任騰騰,于瀟飛,李云*,劉業(yè)志,張同妍,郭中原

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355;2.山東省立第三醫(yī)院 藥學(xué)部,山東 濟(jì)南 250031;3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所,北京 100700;4.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,河南 鄭州 450000)

當(dāng)前,隨著社會(huì)的發(fā)展,人民生活水平逐漸提高,痛風(fēng)和高尿酸血癥已成為臨床常見(jiàn)病,高尿酸血癥臨床表現(xiàn)為血清尿酸(UA)含量升高(男性UA ≥ 420 μmol/L,女性UA ≥ 360 μmol/L)。當(dāng)血清 UA 水平高于正常閾值時(shí),尿酸單鈉(MSU)晶體沉積在關(guān)節(jié)上,引起關(guān)節(jié)損傷和炎癥反應(yīng),最終使人患上痛風(fēng)[1-2]。近年來(lái),痛風(fēng)和高尿酸血癥的發(fā)病率和患病率逐年增加[3]。全球痛風(fēng)患病率在 0.1% 到 10% 之間[4];2016 年統(tǒng)計(jì)顯示中國(guó)痛風(fēng)發(fā)病率為 5.61%,并呈逐年上升趨勢(shì)[5]。具有易診難治,復(fù)發(fā)率較高的特點(diǎn),嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量。因此,降低血清UA含量是預(yù)防和治療痛風(fēng)、高尿酸血癥的主要措施[6]。目前,臨床上對(duì)于痛風(fēng)和高尿酸血癥主要有物理治療、藥物治療以及手術(shù)治療等,但因發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,均無(wú)法根治。臨床上常用的藥物如別嘌醇、苯溴馬隆等均存在不同程度的不良反應(yīng)[7-9]。因此,尋找和開(kāi)發(fā)活性?xún)?yōu)良的降低血清UA藥物迫在眉睫。近年來(lái)科學(xué)研究已經(jīng)證實(shí),高良姜中的黃酮類(lèi)成分能顯著降低高尿酸血癥小鼠的血清UA水平[10-11]。高良姜我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材,具有溫胃止嘔,散寒止痛的功效。黃酮類(lèi)、揮發(fā)油和二苯基庚烷等是其主要化學(xué)成分[12-13]。藥理研究發(fā)現(xiàn),高良姜具有抗氧化、抗胃潰瘍、抗炎等作用[14-15]。在民間,高良姜被廣泛用作食材、湯料、調(diào)味品以及香料等,對(duì)其進(jìn)行降尿酸產(chǎn)品開(kāi)發(fā)可帶來(lái)較好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。然而,高良姜治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的機(jī)制尚不清楚,尤其是其有效化學(xué)成分的分子靶點(diǎn)機(jī)制,因此,有必要對(duì)高良姜治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的具體靶點(diǎn)和通路等進(jìn)一步探索。

本研究首先運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),建立了“成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,再通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互作用和靶點(diǎn)富集分析,最后篩選出活性成分,分析高良姜治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的分子機(jī)制,并利用分子對(duì)接驗(yàn)證活性成分與蛋白的親和力,為高良姜治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的作用機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 高良姜化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)的收集

藥物化學(xué)成分及靶標(biāo)數(shù)據(jù)來(lái)源于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[16],以“高良姜”為關(guān)鍵詞檢索化學(xué)成分,對(duì)高良姜的有效成分進(jìn)行篩選,其中設(shè)定口服生物利用度(OB)≥ 30%,類(lèi)藥性(DL)≥ 0.18。從TCMSP中獲取相篩選成分的靶點(diǎn),并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)名稱(chēng)規(guī)范。基于Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)[17]獲得上述化合物的SDF結(jié)構(gòu)。

1.2 高尿酸血癥和痛風(fēng)疾病作用靶點(diǎn)的收集

以“hyperuricemia”、“gout”為關(guān)鍵詞使用OMIM數(shù)據(jù)庫(kù),Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù),Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,得到高尿酸血癥和痛風(fēng)疾病作用靶點(diǎn)。

1.3 高良姜-高尿酸血癥和痛風(fēng)共同靶點(diǎn)的篩選

運(yùn)用Venny2.1在線作圖工具,導(dǎo)入高良姜篩選成分作用靶點(diǎn)、痛風(fēng)及高尿酸血癥相關(guān)靶點(diǎn),繪制韋恩圖,兩者取交集后獲得高良姜藥物-痛風(fēng)及高尿酸血癥共同靶點(diǎn),即為高良姜治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件將“高良姜-化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)-高尿酸血癥和痛風(fēng)疾病”網(wǎng)絡(luò)圖可視化,通過(guò)Network Analyzer對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行藥物、成分、靶標(biāo)、通路之間的拓?fù)溆?jì)算分析,Degree值代表了化學(xué)成分與作用靶點(diǎn)之間的相關(guān)個(gè)數(shù),而Degree數(shù)值由大到小表代表化學(xué)成分關(guān)鍵程度由大到小,從而獲得核心成分。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析

將高良姜與疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),確定蛋白種類(lèi)為“Homo sapiens”,設(shè)置最低相互作用閾值參數(shù)0.4,再獲取PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)后,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件,繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖,其中,Degree值的高低根據(jù)節(jié)點(diǎn)的大小、顏色及其深淺變化不同表示?；谕?fù)浞治龊Y選核心靶點(diǎn),將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap 3.7.2中,使用NetworkAnalyzer工具進(jìn)行拓?fù)浣馕?以degree,betweenness centrality,average shortest path length 和closeness centrality四種參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn),選擇degree分值超過(guò)平均分的基因?yàn)楹诵陌悬c(diǎn),使用R 3.6.1工具繪制靶點(diǎn)條形圖。

1.6 GO和KEGG富集分析及可視化

為了說(shuō)明中藥化合物對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)在基因功能和通路中的作用,運(yùn)用R軟件Bioconductor生物信息軟件進(jìn)行關(guān)鍵靶基因的GO和KEGG富集分析(P<0.05,Q<0.05),輸出可視化條形圖及氣泡圖。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

LibDock 是 Discovery Studio 中的一種對(duì)接方法[8]。 通過(guò)這種計(jì)算機(jī)輔助虛擬活性篩選的方法,可以在不進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的情況下的篩選出小分子的活性,經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展,該方法準(zhǔn)確性高,操作簡(jiǎn)便,可進(jìn)行小分子高通量活性篩選,是目前藥物研究領(lǐng)域較為重要的一種技術(shù)。在 PPI 網(wǎng)絡(luò)的核心靶標(biāo)中,選擇前 5 個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行分子對(duì)接虛擬活性驗(yàn)證。在Discovery Studio 19.0(Chuang Teng Technology Co.,Ltd.,Beijing,China)中,使用Libdock算法評(píng)估化合物與痛風(fēng)和高尿酸血癥靶點(diǎn)之間的潛在分子結(jié)合模式。結(jié)合位點(diǎn)分別基于共結(jié)晶配體與 5 個(gè)靶標(biāo)的結(jié)合來(lái)定義。在對(duì)接篩選實(shí)驗(yàn)之前,去除靶標(biāo)蛋白共結(jié)晶配體,并使用相同的參數(shù)將制備的配體與蛋白質(zhì)對(duì)接。根據(jù)對(duì)接結(jié)果,選擇具有最低對(duì)接能量的最佳得分對(duì)接模型代表化合物的最佳配體結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)于每個(gè)配體,計(jì)算相互作用能量以定義配體和受體之間的相互作用,并分析預(yù)測(cè)的結(jié)合相互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)高良姜的化學(xué)成分的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)定OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18,對(duì)高良姜的有效成分進(jìn)行篩選,共得到潛在活性成分13個(gè)(表1),TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出180個(gè)活性成分作用靶點(diǎn)。

表1 高良姜的潛在活性成分

表1(續(xù))

表1(續(xù))

2.2 疾病作用靶點(diǎn)篩選

以“hyperuricemia”、“gout”為關(guān)鍵詞,分別在OMIM、Disgenet、Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,去重后分別獲得1 101個(gè)痛風(fēng)作用靶點(diǎn),802個(gè)靶點(diǎn)高尿酸血癥作用靶點(diǎn),二者取交集后獲得319個(gè)兩疾病的共同靶點(diǎn)(如圖1)。

圖1 高尿酸血癥和痛風(fēng)共同靶點(diǎn)

2.3 高良姜藥物-痛風(fēng)及高尿酸血癥疾病共同靶點(diǎn)的篩選

采用Venny2.1在線作圖工具,導(dǎo)入180個(gè)高良姜藥物靶點(diǎn)、1 101個(gè)痛風(fēng)作用靶點(diǎn),802個(gè)高尿酸血癥作用靶點(diǎn),繪制韋恩圖,三者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)28個(gè)(如圖2)。

圖2 高良姜與痛風(fēng)、高尿酸血癥靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

采用Cytoscape軟件導(dǎo)入高良姜中13個(gè)潛在活性成分和28個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn),繪制“高良姜-化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)-高尿酸血癥和痛風(fēng)疾病”網(wǎng)絡(luò)圖(如圖3)。高良姜中的11種活性成分(刪除其中2個(gè)與疾病靶點(diǎn)無(wú)交集的成分)根據(jù)degree降序排列分別為 quercetin,kaempferol,isorhamnetin,galangin,beta-sitosterol,1,7-diphenyl-5-hydroxy-3-heptanone,7-Methoxy-8-(2'-ethoxy-3'-hydroxy-3'-methybutyl)coumarin,medicarpin,(2S,3R)-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5,7-dimethoxychroman-3-ol,5-methoxy-1,7-diphenyl-3-heptanone,butyl-2-ethylhexyl phthalate。

注: 圖中紫色代表高良姜,綠色三角形代表高良姜中的11種活性成分,藍(lán)色橢圓形代表28個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn),紅色菱形代表疾病。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析

2.5.1 構(gòu)建蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)圖

為了更直觀地表征高良姜治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的作用機(jī)制,采用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)分析高良姜與兩疾病的28個(gè)交集靶點(diǎn)基因的交互作用,按“1.5”P(pán)PI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2軟件中,制作PPI網(wǎng)絡(luò)(如圖4)。經(jīng)軟件計(jì)算可知,網(wǎng)絡(luò)中共含有28個(gè)節(jié)點(diǎn),210條邊,平均節(jié)點(diǎn)數(shù)15。

圖4 高良姜與痛風(fēng)及高尿酸血癥交集基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5.2 基于拓?fù)浞治龅暮诵陌悬c(diǎn)篩選

將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap 3.7.2中,通過(guò)“1.5”中基于拓?fù)浞治龅暮诵陌悬c(diǎn)篩選的方法以NetworkAnalyzer工具實(shí)現(xiàn)拓?fù)浞治?采用R 3.6.1制作前 30 位靶點(diǎn)的條形圖(如圖5)?；?PPI 拓?fù)浞治雠琶?位的核心靶標(biāo)在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中較為關(guān)鍵,包括 CCL2、CXCL8、IL1B、VEGFA、ICAM1。

2.6 KEGG 和GO富集分析

2.6.1 GO富集分析

將28個(gè)共同靶點(diǎn)經(jīng)R語(yǔ)言運(yùn)行后得到GO 條目1 256條,結(jié)果顯示,交集基因集合共富集至1205條生物學(xué)過(guò)程(Biological process,BP)通路;交集基因集合共富集至10條細(xì)胞組分表達(dá)(Cellular component,CC)過(guò)程;交集基因集合共富集至41個(gè)與分子功能(Molecular function,MF)相關(guān)的過(guò)程。從 BP 的富集結(jié)果來(lái)講,高良姜治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的靶標(biāo)主要參與調(diào)節(jié)對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)生物刺激的反應(yīng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)腫瘤壞死因子的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、衰老、白細(xì)胞細(xì)胞-細(xì)胞黏附、細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)等(圖6(a))。從 CC 的富集結(jié)果來(lái)說(shuō),靶標(biāo)主要涉及質(zhì)膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、膜區(qū)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、質(zhì)膜外側(cè)、血小板α顆粒腔等(圖6(b))。從 MF 的富集結(jié)果來(lái)講,靶標(biāo)主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、蛋白磷酸酶2A結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、BH結(jié)構(gòu)域結(jié)合、死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合等(圖6(c))。

圖5 排名前30的核心靶點(diǎn)

圖6 高良姜治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的GO富集分析條形圖

2.6.2 KEGG富集分析

高良姜治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的28個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入R語(yǔ)言分析后得到118條KEGG通路,前20位KEGG通路條形圖(如圖7),其中P-value代表富集顯著性,所有通路都是有意義(P-value<0.05)且顏色越紅則說(shuō)明顯著性越高。主要信號(hào)通路涉及:糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE、液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、TNF、IL-17、NF-κB、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、Nod樣受體、Toll樣受體等信號(hào)通路,這提示高良姜可能是通過(guò)調(diào)控多個(gè)通路發(fā)揮治療痛風(fēng)及高尿酸血癥作用。

圖7 高良姜治療痛風(fēng)、高尿酸血癥的KEGG富集分析

2.7 分子對(duì)接結(jié)果

LibDock 是 Discovery Studio 中的一個(gè)對(duì)接應(yīng)用程序,將具有不同結(jié)合親和力的配體分子對(duì)接以生成熱圖,以指示配體與其結(jié)合位點(diǎn)之間的相互作用,并優(yōu)化獲得的能量 (Ayoub et al.,2018)。最后,保留得分較高的對(duì)接構(gòu)象。使用這種篩選方法,可以縮小PPIs的范圍,并且可以進(jìn)一步篩選潛在的生物活性配體。從PBD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/pdb/)中檢索到 前5 個(gè)靶標(biāo)的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID分別為CCL2:4zk9,CXCL8:6n2u,IL1B:6y8m,VEGFA:1vpf,ICAM1:1iam),去除蛋白質(zhì)中的水分子并純化蛋白質(zhì)。從 PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù) (https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得前5 個(gè)化合物高良姜素(galangin)、異鼠李素(isorhamnetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)的3D分子結(jié)構(gòu)。采用治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的藥物別嘌醇(allopurinol)作陽(yáng)性對(duì)照配體。

結(jié)果發(fā)現(xiàn),高良姜素、異鼠李素、β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素分別與CCL2、CXCL8、IL1B、VEGFA有較好的結(jié)合,LibDock對(duì)接得分均高于陽(yáng)性藥別嘌醇,而與ICAM1未結(jié)合(表2)。5種化合物中異鼠李素分別與4種蛋白獲得了最高的LibDock對(duì)接得分(如圖 8)。異鼠李素與CCL2(PBD ID:4ZK9)結(jié)合的LibDock分?jǐn)?shù)為 78.2015(如圖 8(a)),其結(jié)合作用通過(guò)異鼠李素B環(huán)與SER B:63、THR B:45氨基酸殘基形成碳?xì)滏I;C環(huán)與SER B:63、LEU B:25、ILE B:20氨基酸殘基形成π-Sigma相互作用;C環(huán)與SER B:21、ARG B:24氨基酸殘基形成amide-π堆疊相互作用;A、B、C環(huán)與VAL B:22、LEU B:25、ILF B:20、ILF B:51氨基酸殘基形成π-alkyl相互作用。異鼠李素與CXCL8(PBD ID:6N2U)結(jié)合的LibDock分?jǐn)?shù)為85.6050(如圖 8(b)),其結(jié)合作用通過(guò)異鼠李素A、B環(huán)羥基與LEU A:3、VAL A:25氨基酸殘基形成常規(guī)氫鍵;A環(huán)與ARG A:24、LYS A:1形成碳?xì)滏I;A、B、C環(huán)與ILE A:26形成π-alkyl相互作用。異鼠李素與IL1B (PBD ID: 6Y8M) 結(jié)合的LibDock分?jǐn)?shù)為85.8516(如圖 8(c)),其結(jié)合作用通過(guò)異鼠李素C環(huán)羰基與ASN A:108形成常規(guī)氫鍵;B環(huán)甲氧基與LYS A:103、ASP A:54形成碳?xì)滏I;A環(huán)與IEU A:110 形成π-alkyl相互作用。異鼠李素與VEGFA結(jié)合的LibDock分?jǐn)?shù)(PBD ID:1VPF)為78.2015(如圖 8(d)),其結(jié)合作用通過(guò)異鼠李素C環(huán)羥基與CYS B:61形成常規(guī)氫鍵;B、C環(huán)與ASP B:63、GLU B:64、GLU B:64、CYS B:61形成碳?xì)滏I;A、C環(huán)與CYS B:60形成π-alkyl相互作用。

注:圖中用三字母氨基酸代碼及其位置注釋殘基, 疏水殘基呈綠色,而極性殘基呈紫色,水分子呈青色,受體和配體之間的相互作用用不同顏色的虛線表示,與相應(yīng)的殘基顏色一致。

表2 高良姜中5個(gè)化合物與4個(gè)靶標(biāo)LibDock分子對(duì)接得分

3 總結(jié)與討論

痛風(fēng)是一種慢性疾病,由于血清尿酸水平過(guò)高導(dǎo)致尿酸晶體沉積在關(guān)節(jié)并引起炎癥,表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛,常見(jiàn)于指尖、肘、跖趾、跟腱等部位;2016 年統(tǒng)計(jì)顯示中國(guó)痛風(fēng)發(fā)病率為5.61%,并呈逐年上升趨勢(shì)[5]。目前,對(duì)于痛風(fēng)和高尿酸血癥還沒(méi)有根治的方法。西醫(yī)是主要的治療方法,但長(zhǎng)期使用藥物會(huì)產(chǎn)生副作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析,探討高良姜治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的活性成分及作用機(jī)制。結(jié)果從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了11種潛在活性化合物,前5位關(guān)鍵成分為槲皮素、山柰酚、異鼠李素、高良姜素、β-谷甾醇;篩選出高良姜藥物-痛風(fēng)及高尿酸血癥疾病28個(gè)共同靶點(diǎn),通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析前4位關(guān)鍵靶點(diǎn)是CCL2、CXCL8、IL1B、VEGFA;關(guān)鍵通路包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等信號(hào)通路;此外,高良姜還通過(guò)調(diào)節(jié)20個(gè)生物過(guò)程、10個(gè)細(xì)胞組分表達(dá)過(guò)程和20個(gè)分子功能來(lái)防治痛風(fēng)和高尿酸血癥。這也說(shuō)明高良姜由多種化合物組成,通過(guò)多途徑作用于痛風(fēng)和高尿酸血癥的不同靶點(diǎn),為后期臨床用藥和作用機(jī)制研究提供依據(jù)。

基于KEGG富集分析的結(jié)果,本文選擇了與痛風(fēng)和高尿酸血癥治療相關(guān)的糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路進(jìn)行如下分析:

糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路。高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是還原糖與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合的非酶合成的產(chǎn)物。AGEs與其受體產(chǎn)生的晚期糖基化終末產(chǎn)物(RAGE)結(jié)合能誘導(dǎo)各種類(lèi)型的細(xì)胞和器官的氧化應(yīng)激和炎癥[19-20]。圖9為AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的分析結(jié)果。研究表明,AGEs聯(lián)合RAGE可顯著提高OA軟骨細(xì)胞中TGF-β和MMP-9 mRNA、IL-1、蛋白的表達(dá)水平,顯著降低過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,增加丙二醛水平,顯著促進(jìn)NF-κB 的核轉(zhuǎn)位[21]。TGF-β和MMPs的表達(dá)水平可作為實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo),以判斷OA的嚴(yán)重程度。實(shí)驗(yàn)研究證明,槲皮素能夠抑制絲裂原活化蛋白激酶 (MAPKs) 的磷酸化、核因子 κ-B 激酶 (IKK)α/β等與炎癥過(guò)程相關(guān)的信號(hào)通路,激活轉(zhuǎn)錄因子 2 (ATF2) 和核因子 (NF)-κB p65,并阻止 NF-κB p65 易位進(jìn)入細(xì)胞核。通過(guò)降低IL-1β、IL-6、IL-8、ICAM-1、sICAM-1 和 MCP-1 產(chǎn)生阻斷 MAPK 和 NF-κB 信號(hào)通路的激活進(jìn)而改善炎癥反應(yīng)[22]。異鼠李素可劑量依賴(lài)性的降低NF-κB信號(hào)通路中TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1和TGF-β1的蛋白和mRNA的表達(dá)[23]。綜上所述,糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路可能是高良姜治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵通路。

圖9 糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路圖

IL-17信號(hào)通路。在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的早期階段會(huì)出現(xiàn)局部炎癥加強(qiáng),伴隨著關(guān)節(jié)紅腫和劇烈疼痛[24]。其中,IL-17是一種主要的促炎因子[25]。由IL-17信號(hào)通路圖(如圖10)可知,IL-17通過(guò)激活相關(guān)受體,介導(dǎo)NF-κB通路的激活;而TNF-α、IL-1β等炎性細(xì)胞因子也能增強(qiáng)IL-17的活性,增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1/3/9/13)的表達(dá)[25]。文獻(xiàn)研究證實(shí),IL-17與其受體結(jié)合,可激活NF-κB和MAPK等下游通路,誘導(dǎo)IL-6、TNF-α等表達(dá),繼而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[26]。在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者中也存在這一過(guò)程,由于NF-κB和激活蛋白1(AP-1)通路被激活[27],可增加促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-8、IL-17、TNF-α和NLRP3的表達(dá)[28]。實(shí)驗(yàn)研究證明,高良姜素及高良姜醇提物[29]、異鼠李素[30]能有效降低大鼠血清中的 IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎癥因子的水平,槲皮素[30]、山奈酚[31]、谷甾醇[32]可降低TNF-α水平,表明高良姜可能通過(guò)抑制IL-17信號(hào)通路來(lái)治療痛風(fēng)和高尿酸血癥。

圖10 IL-17信號(hào)通路圖

TNF信號(hào)通路。TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子,能誘導(dǎo)炎癥因子 IL-1β的表達(dá),兩者之間具有相互刺激的作用, IL-1β可以提高TNF-α的活性[34]。通過(guò)分析TNF信號(hào)通路圖(如圖11)可知,NF-κB通路被激活,增加了應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK1/2)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)的磷酸化水平,進(jìn)而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的表達(dá),來(lái)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),TNF-α可誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)分泌脂多糖,促進(jìn)成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其表達(dá)炎癥因子如IL-1β和IL-6,并增加細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)的磷酸化水平[35]。TNF-α在尿酸鈉(MSU)晶體誘導(dǎo)的小鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)中顯著升高,并與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[36]。而高良姜素及高良姜醇提物[29]、異鼠李素[30]能有效降低大鼠血清中的 IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎癥因子的水平,山奈酚[31]可通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6、IL-1β和COX-2分泌發(fā)揮抗炎作用,槲皮素[32]、谷甾醇[33]可降低TNF-α的表達(dá)水平,表明高良姜可能通過(guò)抑制TNF-α信號(hào)通路來(lái)治療痛風(fēng)和高尿酸血癥。

圖11 TNF信號(hào)通路圖

目前,高良姜總黃酮及單體化合物高良姜素、異鼠李素、β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素降尿酸藥理活性研究報(bào)道較多,說(shuō)明活性顯著,但是臨床應(yīng)用或相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)較少。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,闡述了高良姜防治痛風(fēng)和高尿酸血癥的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,其作用特點(diǎn)是多成分調(diào)控多靶點(diǎn),繼而調(diào)控多通路的炎癥反應(yīng)。通過(guò)分析高良姜降尿酸的活性成分和分子機(jī)制,為進(jìn)一步開(kāi)展高良姜降尿酸作用機(jī)制研究和降尿酸產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。本研究所獲得的關(guān)鍵活性成分和作用靶點(diǎn)是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的信息,分子對(duì)接虛擬篩選技術(shù)驗(yàn)證了成分與靶點(diǎn)的親和作用,但仍需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,因此后續(xù)將在此基礎(chǔ)上開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)高良姜治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的作用機(jī)制。