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（1.湖南省湘潭市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 湘潭 411199；2.湖南省湘潭市第一人民醫(yī)院，湖南 湘潭 411104；3.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410007；4.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410021）

骨折是由于遭受外力導致骨的完整性和連續(xù)性中斷的現(xiàn)象，特征主要有患處畸形、運動異常、骨擦感。隨著經濟的不斷發(fā)展，各類突發(fā)狀況的加多，各種意外情況所導致的骨折日益增多［1］。臨床流行病學研究表明，5%～10%的骨折患者存在骨折愈合失敗的風險，其中股骨最高達到13.9%的骨折愈合失敗風險［2］。本課題組在長期臨床工作和實踐中發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)活血化瘀的代表性方劑桃紅四物湯，能夠加快脛腓骨骨折愈合，使骨折愈合的效率顯著升高［3］。研究表明，TLR2 信號通路的激活可促進多種疾病的血管生成［4］，并且參與了調控破骨細胞分化的過程［5］。據(jù)此，本研究旨在探討桃紅四物湯介導TLR2 抑制破骨細胞分化促進骨折愈合的機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

RAW264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞），貨號：CL-0190，購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 實驗藥物

桃紅四物湯，組方：桃仁20 g，紅花10 g，當歸20 g，生地黃20 g，赤芍20 g，川芎10 g［6］。飲片由湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科中藥房提供。研磨藥材并加水浸泡30 min，然后通過用沸水沖洗2 h 提取，在65 ℃下液泡成顆粒。3.78 g 桃紅四物湯藥材可以制成1 g顆粒。將桃紅四物湯顆粒密封，室溫無光條件下保存。用時將顆粒溶于完全培養(yǎng)基中，制成600 μg/mL的桃紅四物湯水提液。

1.3 試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基購自Giboco 公司，RANKL、TLR2 激動劑均購自Sigma 公司，TLR2 抗體購自Abcam 公司，30%甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、甘氨酸、Tris、Real Band 蛋白預染Marker、20×TBS 緩沖液、脫脂奶粉均購自上海生工公司，SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（1×）、TEMED、SDS、BeyoCoLorTM彩色預染蛋白分子量標準、RIPA 裂解液（強）、TEMED、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型）均購自上海碧云天公司，PVDF 膜購自上海默克化工技術有限公司，NaCl 購自美國科賽特科技有限公司，超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒（250 mL）購自蘇州新賽美生物科技有限公司，甲醇購自國藥集團化學試劑有限公司，TRIzol 購自Thermo Fisher Scientific，RNase-free Water 購自索萊寶，異丙醇、無水乙醇均購自天津恒興，逆轉錄試劑盒購自genecopoeia，Beyo-FastTMSYBR Green qPCR Mix 購自Bio-Rad，200 μL PCR 管（無酶）、10 μL 槍頭（無酶）均購自NEST，α-MEM 培養(yǎng)基購自深圳華晨陽科技有限公司，穩(wěn)壓電源（電泳用）、SDS-PAGE 蛋白電泳儀、蛋白轉膜儀、化學發(fā)光成像系統(tǒng)、垂直電泳槽、轉印電泳槽、電泳儀、化學發(fā)光成像系統(tǒng)均購自上海天能，脫色搖床購自其林貝爾，臺式高速冷凍離心機、臺式高速冷凍離心機均購自HeaLForce，雪花制冰機購自雪科，超純水儀購自ELGA，熒光定量PCR 儀購自德國耶拿，多功能酶標儀購自PerkinELmer。

1.4 細胞模型與分組

將RAW 264.7 細胞在含有10%胎牛血清、4 mmoL谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在5%CO2、37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)1～2 d，使細胞傳代，對數(shù)生長。再將細胞分為對照組、桃紅四物湯組、TLR2組、桃紅四物湯+TLR2 組。對照組：RAW 264.7 細胞需要在含100 μg/L RANKL 的α-MEM 培養(yǎng)基中進行誘導，培養(yǎng)基中的液體需要隔天換1 次，通過4～5 d 的誘導培養(yǎng)后能產生足量的多核細胞。桃紅四物湯組：RAW 264.7 細胞在上述相同培養(yǎng)基中進行誘導，誘導的第3天加入600 μg/mL的桃紅四物湯水提物，再孵育48 h。TLR2組：RAW 264.7細胞先在TLR2激動劑中預處理1 h，再使用上述相同培養(yǎng)基進行誘導。桃紅四物湯+TLR2 組：RAW 264.7 細胞先在TLR2 激動劑中預處理1 h，然后在上述相同培養(yǎng)基中進行誘導，誘導的第3天加入600 μg/mL的桃紅四物湯水提物，再孵育48 h。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色 選用2.5%戊二醛固定細胞，用二甲基甲醛將底物進行充分溶解，再將緩沖液倒入其中；將亞硝酸鈉和副品紅按照1∶1的比例進行混合，放置于安靜狀態(tài)下1 min，再將緩沖液加入；最后將酒石酸加到緩沖液中，TRAP 染液完成配置。在37 ℃的培養(yǎng)皿中加入TRAP染液，進行1 h染色；用蒸餾水將細胞清洗干凈，再用1%甲基綠對其細胞核進行再次染色；破骨細胞染色后，呈現(xiàn)出寶石紅色，且核紅染的細胞不少于3 個，即為TRAP+破骨細胞；最后進行拍照，觀察每張玻片的TRAP 染色為陽性的破骨細胞，并將數(shù)量進行記錄。

1.5.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR） 通過Total RNA 提取，反轉錄，實時熒光定量PCR，PCR 結束后用2-ΔΔCt分析方法對所記錄的數(shù)據(jù)進行分析。

1.5.3 蛋白質印跡實驗（WB） 通過總蛋白抽提與定量，電泳，轉膜，封閉后將在4 ℃下一抗孵育；然后洗膜，室溫下孵育PVDF膜2 h，進行二抗孵育，TBST洗膜3次，每次10 min；將膜放在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中，涂布均勻；化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光30/60 s，觀察結果并保存圖片。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組破骨細胞的形態(tài)觀察

結果顯示，與對照組比較，桃紅四物湯組活躍的破骨細胞質內細胞核數(shù)量減少，TLR2組破骨細胞質內可以看到大量細胞核存在，而且體積顯著增大，桃紅四物湯+TLR2組與TLR2組對比，桃紅四物湯+TLR2組破骨細胞質內細胞核數(shù)量減少，體積也明顯減小。見圖1。

圖1 各組破骨細胞的形態(tài)（TRAP染色）

2.2 各組TLR2 mRNA的表達比較

見表1、圖2。結果顯示，與對照組相比，桃紅四物湯組TLR2 mRNA 的表達顯著下調（P＜0.05）；與對照組相比，TLR2 組的TLR2 mRNA 的表達顯著上升（P＜0.01）；與桃紅四物湯組比，TLR2 組、桃紅四物湯+TLR2 組的TLR2 mRNA 的表達顯著上升（P＜0.01）；與TLR2 組比，桃紅四物湯+TLR2 組TLR2 mRNA 的表達顯著下調（P＜0.01）。

表1 各組TLR2 mRNA及TLR2蛋白表達比較（±s）

表1 各組TLR2 mRNA及TLR2蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與桃紅四物湯組比較，##P ＜0.01；與TLR2組比較，△△P ＜0.01。

TLR2蛋白0.996±0.045 0.480±0.045*2.583±0.057**1.523±0.135##△△組 別對照組桃紅四物湯組TLR2組桃紅四物湯+TLR2組n3333 TLR2 mRNA 1.002±0.069 0.584±0.053*3.405±0.119**1.701±0.162##△△

圖2 各組TLR2蛋白條帶

2.3 各組TLR2蛋白表達比較

見表1、圖2。結果顯示，與對照組相比，桃紅四物湯組TLR2 蛋白的表達顯著下調（P＜0.05）；與對照組相比，TLR2組的TLR2蛋白的表達顯著上升（P＜0.01）；與桃紅四物湯組比，TLR2 組、桃紅四物湯+TLR2 組的TLR2 蛋白的表達顯著上升（P＜0.01）；與TLR2 組比，桃紅四物湯+TLR2 組TLR2 蛋白表達顯著下調（P＜0.01）。

3 討 論

骨或骨小梁的完整性或連續(xù)性遭到斷裂稱為骨折。骨折這一病名最早見于唐·王燾的《外臺秘要》。骨折的原因主要分為內外兩因，大多數(shù)骨折由外因導致。外因主要包括車禍、撞擊等引起的直接暴力，也可由間接暴力、肌肉韌帶忽然的劇烈牽引力、長期同一姿勢等引起的勞損等引起。內因主要包括患者的年齡、骨質的結構等變化。如老年人因為年齡大，常易導致骨質疏松，可能打噴嚏就能發(fā)生脆性骨折。骨的正常生長和愈合主要是因為骨代謝的正常進行，骨化需要同時滿足兩個條件：一是需要正常的骨組織，這是骨化的必要條件；二是需要在軟骨細胞的作用下才能進行，兩者缺一不可。只有通過機體中的成骨細胞和破骨細胞的相互影響相互約束，才能維持骨代謝的正常進行［7］。隨著中醫(yī)藥事業(yè)的不斷進步，在骨折愈合方面中醫(yī)藥的治療發(fā)揮著越來越大的作用，在骨損傷愈合的治療上療效突出，從古至今都是骨科方面的研究重點［8］。中醫(yī)學認為骨折愈合主要包括第一階段的瘀血消除，第二階段新血的生成，最后階段骨折的愈合。古代有許多醫(yī)案、書籍記載了在骨傷科的治療方面“活血化瘀”最為重要［9］。骨骼的生長和重建主要通過骨骼的血液供應。骨折后血液供應的質量直接影響骨骼愈合過程的快慢，并與其愈合有關。骨形成和骨重建與血管的生成息息相關［10］。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為一旦有骨折宜先運用活血化瘀的中藥，血不活，則骨不能接［11］。

桃紅四物湯主要功效是補血的同時能活血，兼有消腫止痛、去瘀生新的作用［12］。方中君藥為桃仁、紅花。桃仁有效成分為苦杏仁苷，而羥基紅花黃色素A是紅花中的主要成分，兩者的主要作用是促進微循環(huán)，抑制血小板聚集，在活血化瘀中起關鍵作用，主要用于治療骨折、痛經、骨質疏松、冠心病等疾病［13］。川芎中含有阿魏酸，具有抗炎、消腫等作用［14］。當歸中含有藁本內酯，能夠舒張血管，同樣具有很好的活血化瘀作用［15］。研究發(fā)現(xiàn)，赤芍能夠對血管的彈性進行改善，芍藥苷是它的主要成分［16］。毛蕊花糖苷是生地黃的主要成分，它主要的作用是提高人體免疫、延緩衰老等［17］。整方合用，能夠加快骨折愈合的速度。桃紅四物湯主要通過改善血流變特性、促進HIF-1的分泌、加快骨折區(qū)域的血管新生、增加eNOS 和NO 及VEGF 的水平等［18］，為桃紅四物湯對骨折的治療提供了更加充分的理論支持。

骨折的愈合是一個十分復雜的過程，其本質是骨折端發(fā)生的骨重建和成形過程。通過破骨細胞和成骨細胞的相互作用來實現(xiàn)骨重建。成骨細胞和破骨細胞的共同參與完成骨組織代謝，為達到動態(tài)平衡，機體需通過骨形成和骨吸收之間的不斷轉化。電鏡下可以看到，破骨細胞的褶皺膜上有許多結構完全不同的亞結構，這是破骨細胞行使骨吸收功能的保證，褶皺膜由于其不規(guī)則的表面而大大增加了各個亞結構之間的接觸面積，這反過來又大大增加了破骨細胞骨吸收的面積，因此破骨細胞在骨折愈合的過程中起著至關重要的作用。

清·陳士鐸《辨證錄·接骨門》認為，摔傷后有大量瘀血存在體內，不能消散，血液不流通則瘀血不易散去，瘀血不去則骨折就難以愈合［19］。故治療上應當運用攻利之法。人到老年，肝腎不足，筋骨衰弱，骨質疏松，瘀血證雖屬實證，但多數(shù)虛中夾實，治療上更應注意活血和養(yǎng)血相配合。桃紅四物湯可使營血調和，補血不停滯，活血而不離經，在骨代謝中具有與成骨-破骨細胞耦合的動態(tài)平衡相同的作用，有利于動態(tài)調節(jié)OPG-RANKL-RANK 傳導通路，有利于骨組織重建和恢復。TLRs 受體中包括TLR2，可通過在外周血白細胞的表面進行表達，也能激活NF-κB 和AP1 等轉錄因子，主要是因為它能與細菌和內源性配基發(fā)生相互作用，在4 號染色體4q32 區(qū)可以找到它的編碼基因［20］。前期驗證性實驗中，用桃紅四物湯處理實驗小鼠，發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯在骨折愈合過程中的不同階段可以抑制骨髓單核細胞中TLR2的表達。

本實驗將RAW264.7 細胞隨機分為對照組、桃紅四物湯組、TLR2 組及桃紅四物湯+TLR2 組，檢測各組的TRAP 染色、qPCR 及WB，發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯通過抑制TLR2 的表達，使破骨細胞的分化受到抑制，進而使骨吸收的速度得到延緩，最終加快骨折愈合的進程。本研究發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯促進骨折愈合的分子機制，為我們開發(fā)新的骨折愈合治療藥物和干預方案提供一個潛在的切入點，也將中醫(yī)的“活血化瘀”與“破骨細胞分化”理論結合起來，豐富了“活血化瘀”的現(xiàn)代內涵。