龍金華, 石歡歡, 陳 晉, 曾 柱

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 頭頸腫瘤科, 貴州 貴陽, 550004;2. 貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院/基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 貴州 貴陽, 550025)

乳腺癌是女性死亡的主要原因之一,其中60%以上的患者雌激素受體陽性[1]。為了降低乳腺癌復(fù)發(fā)和死亡的風(fēng)險,他莫昔芬作為雌激素受體調(diào)節(jié)劑一直是輔助治療的黃金標準[2]。但是,他莫昔芬是高疏水性分子,這限制了其在臨床上的生物利用度和給藥方式。目前,利用蛋白質(zhì)裝載藥物是一種提高藥物臨床性能的前沿技術(shù),其中疏水性較好的蛋白質(zhì)在載藥方面具有發(fā)展前景[3-5]。從生理學(xué)角度看,親脂性藥物一旦進入血流,往往與血漿中的蛋白質(zhì)(如血清白蛋白、低密度脂蛋白和α、β、γ糖蛋白)結(jié)合,形成可逆或不可逆的藥物-蛋白復(fù)合物[6]。藥物-蛋白復(fù)合物的形成可以增加藥物的溶解度,降低藥物毒性,防止藥物氧化,從而改變藥物對不同生物組織的親和力[7]。然而,提取、純化和保存血漿來源的蛋白都比較繁瑣且成本昂貴,這限制了此類蛋白在藥物載體中的大規(guī)模應(yīng)用。因此,開發(fā)一種廉價且可廣泛獲得的蛋白質(zhì)作為藥物載體十分重要。

β-乳球蛋白(BLG)是一種從牛奶中提取的球狀蛋白,占牛奶總蛋白質(zhì)量的7%～12%[8]。工業(yè)生產(chǎn)上, BLG因易于獲得、易于純化和營養(yǎng)價值高而被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[9]。BLG屬于脂質(zhì)蛋白超家族,含有162個氨基酸殘基,分子量為18.3 kDa, 在二級結(jié)構(gòu)水平上由9條反平行的β-strand(A～I strand)和1條α-helix組成。其中, 8條β-strand(A-H strand)折疊形成了一個扁平的β桶型結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)可提供多個潛在的藥物結(jié)合區(qū)域,包括β桶中央疏水腔、α-helix與β桶之間的凹槽以及β桶底部附近的外表面[10-12]。β桶型結(jié)構(gòu)的中央疏水腔對pH值敏感,通過EF環(huán)可逆開閉進行控制。EF環(huán)在pH值大于7.1時開啟,在pH值小于7.1時關(guān)閉[11]。近年來, BLG在藥物裝載和運輸領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注[13]。研究[14-20]表明, BLG可以結(jié)合多種疏水性和兩親性的小分子藥物,如卟啉、阿司匹林、鉑配合物、5-氟尿嘧啶、白藜蘆醇和槲皮素等。因此, BLG有望成為他莫昔芬的載體。但BLG與他莫昔芬的結(jié)合機制尚不清楚,特別是不同pH值條件下可能存在的結(jié)合模式差異仍有待深入研究。本研究采用熒光光譜技術(shù)研究了BLG在不同pH值條件下與他莫昔芬的相互作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

β-乳球蛋白(美國Sigma-Aldrich公司,批號SLCF4944, 純度≥90.0%); 他莫昔芬(上海源葉生物科技有限公司,批號Y22J12E138193, 純度98.0%); 甲醇(成都金山化學(xué)試劑有限公司,批號20230806, 純度≥99.5%); 磷酸緩沖鹽溶液(深圳默鴻科技有限公司,批號B0015-NOV-05H, 濃度0.01 mol/L); 氫氧化鈉(重慶川東化工有限公司,批號20201201, 純度≥96.0%); 鹽酸(重慶川東化工有限公司,批號20230101, 純度36.0%～38.0%); F-4600型熒光分光光度計(日本日立公司)。

1.2 原液配制

稱取0.018 3 g的BLG粉末于容量瓶中,然后加入適量pH值7.4的無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS), 使其完全溶解后定容至10 mL, 得到濃度為100 μmol/L BLG溶液,于4 ℃冷藏備用; 稱取0.037 2 g的他莫昔芬粉末于容量瓶中,加入適量的甲醇,使其完全溶解后定容至10 mL, 濃度為10 mmol/L, 然后將10 mmol/L他莫昔芬溶液用pH值7.4的無菌磷酸緩沖鹽溶液稀釋10倍,得到1 mmol/L他莫昔芬溶液, 4 ℃冷藏備用。

1.3 BLG-他莫昔芬復(fù)合物的制備

分別在pH值6.2和pH值7.4的PBS溶液中加入0.4 mL的100 μmol/L BLG溶液和適量的1 mmol/L他莫昔芬溶液,并用相應(yīng)酸堿度的PBS定容至4 mL, 制備不同配比的BLG-他莫昔芬復(fù)合物,其中他莫昔芬終濃度分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μmol/L, BLG終濃度為10 μmol/L。將得到的BLG-他莫昔芬溶液分別用1 mol/L HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH值6.2或7.4, 分別在27 ℃或37 ℃孵育30 min。

1.4 熒光猝滅實驗

為了確定BLG中熒光猝滅的主要基團,將激發(fā)波長和發(fā)射波長之間的固定間隔(△λ)分別設(shè)置為15 nm用于分析酪氨酸(Tyr), 60 nm用于分析色氨酸(Trp), 并通過熒光分光光度計記錄同步熒光光譜。為了進一步計算色氨酸的熒光猝滅參數(shù),將激發(fā)和發(fā)射單色器的帶寬設(shè)置為5 nm, 樣品溶液在295 nm處激發(fā),記錄300～500 nm波長的熒光發(fā)射光譜。在熒光猝滅分析之前,對每個樣品的熒光強度進行校正,以排除內(nèi)濾效應(yīng)。熒光猝滅參數(shù)采用修正Stern-Volmer方程[14](公式1和2)計算,當?shù)鞍讱埢鶎μ结樀目杉靶源嬖诓町悤r,這種修正Stern-Volmer方程可以更好地區(qū)分可及的氨基酸殘基和不可及氨基酸殘基。

(1)

KSV=Kqτ0

(2)

其中F0和F分別為他莫昔芬不存在和存在時的最大熒光強度; [C]為他莫昔芬的濃度;KSV為猝滅常數(shù),fa是可達熒光的分數(shù);τ0為熒光團的熒光平均壽命;Kq為計算得到的分子猝滅速率常數(shù)。

1.5 熱力學(xué)分析

根據(jù)公式3計算配體-蛋白質(zhì)復(fù)合物形成的結(jié)合參數(shù)[21], 根據(jù)van′t Hoff方程[22]計算熱力學(xué)參數(shù)(公式4)。其中,R為氣體常數(shù);Kb為相應(yīng)熱力學(xué)溫度(T)下的結(jié)合常數(shù);n為每個蛋白分子的平均結(jié)合位點數(shù); △G、△H和△S分別為吉布斯自由能、焓變和熵變。

(3)

△G=-RTlnKb=△H-T△S

(4)

2 結(jié) 果

2.1 同步熒光猝滅

熒光猝滅是分子與蛋白質(zhì)相互作用中經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn)象,可以用來分析分子-蛋白質(zhì)相互作用的機制。根據(jù)既往研究[23-24], β-桶的中心疏水腔是BLG結(jié)合疏水分子的主要位點,其可達性取決于pH值7.1左右EF環(huán)的開閉狀態(tài)。由于BLG內(nèi)部含有2種熒光團: 酪氨酸殘基(Tyr-20、42、99和101)和色氨酸殘基(Trp-19和61), 本研究利用熒光光譜技術(shù)在不同pH值條件下(pH值7.4或pH值6.2)探索了BLG與他莫昔芬的結(jié)合。為了確定BLG中主要的熒光猝滅貢獻者,采用同步熒光研究,設(shè)置△λ=60 nm表征Trp殘基, △λ=15 nm表征Tyr殘基。如圖1所示,隨著他莫昔芬的濃度由0 μmol/L增加到40 μmol/L, Trp殘基的熒光強度明顯強于Tyr殘基,而且Trp的熒光猝滅程度遠比Tyr殘基的熒光猝滅程度明顯。

A: pH值7.4, △λ=60 nm; B: pH值7.4, △λ=15 nm; C: pH值6.2, △λ=60 nm; D: pH值6.2, △λ=15 nm。

2.2 熒光猝滅與修正Stern-Volmer公式計算

考慮到只有Trp殘基產(chǎn)生激發(fā)波長為295 nm的熒光發(fā)射,因此在BLG溶液中添加不同濃度的他莫昔芬溶液,并在295 nm處激發(fā),記錄300～500 nm波長的發(fā)射光譜。如圖2A和2B所示,隨著他莫昔芬濃度的增加,在334 nm處的熒光強度逐漸降低,說明BLG與他莫昔芬的相互作用會導(dǎo)致Trp殘基的熒光猝滅。為了研究其具體的猝滅機理,利用修正Stern-Volmer方程(公式1和2)計算熒光猝滅參數(shù),其中根據(jù)文獻BLG色氨酸殘基的熒光平均壽命τ0為1.28 ns[25-26]。從圖2C和2D可以看出,F0/(F0-F)對1/[C]值的依賴關(guān)系都是線性的,所計算的修正Stern-Volmer公式猝滅常數(shù)列于表1中。pH值為7.4時,Kq值為6.256×1012～8.742×1012mol/(L·s), pH值為6.2時,Kq值為4.719×1012～5.734×1012mol/(L·s)。pH值為7.4和6.2時, BLG與他莫昔芬相互作用的Kq值都遠高于動態(tài)猝滅常數(shù)的最大Kq值2.0×1010mol/(L·s)[27]。這表明靜態(tài)猝滅占主導(dǎo)地位,導(dǎo)致BLG-他莫昔芬復(fù)合物的形成。

表1 BLG-他莫昔芬復(fù)合物的猝滅速率常數(shù)(Kq)和猝滅常數(shù)(Ksv)

A: pH值7.4; B: pH值6.2; C: pH值7.4; D: pH值6.2。

2.3 熱力學(xué)分析

熒光猝滅結(jié)果表明, BLG與他莫昔芬之間的相互作用導(dǎo)致了復(fù)合物的形成。在此情況下,配體-蛋白復(fù)合物的結(jié)合參數(shù)可通過公式3計算。從圖3可以看出, log[(F0-F)/F]對log[C]值的依賴關(guān)系在所有組中都是線性的,因此Kb值被計算并列在表2中?；诘玫降腒b值,根據(jù)van′t Hoff方程(公式4)計算出熱力學(xué)參數(shù)△G、△H、△S, 如表3所示。

表2 BLG-他莫昔芬復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)

表3 BLG-他莫昔芬復(fù)合物的熱力學(xué)參數(shù)

A: pH值7.4; B: pH值6.2。

BLG-他莫昔芬復(fù)合物△G值小于0, 這意味著其形成過程是自發(fā)的?！鱄和△S值是判斷穩(wěn)定配體-蛋白質(zhì)復(fù)合物的主要4種非共價力的有用標準[21-22, 28]: △H<0且△S<0, 為范德華力或者氫鍵; △H<0且△S>0, 為靜電相互作用; △H>0且△S>0, 為疏水力。BLG-他莫昔芬復(fù)合物的△H和△S值均大于0, 由此可見BLG與他莫昔芬分子之間主要依靠疏水力結(jié)合。

3 討 論

本研究對BLG與他莫昔芬在堿性和酸性條件下(pH值7.4和6.2)的結(jié)合機制進行研究,以探索BLG作為他莫昔芬載體的潛能。同步熒光猝滅的結(jié)果表明,他莫昔芬會導(dǎo)致BLG中Trp殘基的熒光信號猝滅,是熒光猝滅的主要原因。Trp殘基的固有熒光幾乎完全是由Trp-19產(chǎn)生而不是Trp-61產(chǎn)生,因為Trp-19位于非極性中,而Trp-61則是部分暴露于水溶液中[29]。熒光猝滅分析表明,熒光猝滅的主要機制是靜態(tài)的,意味著導(dǎo)致熒光猝滅的主要原因是BLG-他莫昔芬復(fù)合物的形成,而不是BLG與他莫昔芬分子的動態(tài)碰撞。BLG-他莫昔芬復(fù)合物在pH值7.4時的Ksv值略大于pH值6.2時(表1), 表明BLG-他莫昔芬復(fù)合物的形成效率可能取決于β-桶中央疏水腔的狀態(tài),即EF環(huán)的開閉狀態(tài)會影響他莫昔芬與BLG的結(jié)合。熱力學(xué)分析結(jié)果表明,隨著溫度的升高, BLG-他莫昔芬復(fù)合物的Kb值增加,表明加熱有利于復(fù)合物的形成。BLG-他莫昔芬復(fù)合物的形成主要依靠疏水力結(jié)合,其是自發(fā)的吸熱過程。疏水力屬于非共價結(jié)合,其結(jié)合力強度弱于共價結(jié)合,這有利于他莫昔芬分子的釋放,特別是可以利用不同pH值條件下他莫昔芬與BLG結(jié)合位置的不同,來設(shè)計pH值敏感型的藥物載體。本研究為闡述BLG與他莫昔芬分子之間的非共價相互作用機制提供了新的思路,同時也預(yù)示了BLG作為載體在遞送難溶性藥物方面具有潛在應(yīng)用價值。