金 戔，陳耀武，李陽坤，葉賽卿，錢昕曄，朱皓宇，徐雯軒，包曉紅

（臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000）

0 引言

食管癌（Esophageal cancer）為常見的最具侵襲性的消化道惡性腫瘤之一，它有兩種組織學(xué)亞型，即食管鱗癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC）和食管腺癌（Esophageal Adenocarcinoma，EAC）。在全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告中，食管癌發(fā)生率排第六位，死亡率排第七位，且其5 年生存率低于20%［1-2］。中國(guó)的食管癌病例占全球的50%以上［3］。目前食管癌的主要臨床治療手段為手術(shù)切除、放化療，但常規(guī)治療的療效有限且發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)［4］。西妥昔單抗（靶向表皮生長(zhǎng)因子受體，EGFR）和貝伐珠單抗（靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，VEGF）為代表的靶向治療已被證實(shí)在食管癌的治療中發(fā)揮著重要作用［4］。然而，食管癌的異質(zhì)性，迫使研究者們尋求更多的潛在治療靶點(diǎn)。ESCC 因缺乏其有效靶點(diǎn)，靶向治療效果欠佳；微小RNA（microRNA，miRNA）是一種非編碼小RNA，它參與包括食管癌在內(nèi)的多種癌癥的各個(gè)階段［5］，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用顯著，有望成為腫瘤治療的有效靶點(diǎn)。已有研究報(bào)道，miR-431-5p 的異常表達(dá)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用［6］，但其在食管癌中的作用尚不明確。本文通過檢測(cè)miR-431-5p在食管癌中的異常表達(dá)，證實(shí)了miR-431-5p 參與ESCC 的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移過程，并探索了其作用機(jī)制，為食管鱗癌的分子靶向治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

人食管鱗癌細(xì)胞（ESCC）株TE-1 和TE-11 購自江陰齊氏生物科技有限公司；KYSE30、KYSE70 和KYSE450 購自南京科佰生物科技有限公司；ESCC 組織cDNA 芯片（癌/癌旁各15），上海芯超生物科技有限公司；miR-431-5p 模擬物和抑制劑，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；RPMI1640 培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone 公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，美國(guó)Gemini Bio；CCK-8 試劑，美國(guó)APExBio 公司；BCA 定量試劑盒，美國(guó)Thermo Scientific 公司；兔抗人p-ERK（1/2）單克隆抗體（#4370）和兔抗人ERK 抗體（#9102），美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；小鼠抗人β-actin 單克隆抗體（sc-69879），美國(guó)Santa Cruz 公司；HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（ab6789）多克隆抗體、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（ab6721）多克隆抗體，英國(guó)abcam 公司；ECL發(fā)光液，上海碧云天生物技公司；transwell 板、Matrigel 基質(zhì)膠，美國(guó)康寧公司；Thermo CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo 公司；BioTek Synergy H1 酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek 公司；GE Amersham Imager 600 超靈敏多功能成像儀，美國(guó)GE 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫分析miR-431-5p 表達(dá)

從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）下載并整理TCGA-ESCA（食管癌）項(xiàng)目BCGSC 流程的miRNA-seq 數(shù)據(jù)并提取RPM 格式的數(shù)據(jù)。利用R（4.2.1）軟件分析miR-431-5p 表達(dá)，采用ggplot2［3.3.6］包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

1.2.2 組織cDNA 芯片PCR 及細(xì)胞RT-qPCR

根據(jù)天根miRcute miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒的操作步驟進(jìn)行操作。配置20 μL qPCR MasterMix體系：2×miRcute Plus miRNA Premix 10 μL，正向引物終濃度200 nmol/L，反向引物（10 μmol/L）0.4 μL，ddH2O 補(bǔ)水至20 μL。將cDNA 芯片置于冰上靜置15 min，振蕩30 s，以3 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心3 min，上機(jī)實(shí)驗(yàn)。PCR 程序?yàn)椋阂浑A段95 ℃30 s；二階段95 ℃5 s，60 ℃30 s，循環(huán)40 次；三階段95 ℃5 s，60 ℃1 min。

細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)trizol 法提取其總RNA，測(cè)定RNA 濃度及純度，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。具體反應(yīng)如下：配置反應(yīng)液去除DNA（5×gDNA Wiper Mix 2 μL、Total RNA 500 ng、無酶水補(bǔ)足至10 μL，40 ℃反應(yīng)2 min）；在RNase-free 離心管中按說明書配置反應(yīng)液，反應(yīng)體系：上一步反應(yīng)液10 μL、5XPrimmeScript RT Master Mix 2 μL、step-loop primer 0.2 μL、無酶水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：25 ℃，5 min；50 ℃，15 min；85 ℃，5 min。PCR 反應(yīng)體系：cDNA 0.5 μL，mQ primer R 0.4 μL，2×SYBR PCR Master mix 5 μL，上、下游引物0.2 μL，無酶水3.9 μL。反應(yīng)條件：一階段95 ℃，5 min；二階段95 ℃，10 s、60 ℃，30 s 循環(huán)40 次；三階段95 ℃，15 s、60 ℃，1 min、95 ℃，15 s。利用2^-(ΔΔCt)法分析數(shù)據(jù)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將KYSE30、KYSE70、KYSE450、TE-1、TE-11 細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清和青-鏈霉素各100 units/mL 的RPMI1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞匯合度80%～90%時(shí)，胰酶消化，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種到24 孔板中，過夜培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。50 μL Opti-MEM 稀釋miR-431-5p模擬物和抑制劑（終濃度為50 nmol/L），混勻。再與50 μL Opti-MEM 稀釋的LipofectamineTM 2000 混合，室溫下靜置20 min。將100 μL 轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到未含血清的24 孔細(xì)胞板中，輕搖細(xì)胞板混合均勻，培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)染6 h 后換新鮮完全培養(yǎng)基。分組如下：①KYSE30+模擬物對(duì)照組（以下簡(jiǎn)稱KYSE30-MNC）；②KYSE30+模擬物組（以下簡(jiǎn)稱KYSE30-M）；③TE-11+抑制劑對(duì)照組（以下簡(jiǎn)稱TE-11-I）； ④TE-11+抑制劑組（以下簡(jiǎn)稱TE-11-I）。

1.2.5 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

接種于6 孔板的細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，轉(zhuǎn)染miR-431-5p 模擬物和抑制劑24 h。經(jīng)胰酶消化、離心重懸后，等體積接種于96 孔板。采用CCK-8 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24 h，48 h，72 h 時(shí)的細(xì)胞增殖情況。方法簡(jiǎn)述如下：10 μL CCK-8 加入每孔中，培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度值（A450nm），分析其數(shù)據(jù)。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

5×105個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板，培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染miR-431-5p 模擬物和抑制劑24 h 后，用移液器吸頭劃痕，以PBS 清洗細(xì)胞3 次，加入無血清培養(yǎng)基，0 h、48 h 時(shí)分別在顯微鏡下拍照紀(jì)錄。用Image J 計(jì)算劃痕面積。遷移率（%）=［（0 h 劃痕面積-48 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積］×100%。

1.2.7 Transwell 實(shí)驗(yàn)

將4 ℃融化的轉(zhuǎn)染基質(zhì)膠用OPTI-MEM 培養(yǎng)基稀釋（1∶20），加入Transwell 小室內(nèi)，37 ℃固化1～2 h；再將0.2 mL、含5×104個(gè)轉(zhuǎn)染48 h 的細(xì)胞的OPTI-MEM 培養(yǎng)液加入到Transwell 上室。Transwell 下室中加入0.6 mL 含有體積分?jǐn)?shù)為20% FBS的OPTI-MEM 培養(yǎng)基。將Transwell 小室細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱24 h，取出小室，固定、結(jié)晶紫染色、拍照。用Image J 計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞侵襲率。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.2.8 Western blot 實(shí)驗(yàn)

3×105個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板，培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)染miR-431-5p 模擬物和抑制劑48 h 后，提取其總蛋白，測(cè)其蛋白濃度。在質(zhì)量濃度為4%～10%的不連續(xù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠點(diǎn)樣孔內(nèi)加入等量蛋白樣品，再電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h 后，加入一抗（1∶1 000）稀釋液4 ℃孵育過夜。TBST 清洗3 次，每次10 min。再加二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次，每次10 min；最后用ECL 顯色液進(jìn)行顯色、拍照。使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

轉(zhuǎn)錄組公共數(shù)據(jù)庫采用R（4.2.1）語言，ggplot2［3.3.6］包用于數(shù)據(jù)可視化，GraphPad Prism 8.0 軟件用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可視化。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 miR-431-5p在食管癌中高表達(dá)

miR-431-5p 在食管癌中高表達(dá)情況如圖1 所示。非配對(duì)樣本（正常組∶食管癌組=13∶187）和配對(duì)樣本（正常組∶食管癌組=13∶13）中，腫瘤組中miR-431-5p 的表達(dá)量均高于正常組（圖1A 和圖1B），且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。根據(jù)受試者工作特征曲線（ROC 曲線，圖1C），ROC 曲線下與坐標(biāo)軸圍成的面積（AUC）值為0.870（CI：0.773～0.968），具有較好的診斷價(jià)值，說明miR-431-5p 的表達(dá)水平可能是ESCC 的潛在生物標(biāo)志物。為了驗(yàn)證miR-431-5p 在ESCC 中的表達(dá)，我們?cè)贓SCC 組織和細(xì)胞中檢測(cè)其表達(dá)情況。RT-qPCR 結(jié)果顯示：與癌旁組織相比較，miR-431-5p 相對(duì)表達(dá)量高于1 的組織有5/15（30%，圖1D），而在5 種ESCC 細(xì)胞系中表達(dá)量從高到低分別是TE-11、TE-1、KYSE450、KYSE70、KYSE30 細(xì)胞（圖1E）。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，分別挑選表達(dá)量最低的KYSE30 和表達(dá)量最高的TE-11 細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

圖1 miR-431-5p 在食管癌中的高表達(dá)

2.2 miR-431-5p促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖

采用RT-qPCR 方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染miR-431-5p 模擬物后的KYSE30 細(xì)胞和轉(zhuǎn)染抑制劑后的TE-11 細(xì)胞中miR-431-5p 的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2 所示。經(jīng)miR-431-5p 模擬物轉(zhuǎn)染，KYSE30 細(xì)胞miR-431-5p 相對(duì)表達(dá)量顯著增加（圖2A，P＜0.05），而經(jīng)miR-431-5p 抑制劑轉(zhuǎn)染，TE-11 細(xì)胞miR-431-5p 相對(duì)表達(dá)量顯著降低（圖2B，P＜0.001），說明miR-431-5p 模擬物和抑制劑有效。為了檢測(cè)miR-431-5p 對(duì)ESCC細(xì)胞增殖的影響，KYSE30 和TE-11 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-431-5p 模擬物和抑制劑，檢測(cè)其細(xì)胞增殖情況。轉(zhuǎn)染72 h 時(shí)，與KYSE30-MNC 比較，KYSE30-M 組細(xì)胞吸光度值增加了24.19%（圖2C）；與TE-11-INC 組比較，TE-11-I 組的細(xì)胞吸光度值降低了21.43%（圖2D），表明miR-431-5p 促進(jìn)ESCC 細(xì)胞增殖。

圖2 miR-431-5p 促進(jìn)ESCC 細(xì)胞增殖

2.3 miR-431-5p有利于ESCC細(xì)胞的遷移

miR-431-5p 模擬物和抑制劑分別轉(zhuǎn)染于KYSE30 和TE-11 細(xì)胞后，細(xì)胞遷移率變化如圖3 所示。KYSE30-MNC 組遷移率為15.93%，而KYSE30-M 組遷移率增加至46.79%（P＜0.001），TE-11-INC 組遷移率為27.37%，而TE-11-I 組遷移率降至17.85%（P＜0.05），這說明miR-431-5p 與ESCC 細(xì)胞遷移呈正相關(guān)，在其發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要的作用。

圖3 miR-431-5p 促進(jìn)ESCC 細(xì)胞遷移

2.4 miR-431-5p有助于ESCC細(xì)胞的侵襲

Transwell 實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)miR-431-5p 對(duì)ESCC 細(xì)胞侵襲的影響。KYSE30-MNC 組只有小部分侵襲過膜，而KYSE30-M 組侵襲過膜細(xì)胞明顯增加（如圖4 所示，P＜0.001），侵襲率增加了50.29%，這說明miR-431-5p 與ESCC 細(xì)胞侵襲呈正相關(guān)，在食管鱗癌發(fā)展過程中必不可少。

圖4 miR-431-5p 促進(jìn)ESCC 細(xì)胞侵襲

2.5 miR-431-5p通過MAPK/ERK通路促進(jìn)ESCC細(xì)胞侵襲

為了探索miR-431-5p 對(duì)ESCC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了p-ERK 蛋白表達(dá)（如圖5 所示）。

圖5 miR-431-5p 促進(jìn)MAPK/ERK 信號(hào)通路

與KYSE30-MNC 組比較，KYSE30-M 組p-ERK 表達(dá)量增加11.68%（P<0.01）；而與TE-11-INC 組比較，TE-11-I 組p-ERK 表達(dá)量減少45.73%（P<0.01）。以上實(shí)驗(yàn)表明：miR-431-5p 通過上調(diào)MAPK/ERK 信號(hào)通路，促進(jìn)了ESCC 細(xì)胞腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

3 討論

3.1 miR-431-5p可能是ESCC潛在診斷標(biāo)志物

miRNA 大小約為22 個(gè)核苷酸，其表達(dá)失調(diào)在腫瘤發(fā)展過程當(dāng)中發(fā)揮重要作用。隨著miRNA 研究的深入，許多潛在的癌癥生物標(biāo)志物被提出可用于診斷和預(yù)后，這為癌癥篩查提供了新的視角［7］。本文研究發(fā)現(xiàn)：miR-431-5p 在食管癌中高表達(dá)，具有較高的診斷價(jià)值，因此，它可作為潛在的診斷性生物標(biāo)志物；并且miR-431-5p 對(duì)ESCC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移具有明顯的促進(jìn)作用。

食管癌組織RNA 公共數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，食管癌中的miR-431-5p 表達(dá)顯著高于癌旁組織。為了驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們檢測(cè)了ESCC 組織cDNA 芯片上miR-431-5p 表達(dá)，結(jié)果顯示，1/3（5/15）組織高表達(dá)miR-431-5p。Xu 等［8］也通過RT-qPCR 的方法檢測(cè)子宮頸腺癌中miR-431-5p 表達(dá)，其結(jié)果也顯示了miR-431-5p 的高表達(dá)。然而，因樣本數(shù)量較少，我們未能獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。后續(xù)的研究擬擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步表達(dá)其驗(yàn)證，以便更準(zhǔn)確地分析miR-431-5p 表達(dá)量和評(píng)估其診斷價(jià)值。miR-431-5p 在ESCC 中的高表達(dá)是我們以miR-431-5p 作為靶點(diǎn)研究的重要依據(jù)。

3.2 miR-431-5p與ESCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)

為了驗(yàn)證miR-431-5p 的功能，我們首先選擇miR-431-5p 表達(dá)量最高的TE-11 細(xì)胞和表達(dá)量最低的KYSE30 細(xì)胞，再通過功能缺失和獲得進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)miR-431-5p 能促進(jìn)ESCC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。miR-431-5p 在宮頸腺癌中的研究結(jié)果也顯示miR-431-5p 促進(jìn)宮頸鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)。然而，miR-431-5p 在結(jié)直腸癌中的研究發(fā)現(xiàn)：miR-431-5p 的上調(diào)抑制了SW620 和HCT116 細(xì)胞的增殖和侵襲［9］；miR-431-5p在骨肉瘤組織中的過表達(dá)抑制了U2OS 和HOS 細(xì)胞的侵襲和遷移［10］；舌鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-431-5p受到競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA circ_0001742 的調(diào)控而表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致ATF3癌基因的高表達(dá)，在舌鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌作用［11］。

以上研究結(jié)果與我們的研究結(jié)果不一致，分析其原因，可能與miR-431-5p 的靶基因有關(guān)。根據(jù)ENCORI（The Encyclopedia of RNA Interactomes，http://starbase.sysu.edu.cn/tutorialAPI.php）數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)的miR-431-5p 的靶基因結(jié)果，LIMCH1（LIM and calponin-homology domains 1）可能為潛在作用靶點(diǎn)（數(shù)據(jù)未顯示）。LIMCH1 蛋白是一種細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，屬于LIM 蛋白家族。LIMCH1 為負(fù)調(diào)控因子，可能通過調(diào)控HUWE1 和p53 參與肺癌的發(fā)生發(fā)展［12］。另外一項(xiàng)基于免疫組化和生物信息學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，LIMCH1的表達(dá)缺失可預(yù)測(cè)肺鱗癌手術(shù)切除患者的不良預(yù)后［13］。miR-431-5p 在ESCC 中的表達(dá)上調(diào)，可能通過抑制LIMCH1 實(shí)現(xiàn)，從而促進(jìn)ESCC 的增殖、侵襲和遷移。因此，須進(jìn)行深入的研究加以驗(yàn)證。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）是指非運(yùn)動(dòng)性上皮細(xì)胞向具有侵襲能力的間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變，是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要的生物學(xué)過程［14］。深入分析miR-431-5p 促進(jìn)ESCC 轉(zhuǎn)移EMT分子機(jī)制尤為重要。MAPK/ERK 信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，包括食管鱗癌的EMT 過程［15-16］。ERK 是MAPK 信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是將信號(hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵［17］。ERK 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞運(yùn)輸、細(xì)胞黏附和代謝，而在癌細(xì)胞中，ERK 的磷酸化蛋白（p-ERK）的高表達(dá)常常與增殖、侵襲和耐藥性有關(guān)［18］。因此，ESCC 細(xì)胞經(jīng)miR-431-5p 模擬物/抑制劑轉(zhuǎn)染后，檢測(cè)其p-ERK 表達(dá)量。miR-431-5p 正向調(diào)節(jié)p-ERK 是我們的新發(fā)現(xiàn)。在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中，miR-431-5p 可能是一個(gè)重要的正向調(diào)節(jié)分子，通過調(diào)控MAPK/ERK 信號(hào)通路，使ESCC 細(xì)胞觸發(fā)EMT 進(jìn)程，從而參與ESCC 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等過程。此外，miR-431-5p 還可能通過ROCK1/PI3K/AKT 通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［19］。上皮表面標(biāo)志物（最顯著的是E-鈣黏蛋白）的缺失和間質(zhì)標(biāo)志物（包括波形蛋白和N-鈣黏蛋白）的獲得是EMT 發(fā)生的標(biāo)志［14］。miR-431-5p 模擬物/抑制劑處理后，檢測(cè)以上EMT 標(biāo)志物，詳細(xì)探究miR-431-5p 通過MAPK/ERK 通路促進(jìn)EMT 的作用機(jī)制也是我們今后研究的方向。

4 結(jié)語

miR-431-5p 在ESCC 中表達(dá)上調(diào)，而且miR-431-5p 通過MAPK/ERK 信號(hào)通路正向調(diào)控ESCC 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。深入探索miR-431-5p 的作用靶點(diǎn)以及分子機(jī)制，將為以miRNAs 為靶點(diǎn)的食管鱗癌診斷和治療提供更有效的參考依據(jù)。