邱 實, 宋鵬飛, 常志紅, 夏迎龍, 張立新, 李 然,連思博, 王懿馨, 劉 杰, 2

(1. 中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心 檢驗科, 北京, 100700;2. 南方醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣東 廣州, 510280)

血細胞形態(tài)學(xué)檢查包括對外周血白細胞(WBC)的計數(shù)和形態(tài)學(xué)的分析,目前仍是臨床上血液系統(tǒng)疾病和非血液系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)診斷與常規(guī)血液學(xué)檢驗的重要項目,是最基本、最簡便實用的檢查方法[1-3]。目前,血細胞計數(shù)已經(jīng)擺脫了傳統(tǒng)手工操作、顯微鏡下檢查的方式,可以由自動血液分析儀完成[4]。但血細胞分析儀尚不具備識別紅細胞、白細胞、血小板形態(tài)的能力,無法完全替代顯微鏡對血細胞的識別和分類檢查[5]。細胞學(xué)家、數(shù)學(xué)家和工程師之間的密切合作,促進了正常血細胞數(shù)字圖像處理自動工具的發(fā)展[6-7]。目前,市面上主流的全自動血細胞數(shù)字化分析儀DM/DI系列,如全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀采用人工智能(AI)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)對WBC進行分類。為了進一步評估全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀對外周血WBC預(yù)分類的能力,并探討全自動血細胞形態(tài)學(xué)數(shù)字圖像分析在WBC形態(tài)學(xué)檢查中的臨床應(yīng)用價值,本研究以手工計數(shù)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)參考,比較了目前國內(nèi)醫(yī)院檢驗科常用的全自動血液分析儀,對全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀計數(shù)法的臨床計數(shù)結(jié)果進行比較研究,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機收集2023年1—5月中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心住院和門診患者的乙二胺四乙酸二鉀抗凝靜脈血標(biāo)本306份,其中感染性疾病患者15例,實體腫瘤患者18例,血液病患者20例,其他疾病患者54例,健康體檢者199例; 男162例(52.9%), 平均年齡(39.4±20.8)歲; 女144例(47.1%), 平均年齡(35.5±18.6)歲。本研究獲得中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑

全自動血液分析儀xn-20(日本希森美康公司),全自動血液分析儀xn-10(日本希森美康公司),全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀SP-10(日本希森美康公司),全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀DI-60(日本希森美康公司), CX23光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司),瑞氏-吉姆薩染色液(美國Sigma-Aldrich公司)。

1.3 全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀計數(shù)

血液采集后4 h內(nèi),采用全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀SP-10自動推片染色儀制備外周血涂片,并應(yīng)用全自動血細胞分析儀對200個WBC進行自動分析,采用人工智能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)將WBC分為19類,包括中性桿狀核粒細胞、中性分葉核粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、中性早幼粒細胞、中性中幼粒細胞、中性晚幼粒細胞、幼稚嗜酸粒細胞、幼稚嗜堿粒細胞、幼稚單核細胞、幼稚淋巴細胞、原始細胞、異型淋巴細胞、漿細胞、大顆粒淋巴細胞、毛細胞、賽塞利細胞。白細胞分析工作步驟為: 根據(jù)巴特曼形式對白細胞層進行掃描,即從血涂片細胞層較厚一側(cè)固定位置開始搜索單細胞層并定位; 自動轉(zhuǎn)換到100倍物鏡,系統(tǒng)開始抓取細胞圖像; 獲得專利的自動對焦技術(shù)(使用人工智能預(yù)測方向和距離呈現(xiàn)出一張最佳對焦的圖像,該過程只需1～3張圖像)進行自動對焦; 當(dāng)細胞被對焦后,即對細胞特性進行切分(放大100倍),對360種以上的特性進行分析; 進行細胞預(yù)分類(人工智能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)),向細胞層較薄一側(cè)逐一掃描,在10倍鏡下抓取圖像,直到確定單細胞層起止點; 最后保存細胞圖像及數(shù)字掃描區(qū)域圖像。

1.4 全自動血液分析儀計數(shù)

對所有樣本采用全自動血液分析儀xn-20/xn-10進行WBC計數(shù)分析。嚴(yán)格按照儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進行日常操作,開機維護后,檢測其質(zhì)控結(jié)果,若有失控情況及時處理,各項質(zhì)控均在控后,作為常規(guī)標(biāo)本將實驗標(biāo)本進行檢測,并記錄其WBC結(jié)果。需要說明的是,全自動血細胞分析儀僅能識別WBC 5個種類: 粒細胞(一般默認是中性分葉核細胞)、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞。

1.5 手工計數(shù)法

由3位形態(tài)學(xué)專家根據(jù)《WS/T246-2005白細胞分類參考方法》[8]對所有標(biāo)本進行WBC手工計數(shù),即先由第1位專家和第2位專家對每個標(biāo)本的2張血涂片分別鏡檢,并對200個白細胞進行分類,當(dāng)2位專家結(jié)果超出95%置信區(qū)間時,再由第3位更資深的專家選取第3張血涂片進行確認,輸出最終的人工鏡檢結(jié)果。評估專家審核后的WBC分類結(jié)果與人工顯微鏡鏡檢結(jié)果的相關(guān)性。上述19類WBC種類手工計數(shù)法均可識別。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀、全自動血液分析儀和手工計數(shù)法對白細胞預(yù)分類結(jié)果的比較

采用全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀、全自動血液分析儀和手工計數(shù)法共3種方法對白細胞進行預(yù)分類,全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀識別的白細胞種類最多,原則上可識別白細胞種類共19類; 本研究統(tǒng)計的血液樣本識別結(jié)果顯示,全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀共識別出12類白細胞種類,除了識別出的6類成熟WBC(中性桿狀核粒細胞、中性分葉核粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞)外,也可識別各階段幼稚粒細胞和異常細胞共6類; 其中原始細胞、漿細胞只有全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀檢出。手工計數(shù)法共識別出白細胞種類11類。全自動血細胞分析儀識別出的白細胞種類最少,共7類。3種方法均能識別出的白細胞種類共7類,包括5類成熟WBC、異型淋巴細胞和中性早幼粒細胞。見圖1。

圖1 3種方法對白細胞預(yù)分類的結(jié)果比較

全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀與手工計數(shù)法比較的配對卡方檢驗結(jié)果顯示χ2=0,P>0.999, 提示2種方法對WBC預(yù)分類種類比較不存在差異; 一致性檢驗顯示Kappa=0.67,P=0.000 1, 提示2種方法診斷結(jié)果具有中等一致性。全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀與全自動血細胞分析儀比較的配對卡方檢驗結(jié)果提示2種方法存在差異(χ2=5.14,P=0.02), 2種方法診斷結(jié)果存在較差一致性(Kappa=0.34,P=0.02)。上述結(jié)果表明全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀識別白細胞種類的能力較好。

2.2 全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀、全自動血液分析儀和手工計數(shù)法計數(shù)結(jié)果比較

對3種方法計數(shù)WBC結(jié)果進行比較分析, 3組配對樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗結(jié)果顯示,除了中性早幼粒細胞外,其他白細胞分類在3種方法間存在差異,其中全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀與全自動血液分析儀對中性早幼粒細胞計數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。采用全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀和手工計數(shù)法對6類成熟WBC種類、3類幼稚粒細胞及異型淋巴細胞計數(shù)的結(jié)果均相近,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2。由此可見, 3種方法比較結(jié)果差異的主要來源是全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀與全自動血液分析儀,全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀和手工計數(shù)法對絕大多數(shù)白細胞種類計數(shù)具有可比性,結(jié)果可靠。

表1 全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀、全自動血液分析儀和手工計數(shù)法的WBC計數(shù)結(jié)果

A: 中性桿狀核粒細胞計數(shù)情況; B: 中性分葉核粒細胞計數(shù)情況; C: 淋巴細胞計數(shù)情況; D: 單核細胞計數(shù)情況;E: 嗜酸性粒細胞計數(shù)情況; F: 嗜堿性粒細胞計數(shù)情況。與血液分析儀比較, ****P<0.000 1。

2.3 全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀與手工計數(shù)法的相關(guān)性分析

對WBC樣本進行Passing-Bablok回歸分析,計算全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀與手工計數(shù)法結(jié)果的相關(guān)性,結(jié)果顯示, 6類成熟WBC(中性分葉核粒細胞、中性桿狀核粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞)的全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀與手工計數(shù)法計數(shù)結(jié)果相關(guān)性良好(相關(guān)系數(shù)r>0.8, 截距均接近0, 斜率均接近1), 表明全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀與手工計數(shù)法結(jié)果具有較好的一致性。這6類細胞的斜率均接近或等于1, 一致性較好。在中性分葉核粒細胞的Passing-Bablok回歸方程中,截距為0, 表明2種方法間沒有恒定系統(tǒng)誤差。其余異常WBC因樣本量較小或數(shù)據(jù)計算過程中存在過多待定回歸系數(shù)的重抽樣樣本,無法進行回歸分析。見圖3、表2。

表2 全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀與手工計數(shù)法的相關(guān)性分析

A: 2種方法在中性桿狀核粒細胞中的相關(guān)性; B: 2種方法在中性分葉核粒細胞中的相關(guān)性; C: 2種方法在淋巴細胞中的相關(guān)性;D: 2種方法在單核細胞中的相關(guān)性; E: 2種方法在嗜酸性粒細胞中的相關(guān)性; F: 2種方法在嗜堿性粒細胞中的相關(guān)性。

3 討 論

盡管外周血形態(tài)學(xué)具有重要的診斷作用,但沒有用于定義細胞學(xué)變量的客觀值。血細胞獨特的細胞學(xué)特征是主觀的,并受審閱者解釋的影響[9]。目前基于外周血涂片自動形態(tài)學(xué)計算機成像的新型血液分析儀在國內(nèi)外快速發(fā)展,隨著生物信息學(xué)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的需求不斷增加,血細胞形態(tài)分析受到了廣泛關(guān)注[10-11]?；贏I技術(shù)的數(shù)字顯微鏡和計算機圖像分析可以提供更準(zhǔn)確和客觀的形態(tài)學(xué)評估,將細胞學(xué)定性參數(shù)轉(zhuǎn)化為定量值?；趫D像分析的定量形態(tài)學(xué)特征可提取大量描述相關(guān)細胞形態(tài)特征的測量值和參數(shù); 通過自動或計算機化圖像分析從數(shù)字圖像中提取有意義的信息,從而達到對不同類別的細胞進行預(yù)分類的目的[9]。本研究評估的全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀根據(jù)AI神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)可將WBC分為19類,包括成熟WBC和異常細胞。由于目前該設(shè)備臨床評估較少,因此本研究對該儀器的WBC預(yù)分類功能進行評估和比較。

本研究結(jié)果表明,采用3種不同的方法(全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀、全自動血液分析儀和手工計數(shù)法)檢測相同的血液樣本,全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀可識別出最多的WBC種類共12類,包括了6類成熟WBC和6類異常細胞,其中原始細胞和漿細胞是全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀所特有識別的。全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀采用了深度學(xué)習(xí)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法,機器學(xué)習(xí)分類器使用360種以上的特征進行訓(xùn)練,用于自動識別異常細胞圖像,可大大提高不同類型細胞識別的符合率和檢出率[12-13]。

細胞識別譜是指自動化血細胞分析儀能識別分類或判定細胞形態(tài)學(xué)特征并可給出細胞預(yù)分類、細胞形態(tài)學(xué)變化預(yù)表征結(jié)果的各種細胞類型或形態(tài)學(xué)特征的集合[12]。細胞識別譜的范圍越寬,細胞種類越完整,形態(tài)學(xué)特征判定越精準(zhǔn),血細胞形態(tài)學(xué)分析儀的臨床適用范圍越廣,尤其是對異常細胞的識別,可減少臨床疾病尤其是惡性血液病的漏檢率,及時為臨床提供有價值的細胞診斷信息[14-16]。由于異常細胞形態(tài)多變,有些異常細胞的特性還不典型,手工計數(shù)法極大地依賴于識別者的知識結(jié)構(gòu)和經(jīng)驗,基于不同專家之間存在識別差異,常常會出現(xiàn)漏檢甚至是誤檢。AI輔助血細胞形態(tài)學(xué)檢查的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化,可保證AI血細胞形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性。

3種方法對WBC種類計數(shù)結(jié)果顯示,全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀對6類成熟WBC、各階段幼稚細胞和異常細胞(異型淋巴細胞)計數(shù)與手工計數(shù)結(jié)果無顯著差異,具有良好的一致性; 全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀和全自動血液分析儀對WBC計數(shù)的差異較大,顯示了2種機器不同的WBC分類性能。相關(guān)性結(jié)果顯示,全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀和手工計數(shù)法計數(shù)6類成熟WBC有良好的相關(guān)性。除中性分葉核粒細胞相關(guān)系數(shù)r>0.8外,其余成熟WBC的2種方法計數(shù)結(jié)果相關(guān)系數(shù)r>0.9, 這可能是由于該儀器拍攝的中性分葉核粒細胞圖像與顯微鏡下直接觀察到的細胞形態(tài)有一定的差別。參考細胞庫的容量會影響細胞預(yù)分析結(jié)果的符合率。在使用擴充的參考細胞庫預(yù)分析時,具有重要臨床意義細胞的分析符合率較使用初始參考細胞庫時有明顯提高[17]。由此提示,在實際工作中需要不斷完善參考細胞庫以提高預(yù)分析結(jié)果的符合率。由于異常細胞陽性標(biāo)本較少,異常細胞的相關(guān)性分析無法進行。后續(xù)研究將繼續(xù)收集異常細胞的樣本,進一步分析其全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀計數(shù)與人工計數(shù)結(jié)果的相關(guān)性。

綜上所述,全自動細胞形態(tài)學(xué)分析儀可分類更多的WBC種類,可提供與手工顯微鏡檢高度一致的WBC計數(shù)結(jié)果,且兩者計數(shù)具有良好的相關(guān)性。AI在血細胞形態(tài)分析上的應(yīng)用可大大提高WBC形態(tài)分析的效率,在保證檢查結(jié)果準(zhǔn)確性的同時減少人力投入,提高血細胞分析質(zhì)量,降低相應(yīng)疾病的漏檢率。