馬曼華 王珊 孟東方

1. 商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)院康復(fù)教研室,河南 商丘 476005 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科,河南 鄭州 450003

類固醇誘導(dǎo)的股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是一種慢性進(jìn)行性股骨頭疾病,主要由長期過量糖皮質(zhì)激素誘發(fā),可引起髖關(guān)節(jié)損傷和功能障礙,最終影響患者生活質(zhì)量[1]。目前治療ONFH常用的藥物有雙膦酸鹽、他汀類藥物和抗凝血?jiǎng)?這些藥物通過不同的藥理機(jī)制可以部分恢復(fù)骨細(xì)胞的功能,但其卻存在明顯的副作用如胃腸道刺激、腎毒性或下頜關(guān)節(jié)壞死等[2]。因此,開發(fā)一種效果顯著、不良反應(yīng)少的抗ONFH藥物至關(guān)重要。葛根素是葛根中主要的異黃酮成分之一,具有抗骨質(zhì)疏松、抗氧化等活性[3]。已有研究報(bào)道,葛根素通過促進(jìn)壞死部位新骨生成,對激素性股骨頭壞死模型大鼠發(fā)揮治療作用,但具體機(jī)制尚不完全明確[4]。相關(guān)研究顯示,葛根素通過上調(diào)miR-34a促進(jìn)類固醇誘導(dǎo)的股骨頭壞死兔的成骨作用;抑制miR-30b-5p表達(dá)可促進(jìn)類固醇誘導(dǎo)的股骨頭壞死的軟骨細(xì)胞凋亡[5-6]。但葛根素能否通過調(diào)控miR-30b-5p表達(dá)改善類固醇誘導(dǎo)的ONFH尚不明確。因此,本研究主要探究葛根素對類固醇誘導(dǎo)的ONFH兔氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響以及可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:84只3月齡體質(zhì)量為2.25～2.5 kg的新西蘭大白兔購自廣東雙林生物制藥有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2023-0003。

1.1.2主要試劑:葛根素購自上海同田生物技術(shù)有限公司;大腸桿菌內(nèi)毒素購自上海烜雅生物科技有限公司;甲潑尼龍琥珀酸鈉注射液購自國藥集團(tuán)容生制藥有限公司;仙靈骨葆膠囊購自貴州同濟(jì)堂制藥有限公司;miR-30b-5p拮抗劑(antagomir)及其陰性對照antagomir NC 購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司;兔超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)ELISA試劑盒購自上海仁捷生物科技有限公司;鼠源一抗Dickkopf-1(DKK-1)、GAPDH及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠二抗均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1ONFH兔模型的構(gòu)建:ONFH模型的構(gòu)建[7]:向兔耳緣靜脈注射兩次大腸桿菌內(nèi)毒素(10 μg/kg),兩次間隔時(shí)間為24 h,末次注射內(nèi)毒素后,立刻通過臀肌注射三次甲潑尼龍琥珀酸鈉注射液(25 mg/kg),三次間隔時(shí)間為24 h。

1.2.2動(dòng)物分組及處理:按照隨機(jī)數(shù)字表法將84只新西蘭大白兔分為對照組、ONFH組、葛根素低劑量組、葛根素高劑量組、陽性對照組、葛根素高劑量+antagomir NC組、葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組,每組12只。對照組以生理鹽水代替大腸桿菌內(nèi)毒素、甲潑尼龍琥珀酸鈉注射液,其余操作同造模過程;其余各組均需采用大腸桿菌內(nèi)毒素聯(lián)合甲潑尼龍琥珀酸鈉的方式構(gòu)建ONFH模型。若Micro-CT結(jié)果顯示,兔股骨骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度降低,骨小梁分離度升高,且HE染色顯示兔骨小梁排列稀疏、無序、變薄、部分?jǐn)嗔?骨小梁內(nèi)的骨細(xì)胞數(shù)量減少,空骨陷窩數(shù)增多,則表明模型構(gòu)建成功,然后進(jìn)行給藥處理。葛根素低劑量組、葛根素高劑量組[5]、陽性對照組[7]分別予以灌胃0.125 g/kg葛根素、0.5 g/kg葛根素、0.4 g/kg仙靈骨葆膠囊,且均需尾靜脈注射等量的生理鹽水;葛根素高劑量+antagomir NC組灌胃0.5 g/kg葛根素且還需尾靜脈注射93.46 μg/只antagomir NC;葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組[8]灌胃0.5 g/kg葛根素且還需尾靜脈注射93.46 μg/只miR-30b-5p antagomir;對照組、ONFH組灌胃等量的生理鹽水且還需尾靜脈注射等體積的生理鹽水。給藥一天一次,持續(xù)12周。

1.2.3標(biāo)本收集:末次處理24 h后,處死大白兔,收集大白兔的股骨頭,分為兩部分,一部分固定于4 %多聚甲醛中用于Micro-CT掃描、HE染色及TUNEL染色,另一部分凍存于-80 ℃冰箱中用于ELISA、qRT-PCR、Western Blot檢測。

1.2.4Micro-CT檢測:利用Micro-CT掃描固定于4 %多聚甲醛溶液中48 h的股骨頭,并分析骨計(jì)量學(xué)參數(shù)骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度及骨小梁分離度。

1.2.5HE染色檢測兔股骨頭組織病理變化:取1.2.3中的股骨頭,在10 % EDTA中脫鈣,并包埋在石蠟中。然后將組織切成5 μm厚的切片。用HE對連續(xù)切片進(jìn)行染色,使用光學(xué)顯微鏡記錄組織病理學(xué)變化,Image-Pro Plus 6.0軟件分析切片上的空骨陷窩數(shù)、總骨陷窩數(shù),并計(jì)算空骨陷窩率,空骨陷窩率(%)=(空骨陷窩數(shù)/骨陷窩數(shù)×100 %)。

1.2.6ELISA法檢測兔股骨頭組織中SOD活性及MDA含量:嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測兔股骨頭組織中SOD活性及MDA含量。

1.2.7TUNEL染色檢測兔股骨頭組織中細(xì)胞凋亡:取1.2.5中的股骨頭組織切片,根據(jù)TUNEL試劑盒說明書步驟檢測細(xì)胞凋亡,凋亡細(xì)胞呈綠色熒光,正常細(xì)胞的細(xì)胞核被染成藍(lán)色。細(xì)胞凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100 %。

1.2.8qRT-PCR檢測股骨頭組織中miR-30b-5p表達(dá):利用TRIzol試劑提取股骨頭組織勻漿總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。以U6為內(nèi)參,通過2-ΔΔCt法計(jì)算miR-30b-5p相對表達(dá)量。引物序列:U6-F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R:5′-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3′;miR-30b-5p-F: 5′-CCGAAACATCCT ACACTCAGCTAA-3′,R:5′-CAGTGCGTGTCGTGG AGT-3′。

1.2.9Western Blot檢測股骨頭組織中DKK-1蛋白表達(dá):利用RIPA裂解緩沖液提取股骨頭組織勻漿總蛋白,將50 μg總蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,在4 ℃下將膜與一抗DKK-1、GAPDH孵育過夜,再將膜與二抗共同孵育1.5 h。加入ECL試劑觀察蛋白印跡,利用Image J軟件評(píng)估目的蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 葛根素對各組兔股骨頭區(qū)骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度及骨小梁分離度的影響

與對照組比較,ONFH組骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度降低,骨小梁分離度升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度升高,骨小梁分離度降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度降低,骨小梁分離度升高(P<0.05),見圖1和表1。

表1 各組兔股骨區(qū)骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度及骨小梁分離度變化比較Table 1 Comparison of changes in the number, thickness, and separation of bone trabeculae in the femoral region of rabbits in each group n=6)

圖1 Micro-CT掃描檢測兔股骨微結(jié)構(gòu)Fig.1 Micro-CT scan to detect the microstructure of rabbit femur

2.2 葛根素對各組兔股骨頭組織病理變化的影響

對照組兔股骨頭組織無明顯異常,骨小梁整齊致密,排列規(guī)則,骨小梁內(nèi)的骨細(xì)胞分布清晰均勻,骨陷窩豐富;ONFH組兔骨小梁排列稀疏、無序、變薄、部分?jǐn)嗔?骨小梁內(nèi)的骨細(xì)胞數(shù)量減少,空骨陷窩數(shù)增多;與對照組比較,ONFH組空骨陷窩率升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組空骨陷窩率降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組空骨陷窩率升高(P<0.05),見圖2和表2。

表2 各組兔空骨陷窩率變化比較Table 2 Comparison of changes in empty bone lacuna rate among different groups of rabbits n=6)

圖2 HE染色檢測兔股骨頭組織病理變化(200×)Fig.2 HE staining detection of pathological changes in rabbit femoral head tissue (200×)

2.3 葛根素對各組兔股骨頭組織中SOD活性及MDA含量的影響

與對照組比較,ONFH組SOD活性降低,MDA含量升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組SOD活性升高,MDA含量降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組SOD活性降低,MDA含量升高(P<0.05),見表3。

表3 各組兔股骨頭組織中SOD活性及MDA含量變化比較Table 3 Comparison of changes in SOD activity and MDA content in femoral head tissue of rabbits in each group n=6)

2.4 葛根素對各組兔股骨頭組織中細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較,ONFH組兔股骨頭組織中細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組兔股骨頭組織中細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組兔股骨頭組織中細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05),見圖3和表4。

表4 各組兔股骨頭組織中細(xì)胞凋亡率變化比較Table 4 Comparison of changes in cell apoptosis rate in femoral head tissue of rabbits in each group n=6)

圖3 TUNEL染色檢測兔股骨頭組織中骨細(xì)胞凋亡(400×)Fig.3 TUNEL staining for detecting osteocyte apoptosis in rabbit femoral head tissue (400×)

2.5 葛根素對各組兔股骨頭組織中miR-30b-5p表達(dá)及DKK-1蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較,ONFH組miR-30b-5p表達(dá)降低,DKK-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組miR-30b-5p表達(dá)升高,DKK-1蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組miR-30b-5p表達(dá)降低,DKK-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05),見圖4和表5。

表5 各組兔股骨頭組織中miR-30b-5p表達(dá)及DKK-1蛋白表達(dá)變化比較Table 5 Comparison of changes in miR-30b-5p expression and DKK-1 protein expression in femoral head tissues of rabbits in each group n=6)

圖4 Western Blot檢測兔股骨頭組織中DKK-1蛋白Fig.4 Western Blot detection of DKK-1 protein in rabbit femoral head tissue注:A:對照組;B:ONFH組;C:葛根素低劑量組;D:葛根素高劑量組;E:陽性對照組;F:葛根素高劑量+antagomir NC組;G:葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組。

3 討論

ONFH是一種常見且迅速致殘的疾病,大多數(shù)患者會(huì)在2～3年內(nèi)出現(xiàn)股骨頭塌陷,最終出現(xiàn)髖關(guān)節(jié)功能障礙,給患者家庭和整個(gè)社會(huì)帶來不可估量的勞動(dòng)和經(jīng)濟(jì)損失[9]。Micro-CT是可通過全面、立體的方式測量骨微結(jié)構(gòu)、評(píng)價(jià)骨質(zhì)量及預(yù)測骨強(qiáng)度的新型技術(shù)[7]。本研究利用該技術(shù)檢測了ONFH兔模型的骨計(jì)量學(xué)參數(shù),結(jié)果顯示,與對照組比較,ONFH組骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度降低,骨小梁分離度升高,表明ONFH兔模型的骨計(jì)量學(xué)參數(shù)異常。據(jù)報(bào)道,氧化應(yīng)激與類固醇誘導(dǎo)的ONFH過程密切相關(guān),在激素誘導(dǎo)的ONFH兔股骨頭組織中SOD活性降低,MDA含量升高[10]。此外,骨細(xì)胞凋亡與ONFH的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān),當(dāng)ONFH發(fā)生時(shí),股骨頭的內(nèi)部血液供應(yīng)被切斷,導(dǎo)致骨細(xì)胞營養(yǎng)不足進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,骨小梁組織也被慢慢拉松,最終引起股骨頭塌陷[11]。本研究顯示,與對照組比較,ONFH組兔股骨頭組織中SOD活性降低,MDA含量、骨細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白DKK-1蛋白表達(dá)升高,股骨頭組織病理損傷嚴(yán)重,表明ONFH兔存在氧化應(yīng)激及骨細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。因此,抑制氧化應(yīng)激及骨細(xì)胞凋亡可能是治療ONFH的潛在有效策略之一。

葛根素是一種具有高健康價(jià)值的天然物質(zhì),具有抗氧化、抗炎、提高免疫力、保護(hù)心腦血管和骨修復(fù)等一系列生物活性[12]。相關(guān)研究顯示,葛根素對于激素性O(shè)NFH大鼠的壞死股骨具有良好的修復(fù)作用[13];葛根素可減弱骨間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡進(jìn)而改善糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的大鼠ONFH[14]。本研究亦顯示,葛根素可抑制ONFH兔股骨頭組織氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡,且葛根素劑量越高,抑制作用越明顯。本研究同先前的研究[13-14]一致,證實(shí)了葛根素對ONFH具有保護(hù)作用,但也對該結(jié)論進(jìn)行了完善,即葛根素對ONFH的保護(hù)作用是通過抑制氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。另有研究顯示,仙靈骨葆膠囊作為臨床上常用于治療ONFH的藥物,本研究設(shè)置該藥物為陽性藥物,結(jié)果顯示,仙靈骨葆膠囊與高劑量葛根素對ONFH兔股骨頭組織氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示葛根素可能成為治療ONFH的潛在有效藥物。

近年來,越來越多的研究表明葛根素通過調(diào)控miRNA的表達(dá)來影響各種疾病的進(jìn)展。如葛根素通過下調(diào)miR-196a-3p促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖和分化,進(jìn)而改善骨質(zhì)疏松[15];葛根素通過抑制miRNA-140-5p表達(dá)來預(yù)防糖尿病腎損傷[16]。且有研究表明在ONFH動(dòng)物模型中miR-30b-5p表達(dá)降低[6]。但葛根素能否通過調(diào)控miR-30b-5p表達(dá)影響ONFH兔股骨頭組織氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的研究鮮有報(bào)道。此外,有研究顯示,miR-30b-5p可通過抑制氧化應(yīng)激減輕大鼠子癇前期癥狀[17]。本研究顯示,葛根素可促進(jìn)ONFH兔股骨頭組織中miR-30b-5p表達(dá),且葛根素劑量越高,促進(jìn)作用越明顯,推測葛根素可能通過上調(diào)miR-30b-5p表達(dá)來抑制ONFH兔氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證該推測,本研究在高劑量葛根素作用的基礎(chǔ)上再加上miR-30b-5p antagomir來干預(yù)ONFH兔,結(jié)果顯示,miR-30b-5p antagomir減弱了高劑量葛根素對ONFH兔氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的抑制作用。證實(shí)了猜想的正確性。

綜上所述,葛根素可能通過上調(diào)miR-30b-5p表達(dá)來抑制ONFH兔氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡。葛根素抑制ONFH兔氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究。