賴申枝,謝俊英

(湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與生物工程學(xué)院,湖南 株洲 412000)

二氫吡啶類鈣離子通道抑制劑是一類降壓作用好、臨床使用效果好、上市品種豐富的心腦血管性疾病的治療藥[1]。硝苯地平是第一代二氫吡啶類鈣離子拮抗劑[2],能干擾心血管平滑肌的興奮收縮從而起到擴(kuò)張血管作用,對不同類型的高血壓均表現(xiàn)出較好的療效,在高血壓、心絞痛、心律失常的治療方面得到大眾認(rèn)可[3]。近年來,某些不法商販通過在保健品或食品中添加硝苯地平等違禁藥物以達(dá)到降血壓的效果,從而引發(fā)系列不良反應(yīng)并耽誤疾病的治療。

目前對硝苯地平的分離檢測方法主要有薄層色譜法[4]、高效液相色譜法[5-6]、紫外可見分光光度法[7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]和毛細(xì)管電泳法[9]等。分子印跡技術(shù)[10]是以目標(biāo)分子作為模板,制備與目標(biāo)分子在三維結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)、電荷等方面匹配性高的聚合物,因此制備的聚合物具有對目標(biāo)分子的特異性識別和選擇性吸附能力,且其性能穩(wěn)定,重復(fù)使用性能較好[11],在復(fù)雜樣品分離檢測方面被廣泛應(yīng)用。分子擁擠試劑可以促進(jìn)分子印跡反應(yīng)過程形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu),提高模板分子與功能單體之間的相互作用[12]?；诒砻娣肿佑≯E技術(shù)[13]所制得的分子印跡聚合材料其識別位點(diǎn)存在于材料表面,能有效克服傳統(tǒng)印跡法中模板分子包埋過深或過緊導(dǎo)致印跡效率不高的缺點(diǎn),適用于復(fù)雜樣品中特定成分的快速吸附分離[14]。

以硝苯地平為模板,基于表面分子印跡技術(shù)和分子擁擠技術(shù),制備了一種硝苯地平表面分子印跡材料。以掃描電鏡、透射電鏡對材料進(jìn)行形貌表征,并通過傅里葉變換紅外光譜法等驗(yàn)證表面分子印跡層的成功涂覆。對聚合物的飽和吸附量、吸附動力學(xué)、吸附選擇性和重復(fù)使用性能進(jìn)行了考察。制備的表面印跡材料具有對競爭底物較好的選擇性,在復(fù)雜樣品組分的分離檢測中有一定的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 儀器與試劑

Nicolet6700型紅外光譜儀(日本Shimadzu公司);JSM-6610LV型掃描電子顯微鏡(日本JEOL公司);Lambda 25型紫外-可見分光光度計(jì)(日本Hitachi公司);JEM-2100F型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司);SHA-C型恒溫震蕩儀(江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司)。

硝苯地平、苯磺酸氨氯地平、尼群地平、鹽酸普萘洛爾、硅酸四乙酯(TEOS)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、聚苯乙烯購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司,偶氮二異丁腈(AIBN)、甲基丙烯酸(MAA)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)購于安耐吉化學(xué),其他試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 分子印跡聚合物制備

1.2.1 介孔二氧化硅微球的制備

向500 mL三口瓶中加入0.5 g CTAB,再加入50 mL無水乙醇與150 mL去離子水,攪拌下使其溶解,然后向上述混合液中添加8.0 mL氨水。反應(yīng)條件為40 ℃恒溫水浴且維持勻速機(jī)械攪拌,30 min后用恒壓滴液漏斗緩慢滴加5.0 mL的TEOS,維持反應(yīng)條件8 h以確保反應(yīng)完全。然后將反應(yīng)產(chǎn)物抽濾,用水/乙醇、乙醇分別各洗滌三次,產(chǎn)物抽濾后于真空干燥箱中50 ℃干燥24 h,即得介孔二氧化硅微球(mSiO2)。

1.2.2 表面分子印跡材料的制備

基于表面分子印跡技術(shù),以介孔二氧化硅材料為載體,加入分子擁擠試劑,制備性能改進(jìn)的表面分子印跡材料。將1 mmol硝苯地平溶于80 mL乙醇/氯仿(體積比1∶1)中并轉(zhuǎn)入圓底燒瓶中,加入4 mmol 單體MAA,隨后加入20 mg/mL的聚苯乙烯四氫呋喃溶液20 mL。往密閉的體系中通入氮?dú)?0 min,持續(xù)攪拌下,混合液于室溫過夜,形成模板-單體-分子擁擠物的預(yù)聚物。將1.0 g 1.2.1制備的mSiO2材料加入到上述預(yù)聚液中,加入10 mmol交聯(lián)劑EGDMA,在攪拌下通氮?dú)?0 min除氧。隨后加入引發(fā)劑AIBN適量,并在持續(xù)攪拌下于60 ℃反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)產(chǎn)物抽濾,用甲醇/乙酸(體積比9∶1)洗脫液洗滌多次,用紫外-可見分光光度計(jì)檢測洗脫液,直到檢測不出硝苯地平。并用甲醇清洗去除殘余的乙酸,抽濾。將沉淀于真空干燥箱中50 ℃干燥24 h,即得到表面分子印跡微球(MIP@mSiO2)。

制備非印跡微球(NIP@mSiO2)方法同表面分子印跡微球,制備過程中不加入模板分子硝苯地平。

1.3 表面分子印跡材料的吸附性能測試

1.3.1 靜態(tài)吸附能力測定

用二氯甲烷配制含硝苯地平質(zhì)量濃度為5,10,25,50,75,100,125,150 mg/L的系列待吸附液,稱取20 mg表面分子印跡材料多份,分別加入到多個100 mL具塞錐形瓶,量取系列濃度的待吸附溶液40 mL分別加入各錐形瓶中,充分搖勻后置于恒溫水浴振蕩器中于25 ℃吸附60 min后抽濾。上清液經(jīng)0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜過濾,通過紫外-可見分光光度計(jì)測定(235 nm)硝苯地平的濃度。表面分子印跡材料的靜態(tài)吸附量Q以吸附前后吸附液中硝苯地平濃度變化計(jì)算,見公式(1):

(1)

式中,Q為靜態(tài)吸附量(mg/g),V為吸附測試液體積(L),C0為吸附前母液中硝苯地平的濃度(mg/L),Cx為吸附后吸附測試液中硝苯地平的濃度(mg/L),m為表面分子印跡材料的用量(g)。

根據(jù)印跡材料與非印跡材料靜態(tài)吸附量的比值計(jì)算印跡因子IF,見公式(2):

(2)

1.3.2 吸附動力學(xué)實(shí)驗(yàn)

稱取30 mg表面分子印跡材料10份,分別加入含硝苯地平質(zhì)量濃度為75 mg/L的二氯甲烷溶液30 mL,充分振搖,置于恒溫水浴振蕩器中于25 ℃進(jìn)行吸附,于不同的吸附時間(1,3,5,10,15,20,30,45,60,90 min)對上清液進(jìn)行取樣,按照1.3.1方法測定上清液中硝苯地平的濃度,根據(jù)上清液中硝苯地平濃度變化計(jì)算材料的吸附量隨時間的變化情況。

1.3.3 選擇性吸附實(shí)驗(yàn)

依照靜態(tài)吸附法,測定MIP@mSiO2和NIP@mSiO2對硝苯地平及其結(jié)構(gòu)類似物尼群地平、苯磺酸氨氯地平和競爭底物鹽酸普萘洛爾的吸附量。分別配制質(zhì)量濃度均為100 mg/L的硝苯地平、尼群地平、苯磺酸氨氯地平、鹽酸普萘洛爾二氯甲烷/甲醇溶液(體積比1∶1),取40 mL置于100 mL具塞錐形瓶中,各自加入20 mg MIP@mSiO2或NIP@mSiO2,充分混勻后于恒溫水浴振蕩器(25 ℃)吸附60 min后抽濾。上清液經(jīng)0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜過濾,通過紫外-可見分光光度計(jì)測定硝苯地平(237 nm)、尼群地平(237 nm)、苯磺酸氨氯地平(237 nm)、鹽酸普萘洛爾(292 nm)的濃度,并計(jì)算吸附量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 制備優(yōu)化

2.1.1 功能單體用量對印跡效果的影響

功能單體主要通過氫鍵與目標(biāo)物進(jìn)行非共價結(jié)合,不同MAA用量對制備的印跡及非印跡材料吸附性能的影響見圖1。MIP@mSiO2和NIP@mSiO2對硝苯地平的吸附量均隨著功能單體用量增加呈現(xiàn)先增大后減小趨勢。當(dāng)模板分子/功能單體物質(zhì)的量比例為1∶2時,MIP@mSiO2對硝苯地平的吸附量最大,但是印跡因子較小,可能是由于單體用量較少時,不能很好地在二氧化硅載體上形成與硝苯地平完全匹配的空間結(jié)構(gòu),難以實(shí)現(xiàn)對硝苯地平的特異性結(jié)合。而當(dāng)模板分子/功能單體物質(zhì)的量比為1∶4時,雖然MIP@mSiO2對硝苯地平的吸附量稍有下降,但是印跡因子達(dá)到最佳,為1.27。當(dāng)功能單體用量繼續(xù)增加時,吸附量和印跡因子均出現(xiàn)下降。綜合考慮吸附量和特異性結(jié)合能力,選擇模板與功能單體的物質(zhì)的量比為1∶4進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化研究。

圖1 功能單體用量的影響

2.1.2 分子擁擠試劑分子量對印跡效果的影響

通過加入聚苯乙烯作為分子擁擠試劑,考察分子擁擠試劑分子量對分子印跡效果的影響。在表面印跡反應(yīng)中加入分子量分別為35 000,192 000,350 000和400 000的擁擠試劑,制備的印跡聚合物吸附情況見圖2。由圖可見,分子擁擠試劑的加入對印跡因子的影響較為明顯,與不加擁擠試劑組相比,制備的印跡聚合物吸附能力稍有下降,但印跡因子得到提升。隨著擁擠試劑分子量的增大,印跡聚合物的吸附能力降低,印跡因子增大。這是因?yàn)榉肿訐頂D環(huán)境能改變分子印跡聚合反應(yīng)過程中模板分子和功能單體作用平衡,有利于聚合反應(yīng)形成結(jié)構(gòu)更加匹配的印跡孔穴。分子量為350 000時,吸附能力較大,印跡因子比400 000時稍低,考慮到擁擠試劑成本問題,選定分子量為350 000的分子擁擠試劑并進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

圖2 擁擠試劑分子量的影響

2.2 材料表征

2.2.1 形貌表征

如圖3所示,通過掃描電鏡和透射電鏡對表面分子印跡材料表面形貌進(jìn)行觀察。從mSiO2(圖3a)及MIP@mSiO2(圖3b)、NIP@mSiO2(圖3C)的掃描電鏡圖可以看出,三種材料均呈現(xiàn)出規(guī)則的球形顆粒狀且分散性較好,載體介孔二氧化硅微球的表面較規(guī)整、光滑,粒徑在550～650 nm之間;表面分子印跡微球粒徑在700～800 nm之間;非印跡微球的粒徑稍大,在800～900 nm之間。從MIP@mSiO2的透射電鏡圖(圖3d)看,微球邊緣有一圈半透明的表面印跡層,厚度約為50 nm。通過表面印跡聚合反應(yīng)在mSiO2上涂覆了一層印跡聚合物,并且印跡反應(yīng)后表面粗糙度稍有增加,表明表面分子印跡聚合成功進(jìn)行。

a—mSiO2的SEM圖;b—MIP@mSiO2的SEM圖; c—NIP@mSiO2的SEM圖;d—MIP@mSiO2的TEM圖。圖3 材料的掃描電鏡和透射電鏡表征

2.2.2 紅外光譜表征

采用傅里葉變換紅外光譜儀對介孔二氧化硅微球和分子印跡材料表面官能團(tuán)進(jìn)行分析,見圖4。在mSiO2的紅外光譜(圖4a)中,1 069,959和794 cm-1處的峰分別歸屬于Si-O-Si,Si-OH以及SiO-C鍵的拉伸振動,3 425 cm-1處的寬峰歸屬于硅酸酯的-OH吸收。由圖4b和4c可見,MIP@mSiO2和NIP@mSiO2的紅外光譜非常相似,3 438 cm-1和1 735 cm-1處出現(xiàn)了強(qiáng)烈的吸收峰,這是來自于羧基O-H的伸縮振動和聚甲基丙烯酸酯C=O的伸縮振動,在2 985 cm-1和2 952 cm-1處吸收峰歸因于-CH3和-CH2-的不對稱伸縮振動。傅立葉紅外光譜表明,表面印跡層已成功涂覆于二氧化硅微球載體上。

a—mSiO2;b—MIP@mSiO2;c—NIP@mSiO2。圖4 材料的紅外光譜

2.3 吸附性能

2.3.1 飽和吸附性能考察

考察了MIP@mSiO2和NIP@mSiO2材料在系列質(zhì)量濃度(5～150 mg/L)的待吸附液中的靜態(tài)吸附性能,見圖5。在質(zhì)量濃度為5～75 mg/L時,MIP@mSiO2和NIP@mSiO2材料對硝苯地平的吸附量都隨著待吸附母液中硝苯地平濃度的增大而增大。當(dāng)質(zhì)量濃度為100 mg/L時,兩種材料的吸附量逐漸趨于平衡,分別為153.1 mg/g和107.2 mg/g。這是因?yàn)橛≯E材料表面存在與目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)匹配的印跡孔穴,而非印跡材料沒有,導(dǎo)致印跡材料的吸附能力比非印跡材料大。

圖5 飽和吸附性能曲線

2.3.2 吸附動力學(xué)

按1.3.2考察MIP@mSiO2和NIP@mSiO2在不同的吸附時間取樣時計(jì)算的吸附能力。以吸附取樣時間作為橫坐標(biāo),吸附量作為縱坐標(biāo),得到表面印跡微球的吸附動力學(xué)曲線,見圖6。由圖可知,MIP@mSiO2對硝苯地平在20 min內(nèi)已趨于飽和吸附,30 min時達(dá)到飽和吸附,吸附量約為149.6 mg/g;NIP@mSiO2對硝苯地平吸附在45 min內(nèi)達(dá)到飽和吸附,飽和吸附量約為103.4 mg/g。這是由于表面分子印跡材料表面存在大量的印跡孔穴,對硝苯地平分子具有較快的傳質(zhì)速率,具有較快速的吸附動力學(xué);而隨著表面印跡孔穴逐漸被硝苯地平分子占據(jù),吸附趨于飽和。非印跡材料對目標(biāo)物的吸附僅僅依靠表面的非共價作用,吸附速率相對較慢。

圖6 吸附動力學(xué)曲線

2.3.3 選擇性吸附

選擇與硝苯地平結(jié)構(gòu)相似的尼群地平、苯磺酸氨氯地平和結(jié)構(gòu)不同的鹽酸普萘洛爾,用于評估MIP@mSiO2和NIP@mSiO2的吸附選擇性。由圖7可知,MIP@mSiO2對模板硝苯地平的吸附量最高,而對尼群地平、苯磺酸氨氯地平和鹽酸普萘洛爾的吸附量較低,特別是對結(jié)構(gòu)不同的鹽酸普萘洛爾的吸附量最低;而NIP@mSiO2對四種底物的吸附量均較低。這是因?yàn)榉肿佑≯E材料表面的印跡孔穴在結(jié)合位點(diǎn)的官能團(tuán)和三維立體結(jié)構(gòu)與模板分子硝苯地平匹配性高,吸附選擇性更好。

圖7 材料的選擇性吸附

2.3.4 循環(huán)使用性能

為探究MIP@mSiO2使用的可重用性和穩(wěn)定性,將吸附后的MIP@mSiO2用甲醇/乙酸(體積比9∶1)溶液洗脫多次,除去模板,再用甲醇洗滌兩次,在50 ℃下干燥至恒重,進(jìn)行下一周期的靜態(tài)吸附測試。如此循環(huán)多次并計(jì)算每次的吸附量。圖8顯示經(jīng)過3次吸附-脫附循環(huán)后,MIP@mSiO2對硝苯地平的靜態(tài)吸附能力保持94%以上,且5個吸附周期后,表面印跡材料的靜態(tài)吸附能力只有略微的損失。這表明制備的表面分子印跡材料穩(wěn)定性較好,具有一定可循環(huán)使用價值。

圖8 材料的循環(huán)使用性能

3 結(jié)論

(1)采用表面印跡技術(shù)和分子擁擠技術(shù),以硝苯地平為模板分子,制備了表面分子印跡聚合微球材料。

(2)表面分子印跡微球的粒徑在700～800 nm之間,印跡層厚度約為50 nm。

(3)分子擁擠試劑的加入對印跡因子的影響較為明顯,與不加擁擠試劑組相比,制備的印跡聚合物吸附能力稍有下降,但印跡因子得到提升。

(4)表面分子印跡聚合材料具有較大的飽和吸附量(153.1 mg/g)和快速的吸附動力學(xué)(30 min),材料對結(jié)構(gòu)相似的競爭物具有較好的選擇性,3次吸附-脫附循環(huán)使用吸附性能仍保持94%以上。