèi)細(xì)菌免受機(jī)體攻擊及抗生素清除作用的三維立體膜狀結(jié)構(gòu)，是細(xì)菌在自然界中一種常見(jiàn)的生存狀態(tài)[16]。

1.2 大腸桿菌生物膜形成

大腸桿菌的致病力很大程度上來(lái)自于其形成細(xì)菌生物膜的能力。不同細(xì)菌形成的生物膜雖在結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)多樣性，但形成過(guò)程大致相似。大腸桿菌生物膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)、循環(huán)往復(fù)的連續(xù)性過(guò)程，在不同階段，其組成比例、菌體形態(tài)、菌體數(shù)量、細(xì)菌耐藥程度及清除難度都不相同[17]，一般經(jīng)歷4 個(gè)生理階段，見(jiàn)圖1：（1）細(xì)菌黏附：包括可逆附著和不可逆黏附兩相過(guò)程。浮游細(xì)菌黏附在生物材料表面，隨著血流的沖擊、集體的吞噬作用以及抗生素的清除作用，細(xì)菌被迫遷徙或被殺滅。Brun 等[18]研究表明，通過(guò)倒置顯微鏡觀察附著階段的大腸桿菌在中等流動(dòng)狀態(tài)和高剪切速率下，大腸桿菌極易被水流沖走，不利于細(xì)菌在生物材料表面進(jìn)一步黏附。細(xì)菌通過(guò)菌毛、鞭毛、肽聚糖、莢膜、胞外黏質(zhì)物、脂壁酸等具有黏附作用的聚合物[19]與機(jī)體組織、生物材料等特異性結(jié)合，使細(xì)菌不可逆黏附在生物材料表面，進(jìn)行增殖和形成多細(xì)胞群落[18-20]；（2）生物膜形成：細(xì)菌不斷生長(zhǎng)繁殖，基因表達(dá)發(fā)生變化，分泌大量胞外聚合物，如多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和細(xì)胞外DNA（eDNA）等大分子物質(zhì)[21-22]，將細(xì)菌包埋和固定，形成高度水合的極性化合物，有助于整體支架的構(gòu)建和穩(wěn)定的三維微型菌落形成；（3）生物膜成熟：生物膜逐漸發(fā)育成熟，此時(shí)生物膜體積達(dá)到最大，外觀似蘑菇狀或塔狀結(jié)構(gòu)，生物膜功能更加完善，膜內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)有效分配，細(xì)菌之間通過(guò)信號(hào)分子通道進(jìn)行信息交流[23]；（4）脫落再黏附：內(nèi)外因素的相互作用下，生物膜基質(zhì)降解和表面活性劑的破壞，細(xì)胞團(tuán)主動(dòng)擴(kuò)散，生物膜轉(zhuǎn)換為浮游狀態(tài)，游離細(xì)菌繼續(xù)附著并定植，發(fā)育成熟形成新的生物膜。附著是生物膜形成的開(kāi)始，主動(dòng)擴(kuò)散并不是生物膜的結(jié)束，生物膜的不斷循環(huán)往復(fù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程使微生物得以不斷適應(yīng)各種惡劣環(huán)境，也能夠不斷分散和定植新的生態(tài)位[24]。

圖1 生物膜形成模式圖Fig.1 Diagram of bioflm formation

大腸桿菌作為臨床上常見(jiàn)的條件致病菌，在人體正常生理狀態(tài)下通常不致病，當(dāng)在心臟大血管手術(shù)體外循環(huán)、骨科、泌尿外科及神經(jīng)外科等術(shù)中控制性降壓，缺血再灌注損傷及臨床上失血性休克等病理情況下，人體免疫力下降，腸道內(nèi)的大腸桿菌發(fā)生表型變化穿透腸壁黏膜屏障進(jìn)入淋巴系統(tǒng)或血液系統(tǒng)，發(fā)生細(xì)菌移位[25]，成為生物材料植入相關(guān)感染的菌源，形成細(xì)菌生物膜，導(dǎo)致菌血癥或敗血癥的發(fā)生，可引起遠(yuǎn)處器官或組織的局部感染，嚴(yán)重者甚至全身感染導(dǎo)致MODS、SIRS 等，死亡率大大提高，甚至達(dá)37%[26]。大腸桿菌生物膜形成的調(diào)控機(jī)制目前尚未完全闡明，但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）對(duì)大腸桿菌生物膜形成的調(diào)控起至關(guān)重要的作用。群體感應(yīng)是細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生、分泌、檢測(cè)并利用具有擴(kuò)散特性的化學(xué)信號(hào)分子來(lái)感知自身及周圍環(huán)境中的細(xì)菌數(shù)量，細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最低閾值時(shí)，細(xì)菌將會(huì)調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)從而協(xié)調(diào)群體行為并發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[27]。

1.3 大腸桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)

群體感應(yīng)系統(tǒng)是大腸桿菌1 種重要的信號(hào)傳遞機(jī)制。大腸桿菌通過(guò)群體感應(yīng)系統(tǒng)接收復(fù)雜的外界環(huán)境信號(hào)并感知環(huán)境中自身的密度，從而調(diào)控胞外基質(zhì)多糖的特定化學(xué)信號(hào)使細(xì)菌之間相互聚集和粘連，這對(duì)生物膜的形成和維持具有重要的意義。根據(jù)信號(hào)分子的不同，將大腸桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)分為5 種：（1）由N-?；呓z氨酸內(nèi)脂（acyl-homoserine lactones，AHLs）信號(hào)分子，AHLQS 系統(tǒng)普遍存在于革蘭氏陰性菌中，與胞內(nèi)DNA受體蛋白LuxR 結(jié)合，調(diào)控目的基因的表達(dá)[28]；（2）由自身誘導(dǎo)肽（autoinducing peptides，AIP）介導(dǎo)，調(diào)控目的基因表達(dá)，參與種內(nèi)細(xì)菌信號(hào)交流[29]；（3）由自體誘導(dǎo)劑（autoinducer-2，AI-2）介導(dǎo)[30]，調(diào)控細(xì)菌多種生物學(xué)功能，其中包括生物膜的形成[31]；（4）由AI-3/腎上腺素/去甲腎上腺素介導(dǎo)，負(fù)責(zé)宿主-細(xì)菌間的相互交流[32-33]；（5）細(xì)菌自身產(chǎn)生的吲哚效應(yīng)分子介導(dǎo)的QS 系統(tǒng)，見(jiàn)圖2。吲哚通常作為大腸桿菌的生理生化鑒定標(biāo)記之一，直到近年來(lái)，吲哚作為新型QS 信號(hào)分子參與細(xì)菌多種生理活動(dòng)，如孢子形成[34]、質(zhì)粒穩(wěn)定性[35]、耐藥性[36]、吲哚產(chǎn)生菌的毒力[37]以及生物膜形成[38-40]等的調(diào)控作用才逐漸被揭示并重視。

圖2 參與大腸桿菌界間通訊過(guò)程的吲哚系統(tǒng)示意圖Fig.2 Schematic representation of the indole system that participates in inter-kingdom communication processes in E. coli

2 吲哚的微生物代謝

吲哚是1 種典型的相對(duì)穩(wěn)定的氮雜環(huán)芳烴有機(jī)化合物，在自然界中廣泛存在。微生物和動(dòng)植物在進(jìn)行生理生化活動(dòng)過(guò)程中通常會(huì)伴隨著吲哚的產(chǎn)生，動(dòng)物腸道中吲哚的濃度可高達(dá)1.0 mmol/L[41]。色氨酸（tryptophan，Trp）在色氨酸酶（tryptophanase，TnaA）以5′-磷酸吡哆醛為輔酶的作用下催化L-色氨酸（pyridoxal 5′-phosphate，PLP）生成吲哚，同時(shí)產(chǎn)物還有丙酮酸和氨[37]。大腸桿菌色氨酸酶的表達(dá)受操縱子（trpEDCBA）調(diào)控[42]。色氨酸有3 條代謝途徑，分別是犬尿氨酸途徑、5-TH 途徑、微生物代謝途徑[43]。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的細(xì)胞膜上存在3 種分別由Arop、TnaB 和Mtr 編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可將胞內(nèi)色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外進(jìn)行色氨酸代謝[38]。犬尿氨酸途徑承擔(dān)約95%的色氨酸代謝，是色氨酸代謝的主要途徑[44]，腸道內(nèi)微生物可直接或間接調(diào)節(jié)色氨酸代謝，經(jīng)tnaA 編碼的酶將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚，最終經(jīng)尿液排出[45]。大部分生物體內(nèi)均存在色氨酸合成及代謝通路，但吲哚只有在編碼tnaA 的細(xì)菌中產(chǎn)生[46]，在低水平色氨酸的培養(yǎng)基條件下，Trp 操縱子的表達(dá)升高，而tna 操縱子的表達(dá)下降，吲哚生成受到抑制，與此相反，當(dāng)在富含色氨酸的培養(yǎng)基條件下時(shí)，消除轉(zhuǎn)錄終止 Rho 依賴性，激活tnaA 基因表達(dá)，產(chǎn)生大量的吲哚[47]。吲哚的生成量還受到環(huán)境和生物等多種因素的影響，如溫度、pH、細(xì)胞密度、碳源及抗生素等，其中外源性色氨酸量的多少很大程度上直接影響吲哚的生成量。據(jù)報(bào)道，當(dāng)提供一定濃度范圍內(nèi)的色氨酸量時(shí)，進(jìn)入穩(wěn)定期的大腸桿菌可以把這些色氨酸轉(zhuǎn)化為等量的吲哚，最高達(dá)5.0 mmo/L[48]，然而繼續(xù)加入色氨酸，生成吲哚的量卻不再增加，可能是過(guò)量的吲哚抑制TnaA 的活性以及色氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。

3 吲哚—信號(hào)分子新成員

細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生信號(hào)分子用于接收細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的通訊信息，進(jìn)行種內(nèi)和種間的信息交流。目前已發(fā)現(xiàn)有超過(guò)85 種細(xì)菌能夠產(chǎn)生吲哚[12]，吲哚調(diào)控細(xì)菌群感效應(yīng)功能逐漸被研究者重視。盡管有研究者對(duì)吲哚是否為細(xì)胞間信號(hào)分子存在一定爭(zhēng)議，但相關(guān)證據(jù)表明吲哚具備成為細(xì)胞間信號(hào)分子的條件。吲哚主要產(chǎn)生于大腸桿菌生長(zhǎng)的指數(shù)期晚期和穩(wěn)定期的過(guò)渡期，在細(xì)菌生長(zhǎng)遲緩期和指數(shù)期早期以非常低的水平產(chǎn)生[49]。研究發(fā)現(xiàn)[50]，在小鼠腸道中吲哚水平的高低可以通過(guò)細(xì)菌膜結(jié)合組氨酸傳感器激酶（histidine sensor kinases，HK）CpxA-CpxR 雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic Escherichia coli）毒力基因的表達(dá)，隨著吲哚濃度的升高，毒力基因表達(dá)下降。外源吲哚還可以誘導(dǎo)不產(chǎn)生吲哚的惡臭假單胞菌和銅綠假單胞菌中編碼兩個(gè)RND 型多藥外排操縱子基因的ttgAB 和一個(gè)編碼β-內(nèi)酰胺酶ampC 的表達(dá)增加，上調(diào)CpxA-CpxR 雙組分系統(tǒng)，導(dǎo)致與抗微生物耐藥相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄激活，增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性[51]。大腸桿菌SdiA 蛋白屬于LuxR 家族，是一種參與細(xì)胞分裂的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以與AHL、AI-2 等信號(hào)分子相互作用[52]。有研究表明，吲哚介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與AHL 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間可能存在一定的聯(lián)系，高濃度吲哚抑制大腸桿菌的AHL 活性，AHL 與SdiA 結(jié)合可以免受吲哚的影響[40，53]。目前尚不清楚吲哚是如何對(duì)SdiA 同源物做出反應(yīng)并發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。此外，吲哚還通過(guò)下調(diào)噬菌體受體IV 型菌毛（T4P）活性和組裝相關(guān)基因的表達(dá)，減少T4P 介導(dǎo)的噬菌體吸附保護(hù)銅綠假單胞菌免受噬菌體的感染，在細(xì)菌行為調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用[54]。吲哚還可以調(diào)控非吲哚產(chǎn)生菌的生理活動(dòng)，非吲哚產(chǎn)生菌通過(guò)編碼萘雙加氧酶、P540 單加氧酶和苯酚羥化酶等加氧酶對(duì)吲哚進(jìn)行轉(zhuǎn)化或降解為吲哚衍生物[55]。目前，吲哚信號(hào)傳導(dǎo)已被證實(shí)在細(xì)菌生理生化等各個(gè)方面發(fā)揮作用，其生物學(xué)功能也不斷被揭示。

4 吲哚介導(dǎo)的生物膜調(diào)節(jié)作用

吲哚通過(guò)干擾大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)獲取和黏附定植，減弱細(xì)菌毒力，調(diào)控BF 形成相關(guān)基因的表達(dá)及群體感應(yīng)系統(tǒng)等途徑，調(diào)控大腸桿菌的生長(zhǎng)和BF 的形成。Wang 等[56]指出，在大腸桿菌S17-1菌株中，TnaA 缺失是抑制生物膜形成能力的主要原因，添加吲哚后，其生物膜形成能力得到恢復(fù)，證實(shí)吲哚參與調(diào)控并促進(jìn)大腸桿菌生物膜的形成。Liu 等[57]實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用蛋白質(zhì)的細(xì)菌通訊譜表達(dá)式（CAPPEX）來(lái)分析細(xì)菌間信息交流響應(yīng)方式時(shí)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌競(jìng)爭(zhēng)Trp 以增加吲哚的產(chǎn)生，吲哚抑制鼠傷寒沙門氏菌HilA、SipB 和SopB 等毒力因子的表達(dá)。Sun 等[58-59]研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道指出，亞最低抑制濃度頭孢他啶（亞MIC CAZ）抑制大腸桿菌的生物膜形成能力，可能是通過(guò)增加TnaA 基因的表達(dá)和胞外吲哚濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Lee 等[60]研究發(fā)現(xiàn)，吲哚通過(guò)與基因調(diào)控蛋白YmgB 相互作用降低大腸桿菌運(yùn)動(dòng)性從而抑制生物膜形成。Domka 等[61]研究報(bào)道，大腸桿菌生物膜形成調(diào)控基因YliH（BssR）和YceP（BssS）通過(guò)cAMP-CRP 介導(dǎo)的分解代謝抑制途徑參與吲哚的調(diào)節(jié)，YliH、YceP 突變體抑制吲哚的生成，從而提高大腸桿菌運(yùn)動(dòng)和生物膜的形成，外源吲哚的加入使YliH、YceP 突變體大腸桿菌生物膜的形成受到抑制。

雖然目前研究者對(duì)吲哚介導(dǎo)BF 形成的觀點(diǎn)表示贊同，但因研究者所研究的實(shí)驗(yàn)菌株、實(shí)驗(yàn)條件的不同和難以排除內(nèi)生吲哚對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，以及通過(guò)何種機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用還是未知的，吲哚對(duì)BF 的形成起促進(jìn)或是抑制作用暫無(wú)定論，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

5 小結(jié)

目前，隨著全球預(yù)期壽命的增長(zhǎng)，生物材料植入人體內(nèi)以替換受損的細(xì)胞、組織及器官的需求不斷增加，醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域以生物材料為中心植入感染問(wèn)題愈加嚴(yán)峻。越來(lái)越多研究表明吲哚對(duì)于細(xì)菌生物膜的形成起著重要的調(diào)控作用，但相關(guān)機(jī)制研究仍較少，未來(lái)可能需要從以下方面進(jìn)一步探索：（1）吲哚調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍需進(jìn)一步完善，未來(lái)將需要更多的體內(nèi)體外研究來(lái)揭示和闡明吲哚調(diào)控大腸桿菌生物膜形成的具體機(jī)制；（2）吲哚及其衍生物在抗感染治療中的應(yīng)用前景及可能的不良反應(yīng)；（3）吲哚信號(hào)通路可能是藥物研發(fā)的重要潛在靶點(diǎn)。