鄧長弓 李源力 聶君蘭 李洪

1.川北醫(yī)學(xué)院,四川 南充 637000 2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,四川 南充 637000

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis, OA)是一種以劇烈關(guān)節(jié)疼痛為主要癥狀的關(guān)節(jié)退行性疾病[1-2]。常發(fā)于中老年患者,近年來OA的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),對(duì)患者的健康造成威脅,故如何治療并減輕由于OA引起的僵硬、疼痛已成為目前世界所關(guān)注的問題。研究顯示,在OA的發(fā)展過程中常伴隨著軟骨細(xì)胞的異常增殖及凋亡,故對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的抑制有助于緩解OA的癥狀[3]。P-15是一種人工合成的類似人 Ⅰ 型膠原蛋白 α 鏈的細(xì)胞黏附材料,研究證實(shí),P-15不僅能通過α2β1亞基促進(jìn)骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞發(fā)生遷移、增殖、分化和粘連等作用,而且還具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的作用[4]。長鏈非編碼RNA(lnc RNA)屬于非編碼RNA,參與細(xì)胞內(nèi)多種調(diào)控機(jī)制,對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展和防治至關(guān)重要。NEAT1(nuclear-enriched abundant tran1)作為新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,在多種腫瘤疾病中具有較高表達(dá),而且也通常與腫瘤患者的生存期、腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等密切相關(guān)[5-6]。研究證實(shí),NEAT1還能通過抑制細(xì)胞凋亡,從而抑制骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[7]。lncRNA NEAT1能夠通過競爭性結(jié)合SFPQ,使SFPQ/PTBP2解離,釋放PTBP2從而提高RUNX2的翻譯水平[8-9]。RUNX2、DKK-1在膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨中高表達(dá)會(huì)造成軟骨細(xì)胞肥大及外基質(zhì)分解,從而導(dǎo)致軟骨病變[10]。目前,P-15對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞(HC-OA)的影響及相關(guān)機(jī)制尚未闡明。本研究基于lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸,通過體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞,探討P-15對(duì)HC-OA的影響,為OA的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞:HC-OA細(xì)胞購自Cell Applications公司(402OA-05a),用含有10 % FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)基,在37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)。

1.1.2試劑/抗體:P-15(美國Cerapedics公司);胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司,批號(hào):1921005PJ、A4192002);LipofectamineTM2000試劑(美國Invitrogen公司,批號(hào):11668019);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas公司,批號(hào):K1622);RIPA裂解液(上海碧云天公司,批號(hào):P0013B);蛋白酶抑制劑(北京索萊寶公司,批號(hào):A8260);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天公司,批號(hào):P0018AS/ P0018AM);Cytoplasmic &Nuclear RNA Purification Kit(加拿大Norgen Biotek公司,批號(hào):NGB-21000)。RUNX2、SFPQ、P62兔多克隆抗體(英國Abcam公司,批號(hào):ab38148、ab23981、ab91526);Beclin-1(美國Abgent公司,批號(hào):AP1818a);Anti-LC3B兔抗(德國Sigma公司,批號(hào):L7543);小鼠抗β-actin單克隆抗體(上海翌圣生物公司,批號(hào):30101ES);辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG/羊抗鼠IgG(北京索萊寶公司,批號(hào):SE134、SA131)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):將6孔板加入P-15肽,空白對(duì)照組不做任何處理;后將生長對(duì)數(shù)期的HC-OA細(xì)胞密度以1×105/孔加入板孔,待細(xì)胞密度達(dá)到80 %左右時(shí),按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染siRNA NC及siRNA SFPQ。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核RNA分離:取對(duì)數(shù)生長期的軟骨細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核RNA提取試劑盒操作說明書,從HC-OA細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中分離RNA。收集HC-OA細(xì)胞并在冰上裂解5 min,然后將細(xì)胞以12 000g離心3 min,收集上清液并測(cè)量細(xì)胞質(zhì)RNA,同時(shí)使用核沉淀法提取核RNA。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LncRNA NEAT1表達(dá):用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)微量核酸儀檢測(cè)RNA純度和濃度后,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列:NEAT:F:AGCTGCGTCTATTGAATT GGTAAAGTAA,R:GACAGAAAGATCCCAACGA TAAAAATAA;β-actin:F:GGGAAATCGTGCGTG ACATT,R:GCGGCAGTGGCCATCTC。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 sec,60 ℃退火30 sec,72 ℃延伸30 sec,共35個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因,以2-ΔΔCt計(jì)算lncRNA NEAT1的相對(duì)mRNA水平。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:收集Control組、P-15組、P-15+siRNA NC組及P-15+siRNA SFPQ組軟骨細(xì)胞,PBS清洗后參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書操作。取1.0×106個(gè)細(xì)胞,添加400 μL結(jié)合緩沖液,加入10 μL Annexin V-FITC,室溫避光孵育15 min。再加入5 μL PI染色液,混勻后室溫避光孵育5 min。最后再加入100 μL結(jié)合緩沖液,混勻后置于FACS Calibur流式細(xì)胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá):收集各組軟骨細(xì)胞,加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解30 min,離心取上清即為提取總蛋白。加入適量5×Loading Buffer,置于沸水中煮10 min,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜、封閉2 h,一抗分別為RUNX2(稀釋度1∶1 000)、SFPQ(稀釋度1∶1 000)、Beclin-1(稀釋度1∶1 000)、LC3B(稀釋度1∶1 000)、P62(稀釋度1∶1 000)和細(xì)胞內(nèi)參蛋白β-actin(稀釋度1∶3 000),4 ℃孵育過夜。二抗為辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG(稀釋度1∶3 000),37 ℃孵育1 h。滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑,在全自動(dòng)功能成像儀下顯影。通過 Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 P-15對(duì)HC-OA細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平影響

通過RT-qPCR檢測(cè)P-15對(duì)HC-OA細(xì)胞中NEAT1表達(dá)水平的影響,結(jié)果顯示(圖1A),與Control組相比,在P-15處理的軟骨細(xì)胞中,lncRNA NEAT1的表達(dá)倍數(shù)顯著降低(P<0.05)。P-15+siRNA NC組細(xì)胞NEAT1水平與P-15組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相較于P-15+siRNA NC組,P-15+siRNA SFPQ組敲低SFPQ上調(diào)了細(xì)胞內(nèi)游離的lncRNA NEAT1水平,但仍低于Control組(P<0.05)。為了揭示lncRNA NEAT1的定位(圖1B),我們分離了HC-OA細(xì)胞的胞核、胞質(zhì)RNA,以GAPDH為胞核Marker,U6為胞質(zhì)Marker,RT-qPCR結(jié)果顯示,lncRNA NEAT1同時(shí)存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核分布更多。

圖1 P-15對(duì)HC-OA細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平的影響Fig.1 Effect of P-15 on lncRNA NEAT1 expression in HC-OA cells注:A:P-15對(duì)HC-OA細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平的影響;B:lncRNA NEAT1在HC-OA細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)情況。與對(duì)照組相比,*P<0.05;與P-15+siRNA NC組相比,#P<0.05。

2.2 P-15通過降低胞內(nèi)lncRNA NEAT1水平抑制HC-OA細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示(圖2),與Control組相比,P-15組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。相較于P-15+siRNA NC組和P-15組,P-15+siRNA SFPQ組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05),但仍低于Control組,說明P-15可顯著抑制HC-OA細(xì)胞的凋亡,而敲低SFPQ可部分恢復(fù)由P-15抑制的細(xì)胞凋亡。

圖2 P-15對(duì)HC-OA細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of P-15 on apoptosis of HC-OA cells注:與對(duì)照組比較,*P<0.05;與P-15+siRNA NC組比較,#P<0.05。

2.3 P-15對(duì)lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2通路的影響

通過Western blot檢測(cè)檢測(cè)P-15對(duì)HC-OA細(xì)胞RUNX2和SFPQ的表達(dá)的影響。結(jié)果顯示(圖3),與Control組相比,P-15處理后HC-OA細(xì)胞內(nèi)的SFPQ蛋白表達(dá)增加,與之相反的是,RUNX2的表達(dá)受到明顯抑制。siRNA NC不影響P-15對(duì)HC-OA細(xì)胞RUNX2和SFPQ的表達(dá)。相比于P-15+siRNA NC組和P-15組,siRNA SFPQ在可一定程度上促進(jìn)RUNX2蛋白表達(dá),說明P-15可通過上調(diào)SFPQ從而抑制RUNX2表達(dá)。

圖3 P-15對(duì)HC-OA細(xì)胞lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2通路的影響Fig.3 Effects of P-15 on lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2 pathway in HC-OA cells注:與Control組相比,** P<0.01;與P-15+siRNA NC組相比,##P<0.01。

2.4 P-15通過調(diào)控lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸對(duì)HC-OA細(xì)胞自噬的影響

通過檢測(cè)P-15對(duì)HC-OA細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1,LC3B和P62等表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖4),與Control組相比,P-15具有促進(jìn)Beclin-1、LC3B Ⅱ/Ⅰ的表達(dá),抑制P62表達(dá)。siRNA NC不影響P-15對(duì)HC-OA細(xì)胞內(nèi)這3種自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。相比于P-15+siRNA NC組和P-15組,siRNA SFPQ可在一定程度上下調(diào)P-15誘導(dǎo)的Beclin-1和LC3B Ⅱ/Ⅰ蛋白過表達(dá),并恢復(fù)P62的表達(dá)。

圖4 P-15對(duì)HC-OA細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3II/I和P62的影響Fig.4 Effect of P-15 on Beclin-1, LC3B and P62 in HC-OA cells注:與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與P-15+siRNA NC組相比,#P<0.05,##P<0.01。

3 討論

在全球范圍內(nèi),OA的發(fā)病率和死亡率正在上升,一些風(fēng)險(xiǎn)因素包括年齡、肥胖、遺傳和關(guān)節(jié)損傷等都與OA的進(jìn)展有關(guān)[11]。關(guān)節(jié)軟骨中唯一存在的軟骨細(xì)胞的異常增殖和凋亡在OA的發(fā)病過程中具有重要作用[12]。lncRNA RNA是疾病病理研究中的重要調(diào)節(jié)劑,參與OA中軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡、炎癥反應(yīng)和ECM合成,進(jìn)而影響關(guān)節(jié)軟骨的合成和分解代謝[13]。越來越多的研究證據(jù)表明lncRNA NEAT1在OA軟骨中高表達(dá),沉默NEAT1可增強(qiáng)OA-軟骨細(xì)胞活性,誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和減少細(xì)胞凋亡[14-15]。P-15是包含15個(gè)氨基酸序列的合成多肽,可誘導(dǎo)骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞發(fā)生黏附、遷移、增殖和分化[16],其作為生物材料吸附于無機(jī)骨基質(zhì)(ABM)促進(jìn)骨相關(guān)融合手術(shù)中的骨化在臨床應(yīng)用中已得到驗(yàn)證[17]。然而目前P-15對(duì)HC-OA細(xì)胞的影響和機(jī)制尚不清楚。本研究通過體外培養(yǎng)HC-OA,發(fā)現(xiàn)P-15可降低胞內(nèi)lncRNA NEAT1水平,提示P-15具有成為治療OA藥物的潛在價(jià)值。

lncRNA的作用機(jī)制與其亞細(xì)胞定位密切相關(guān),核內(nèi)lncRNA主要參與表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄水平的基因調(diào)控,包括細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)調(diào)控;胞質(zhì)內(nèi)的LncRNA通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控間接影響基因表達(dá),以及作為ceRNA與microRNA相互作用[18-19]。因此,確定lncRNA的定位是預(yù)測(cè)其功能的關(guān)鍵。本研究的結(jié)果顯示,lncRNA NEAT1同時(shí)存在于HC-OA細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,且更多分布于細(xì)胞核,提示lncRNA NEAT1可能參與了蛋白調(diào)控。lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸是細(xì)胞分子信息傳遞的途徑之一,研究表明NEAT1可通過靶向SFPQ參與細(xì)胞調(diào)控[9]。因此,本研究進(jìn)一步探討lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸是否參與P-15對(duì)HC-OA細(xì)胞的調(diào)控作用。結(jié)果顯示,P-15處理HC-OA后,上調(diào)細(xì)胞中的SFPQ蛋白從而抑制RUNX2表達(dá),而敲低SFPQ可部分恢復(fù)由P-15介導(dǎo)的RUNX2表達(dá)抑制和軟骨細(xì)胞凋亡抑制,表明P-15可通過lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸負(fù)調(diào)控RUNX2基因表達(dá),抑制HC-OA細(xì)胞凋亡。此外,lncRNA NEAT1還可作為ceRNA靶向miR-543[20]、miR-193a-3p[21]等抑制軟骨細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究的結(jié)果顯示lncRNA NEAT1在細(xì)胞質(zhì)中也有分布,因此,P-15對(duì)OA軟骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用是否還與NEAT1的ceRNA調(diào)控功能相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

自噬(autophagy)是發(fā)生于真核細(xì)胞中的能夠清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細(xì)胞器、代謝產(chǎn)物,減輕細(xì)胞損傷[22]。LC3、Beclin-1和P62作為自噬相關(guān)蛋白,與自噬的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[23]。LC3作為自噬的特異性標(biāo)志性蛋白,自噬發(fā)生時(shí)LC3I會(huì)與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合而酶解形成LC3II,并使其進(jìn)入脂膜中而形成自噬體。Beclin-1是對(duì)細(xì)胞自噬和凋亡均有調(diào)節(jié)作用的自噬基因,能夠與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2結(jié)合而抑制自噬的發(fā)生。已有研究證實(shí),OA的發(fā)生過程中常伴隨軟骨細(xì)胞中自噬水平下降,而自噬水平下降往往會(huì)造成細(xì)胞凋亡及線粒體功能障礙[24]。高久瑜等[25]在大鼠顳下頜關(guān)節(jié)炎模型中檢測(cè)到軟骨細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ表達(dá)減少,凋亡指標(biāo)Caspase-3表達(dá)增多。細(xì)胞內(nèi)適度的自噬利于細(xì)胞生存,因此通過提高軟骨細(xì)胞自噬水平可能為OA治療靶點(diǎn)之一[26]。已知lncRNA NEAT1能夠通過激活自噬緩解OA,但P-15作用于lncRNA NEAT1的效果還尚不清晰[27]。本研究顯示,P-15促進(jìn)Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的相對(duì)表達(dá),抑制P62表達(dá);敲低SFPQ可在一定程度上下調(diào)P-15誘導(dǎo)的自噬正調(diào)控蛋白過表達(dá),并上調(diào)P62的表達(dá),提示P-15通過調(diào)控lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸誘導(dǎo)HC-OA細(xì)胞自噬。

綜上所述,P-15可能通過調(diào)控lncRNA NEAT1/SFPQ/RUNX2軸,誘導(dǎo)HC-OA細(xì)胞自噬,下調(diào)細(xì)胞凋亡,緩解OA的發(fā)展,具有成為治療骨關(guān)節(jié)炎藥物的潛在價(jià)值。