石蓉，謝瑩瑩，鄭金鳳，張悅，尹林高，劉雁鳴

1.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料工程技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410001；2.湖南省藥品審核查驗(yàn)中心，湖南 長沙 410001

聚乙二醇6000 是一種無毒、無刺激性的水溶性高分子聚合物，廣泛應(yīng)用于各種藥物制劑中［1］。聚乙二醇6000 作為藥用輔料主要應(yīng)用于口服和外用制劑，可作為軟膏、栓劑的基質(zhì)，片劑、膠囊劑的潤滑劑，增塑劑等［2］。聚乙二醇6000 現(xiàn)收載于《中國藥典》2020 年版四部［3］。目前國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)基本采用乙二醇或二甘醇為起始原料，在堿土金屬催化劑的作用下與環(huán)氧乙烷聚合生產(chǎn)聚乙二醇6000［4-5］。該聚合物由多個(gè)氧乙烯基組成線性鏈狀結(jié)構(gòu)，兩端各有1 個(gè)羥基，其自氧化過程會(huì)發(fā)生不同程度的斷裂，產(chǎn)生醛類小分子物質(zhì)，主要為甲醛和乙醛［6-7］。甲醛、乙醛化學(xué)性質(zhì)活潑，可與核酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生交聯(lián)，促進(jìn)蛋白質(zhì)羰基化，導(dǎo)致機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)和損傷，從而誘發(fā)多種疾病，目前已被國際癌癥研究組織認(rèn)定為1 類致癌物［8］?！吨袊幍洹?020 年版四部標(biāo)準(zhǔn)采用變色酸法對(duì)聚乙二醇6000的甲醛含量進(jìn)行控制。GB/T 14571.3-2008《工業(yè)用乙二醇中醛含量的測定-分光光度法》中采用酚試劑法測定乙二醇中總?cè)┖浚?］?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中對(duì)低分子醛測定有多種方法，其中2，4 二硝基苯肼（以下稱DNPH）柱前衍生-高效液相色譜法應(yīng)用廣泛［10-17］。故本研究通過采用變色酸法測定聚乙二醇6000 中甲醛含量，建立DNPH 柱前衍生-高效液相色譜法測定聚乙二醇6000 中甲醛、乙醛含量，參考GB14571.3-2008 采用酚試劑法測定聚乙二醇6000 中總?cè)┖窟@三種方法的比較研究，為藥用輔料聚乙二醇6000 醛類測定的標(biāo)準(zhǔn)制修訂提供參考和依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A 型高效液相色譜儀、PDA 檢測器、LCSlution 數(shù)據(jù)工作站；AUW220D 型電子天平，UV-2550 型紫外分光光度計(jì)（均來自島津有限公司）。

1.2 試藥

水中甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（批號(hào)為20211208，濃度為10 mg/mL），乙醛對(duì)照品（批號(hào)為22040034，純度為99.7%），均購自壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。2，4-二硝基苯肼（HPLC 級(jí)，批號(hào)為C10563969，純度為98%，購自上海麥克林生化科技有限公司）。乙腈（色譜純，購自默克公司）。鹽酸、硫酸、氨基磺酸、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物（MBTH）、六水合三氯化鐵、變色酸鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 變色酸法

參照《中國藥典》2020 年版四部聚乙二醇6000 的甲醛項(xiàng)［3］測定方法進(jìn)行試驗(yàn)，在567 nm 波長下測定供試品溶液和對(duì)照溶液吸光度，用同法操作的空白溶液進(jìn)行校正。根據(jù)吸光度以外標(biāo)法計(jì)算樣品中甲醛含量。

分別制備甲醛對(duì)照溶液、乙醛對(duì)照溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用空白溶液校正后，結(jié)果甲醛對(duì)照溶液吸光度為0.468，乙醛對(duì)照溶液吸光度為0.002，說明該方法只能測定甲醛，專屬性好。

2.2 DNPH 柱前衍生-高效液相色譜法

2.2.1 色譜條件 采用Waters XBridge C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-水（60∶40）為流動(dòng)相等度洗脫20 min，檢測波長為360 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫35 ℃。

2.2.2 溶液的制備 衍生化溶液：取經(jīng)重結(jié)晶純化后的2,4-二硝基苯肼0.25 g，精密稱定，置50 mL 棕色量瓶中，加入20 mL 乙腈渦旋使部分溶解，再加入3 mL 鹽酸迅速渦旋混勻，超聲使溶解，用乙腈稀釋至刻度，臨用新制。

供試品溶液：取樣品0.5 g，精密稱定，置10 mL 棕色量瓶中，加入1 mL 乙腈，渦旋使樣品溶解后，加入2 mL 衍生化溶液，渦旋混勻，30℃靜置15 min，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm 有機(jī)濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

空白溶液：不加樣品，按供試品溶液同法操作。

對(duì)照溶液：精密稱取乙醛對(duì)照品0.05 g，置10 mL 量瓶，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得乙醛貯備液。分別精密量取甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，乙醛貯備液1 mL，置同一100 mL 量瓶，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照混標(biāo)貯備溶液。精密量取對(duì)照混標(biāo)溶液1 mL，置10 mL 棕色量瓶中，自“加入2 mL 衍生化溶液…”按供試品溶液同法操作。

線性系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別精密量取甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4 mL，乙醛貯備液4 mL，置同一100 mL 量瓶，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線貯備溶液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)曲線貯備溶液適量，自“加入2 mL衍生化溶液…”按供試品溶液同法操作，得到線性系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，詳見表1。

表1 線性系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 μg/mL

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 精密量取空白溶液、供試品溶液和對(duì)照溶液各10 μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果空白溶液對(duì)測定無干擾，供試品溶液色譜圖中甲醛-DNPH、乙醛-DNPH 峰保留時(shí)間與對(duì)照品主峰保留時(shí)間一致。

圖1 DNPH柱前衍生-高效液相色譜圖：A.空白溶液；B.對(duì)照品溶液、C.供試品溶液

2.2.4 線性關(guān)系、檢出限、定量限、精密度與重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取線性系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各10 μL 進(jìn)樣，以濃度為X 軸，峰面積為Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密量取STD1 溶液1 mL 置10 mL 量瓶，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得檢出限溶液。取上述溶液10 μL 進(jìn)樣，分別按S/N=3、S/N=10 計(jì)算檢測限和定量限。取STD 6 溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算峰面積RSD。取同一批樣品按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果詳見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限、重復(fù)性與精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品（自編號(hào)：J6）和對(duì)照貯備溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和對(duì)照溶液，于室溫放置0、2、4、8 h，分別取樣10 μL 測定，以峰面積為考察指標(biāo)，結(jié)果供試品溶液中甲醛-DNPH、乙醛-DNPH 峰面積的RSD 分別為0.86%、0.62%，對(duì)照溶液中甲醛-DNPH、乙醛-DNPH 峰面積的RSD 分別為1.55%、0.31%，說明供試品溶液和對(duì)照溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 回收率試驗(yàn) 分別精密量取甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，乙醛貯備液2 mL，置同一100 mL 量瓶，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液1 mL，置20 mL 量瓶，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得回收標(biāo)準(zhǔn)溶液。取樣品（自編號(hào)：J6）0.5 g，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加入1 mL 回收標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法，自“加入2 mL 衍生化溶液…”同供試品溶液操作，平行制備6 份溶液。分別取樣10 μL測定并計(jì)算回收率，結(jié)果甲醛、乙醛平均回收率分別為：98.16%、95.54%，RSD 分別為 2.0%、1.2%。說明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.3 酚試劑法

2.3.1 測定方法 參照GB/T 14571.3-2008《工業(yè)用乙二醇中醛含量的測定-分光光度法》中酚試劑法［9］測定聚乙二醇6000 中總?cè)?。?20 nm 處測定供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液吸光度，用同法操作的空白溶液進(jìn)行校正，根據(jù)吸光度以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中總?cè)┖俊?/p>

2.3.2 線性關(guān)系、檢出限、定量限和重復(fù)性試驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液（0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.6μg/mL、0.8 μg/mL、1.0 μg/mL），依法測定吸光度，以濃度為X 軸，吸光度為Y 軸，繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。取空白溶液，依法重復(fù)測定7 次，計(jì)算SD 值。以3 SD/標(biāo)曲斜率，計(jì)算檢出限；以10 SD/標(biāo)曲斜率，計(jì)算定量限。取樣品（自編號(hào)：J15）按供試品溶液同法操作，平行制備6 份供試品溶液，依法測定，結(jié)果詳見表2。

2.3.3 加標(biāo)回收試驗(yàn) 取樣品（自編號(hào)：J15）9 份，各0.2 g，精密稱定，分別置50 mL 量瓶中，分為三組，每組3 份，分別加入0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL對(duì)照貯備溶液，按供試品溶液同法操作，即得加標(biāo)回收溶液。依法測定，結(jié)果低、中、高濃度水平的平均回收率分別為95.09%、99.18%、96.01%，RSD分別為0.66%、0.78%、0.85%，方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 樣品測定

2.4.1 樣品來源 共收集到聚乙二醇6000 樣品36 批（為國家藥品抽檢品種，均為藥用輔料級(jí)），來自7家生產(chǎn)企業(yè)，詳細(xì)信息見表3。

表3 聚乙二醇6000醛含量測定結(jié)果比較 %

2.4.2 樣品測定結(jié)果比較 分別采用上述三種方法，對(duì)36 批聚乙二醇6000 樣品進(jìn)行測定，結(jié)果比較表詳見表3。變色酸法和高效液相色譜法測定甲醛含量比較圖見圖2，酚試劑法測定總?cè)┖亢透咝б合嗌V法測定甲醛、乙醛總量比較圖見圖3。從以上圖表可知，按變色酸法測定，36 批樣品中甲醛含量為0.000 13%～0.002 05%，均小于法定檢驗(yàn)限度（0.003%），符合規(guī)定。按高效液相色譜法測定，36 批樣品中甲醛含量為0.000 05%～0.024 27%，乙醛含量為0.000 44%～0.023 21%，有4 批樣品（編號(hào)：J1、J14、J18 和J26）的甲醛測定結(jié)果遠(yuǎn)超法定限度。按酚試劑法測定，36批樣品中總?cè)┖繛?.001 07%～ 0.052 75%。

圖2 變色酸法和HPLC法測定甲醛含量比較圖

圖3 酚試劑法測定總?cè)┖亢透咝б合嗌V法測定甲醛、乙醛總量比較圖

為分析J1、J14、J18（來自A 企業(yè)）和J26（來自B 企業(yè)）這4 批樣品兩種方法甲醛測定結(jié)果不一致的原因，取樣品J1、J26 和J5（來自C 企業(yè)，含量小于0.003%）各1 g，精密稱定，分別加入1 mL甲醛溶液（30 μg/mL），按變色酸法制備樣品加標(biāo)回收溶液，在400～700 nm 紫外波長范圍進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，樣品J1、J26 均對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的顯色有干擾，樣品加標(biāo)溶液在567 nm 處無最大吸收，而來自C 企業(yè)的J5 樣品對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的顯色無干擾，樣品加標(biāo)溶液在567 nm 處有最大吸收。

3 討論

3.1 衍生化條件考察

采用DNPH 柱前衍生法進(jìn)行樣品處理，關(guān)鍵在于衍生液和衍生化過程。有文獻(xiàn)［16］報(bào)道2，4-二硝基苯肼本身會(huì)帶來甲醛、乙醛干擾。本研究對(duì)購買的HPLC 級(jí)2，4-二硝基苯肼進(jìn)行重結(jié)晶純化（稱取2，4-二硝基苯肼5 g，置圓底燒瓶中，加入100 mL 乙腈，90 ℃水浴加熱60 min 使溶解，60℃水浴中結(jié)晶，直到得到較大結(jié)晶，棄去上清液，用乙腈清洗結(jié)晶3 次，105 ℃干燥，即得），經(jīng)過空白試驗(yàn)驗(yàn)證，可排除醛類干擾。同時(shí)，衍生液應(yīng)臨用新制，比較配制后1 h 和8 h 的衍生液處理樣品和對(duì)照溶液。樣品中的甲醛、乙醛含量分別下降12.20%和11.14%，對(duì)照溶液中的甲醛、乙醛含量分別下降7.05%和8.21%。衍生溫度對(duì)衍生結(jié)果也有一定影響，分別考察30 ℃、40 ℃和50 ℃三個(gè)溫度梯度，結(jié)果顯示同一反應(yīng)時(shí)長下，隨著溫度增高，對(duì)照溶液中甲醛、乙醛含量呈下降趨勢。

3.2 三種醛類測定方法比較

本研究對(duì)聚乙二醇6000 中醛類測定方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明除J1、J14、J18 和J26 這4 批樣品外，變色酸法與高效液相色譜法測定的甲醛含量，高效液相色譜法測定的甲醛、乙醛總量和酚試劑法測定的總?cè)┖炕疽恢隆?/p>

變色酸法是法定標(biāo)準(zhǔn)，該方法中變色酸和甲醛以濃硫酸為介質(zhì)，生成紫色絡(luò)合物，專屬性好，但是該方法易受樣品基質(zhì)干擾，當(dāng)樣品中含有干擾顯色物質(zhì)時(shí)，比如其他醛類或雜質(zhì)，樣品在檢測波長處無最大吸收，造成甲醛含量測定結(jié)果遠(yuǎn)低于其實(shí)際含量。本研究建立的DNPH 柱前衍生HPLC 法簡便易操作，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明方法可行，可用于聚乙二醇6000 中甲醛、乙醛含量測定。酚試劑法測定總?cè)┖康姆椒▽W(xué)驗(yàn)證結(jié)果符合要求，4 批樣品（J1、J14、J18 和J26）總?cè)y定結(jié)果均高于HPLC 法測定甲醛、乙醛總量。推測可能是該4 批樣品中含有其他醛類，導(dǎo)致測定結(jié)果偏高。故三種醛類測定方法中，通過HPLC 測定聚乙二醇6000中甲醛、乙醛含量不受樣品干擾，測定結(jié)果更為準(zhǔn)確，可以作為甲醛、乙醛定量分析方法，結(jié)合酚試劑測定總?cè)┖?，可以從總體上控制藥用輔料聚乙二醇6000 的醛類物質(zhì)。