肖欽欽，張銀花，裴昆，陳希，段和祥，章紅江

西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

金霉素（chlortetracycline）為四環(huán)素類抗生素，被廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌感染疾病的治療，對革蘭陽性、陰性細(xì)菌和衣原體、支原體、立克次體均有較強的抑制作用［1］。金霉素是人類從金色鏈霉菌中發(fā)酵得到的第一個天然四環(huán)素類抗生素［2-3］，該類抗生素因化學(xué)結(jié)構(gòu)含有許多羥基、烯醇羥基及羰基導(dǎo)致其在酸性、堿性、中性、氧化等條件下均可降解形成多種降解雜質(zhì)［4-5］，金霉素及其已知雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。金霉素屬于兩性化合物，等電點為pH 7.4，不易溶于水，能與各種酸、堿形成鹽，最常見的為鹽酸鹽。從國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站查詢可知，鹽酸金霉素原料藥現(xiàn)有生產(chǎn)企業(yè)2 家，批文2 個，但僅一家企業(yè)仍在生產(chǎn)，其制劑有眼膏和軟膏2 種劑型，其中鹽酸金霉素眼膏占主要市場，臨床用于治療細(xì)菌性結(jié)膜炎、瞼腺炎、細(xì)菌性眼瞼炎及沙眼，但其質(zhì)量狀況總體評價有待提高［6］。

圖1 金霉素和已知雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

鹽酸金霉素現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《中國藥典》2020 年版［7］有關(guān)物質(zhì)檢查方法無法有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，該方法采用等度洗脫液相色譜法，部分雜質(zhì)無法洗脫出來，且雜質(zhì)計算方法不合理，因此，鹽酸金霉素現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)測定方法亟待改善［8］。目前，國外藥典僅《英國藥典》（BP）［9］、《歐洲藥典》（EP）［10］收載了鹽酸金霉素有關(guān)物質(zhì)檢查方法，以不同比例的高氯酸-二甲基亞砜-水體系作為流動相，采用超高效液相色譜（UPLC）進(jìn)行梯度洗脫，除控制鹽酸四環(huán)素、4-差向金霉素（雜質(zhì)A）兩個雜質(zhì)外，還將雜質(zhì)B、D、E、G、H、J、K、L 作為特定雜質(zhì)分別予以控制。本研究參照BP 和EP 方法，采用高效液相色譜法，建立有關(guān)物質(zhì)梯度洗脫法，以便更準(zhǔn)確更有效地分析鹽酸金霉素原料藥的雜質(zhì)狀況，從而為鹽酸金霉素制劑的質(zhì)量控制提供保障。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MS 205DU 電子天平（德國梅特勒公司），LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司），LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 試藥

鹽酸金霉素原料藥，共13 批，均為同一生產(chǎn)企業(yè)提供。對照品：鹽酸金霉素（批號：130489-201403，含量：94.1%），鹽酸四環(huán)素（批號：130488-201604，含量：98.4%），4-差向金霉素（批號：130404-201210，含量：90.1%），雜質(zhì)D（4-差向四環(huán)素，批號：130401-200209，供系統(tǒng)適用性用），雜質(zhì)I（脫水差向四環(huán)素，批號：130403-201205，含量：81.5%），均購于中國食品藥品檢定研究院。雜質(zhì)E（批號：D230730，含量：90.0%），雜質(zhì)B（批號：D0300000，含量：92.4%），雜質(zhì)G（批號：1790000，含 量：96%），雜 質(zhì)J（批 號：A1200000，含 量：93.0%），雜質(zhì)K（批號：E578060，含量：95%），雜質(zhì)L（批號：A637740，含量：90.39%），金霉素系統(tǒng)適用性對照品（批號：Y0001451，供系統(tǒng)適用性試驗用，包含雜質(zhì)A、B、D、E、G、H、J、K、L），均為EP 對照品。

二甲基亞砜（TEDIA 公司，色譜純），甲醇、乙腈（Sigma-Aldrich 公司，色譜純），水為超純水，高氯酸、鹽酸等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Ultimate XB-C8 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為高氯酸-水-二甲基亞砜（16∶934∶525）（pH＜2.0），流動相B 為乙腈，流動相C 為甲醇，線性梯度洗脫；流速為0.8 mL/min；柱溫為45 ℃；檢測波長為280 nm；進(jìn)樣量為20 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 系統(tǒng)適用性試驗

取鹽酸金霉素對照品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加0.01 mol/L 鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，于80 ℃水浴中加熱30 min，放冷。精密量取該溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果各雜質(zhì)色譜峰之間均能有效分離，分離度均大于1.5，見圖2。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖

2.3 溶液制備

2.3.1 稀釋劑的制備 取鹽酸0.9 mL，加水稀釋至1 000 mL，搖勻，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取鹽酸金霉素原料藥約50 mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.3.3 對照品溶液（1）的制備 取鹽酸四環(huán)素對照品、4-差向金霉素對照品各適量，精密稱定，加稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1 mL 中分別含80 μg 與40 μg 的溶液。

2.3.4 對照品溶液（2）的制備 取鹽酸金霉素對照品適量，精密稱定，加稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1 mL 中含鹽酸金霉素10 μg 的溶液。

2.3.5 靈敏度溶液的制備 精密量取對照品溶液（2）適量，用稀釋劑定量稀釋制成每1 mL 中含0.5 μg的溶液。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性關(guān)系考察 取鹽酸金霉素對照品適量，精密稱定，加稀釋劑溶解制成含鹽酸金霉素1 000、800、500、250、125、62、31 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液；取鹽酸四環(huán)素對照品適量，精密稱定，加稀釋劑溶解制成每1mL 中約含鹽酸四環(huán)素200、100、50、25、12、6、3 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液；取4-差向金霉素對照品適量，精密稱定，加稀釋劑溶解制成每1 mL 中約含4-差向金霉素160、80、40、20、10、5、2 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。分別精密量取上述3 個成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。各成分以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），分別進(jìn)行回歸分析。結(jié)果顯示，3 個成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線在各自濃度范圍內(nèi)均呈線性，見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.2 檢測限 取“2.4.1”項下各成分最低濃度水平線性溶液逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行液相色譜分析，以信噪比S/N ≥3 為檢測限，鹽酸金霉素檢測限為0.033 5 μg/mL，鹽酸四環(huán)素檢測限為0.077 9 μg/mL，4-差向金霉素檢測限為0.155 6 μg/mL。

2.4.3 重復(fù)性 取鹽酸金霉素原料藥，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液6 份，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行液相色譜分析，計算各雜質(zhì)的百分含量，結(jié)果6 份供試品中各雜質(zhì)含量基本無變化，RSD 均小于3.5%，見表3。說明該方法重復(fù)性較好。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.4.4 準(zhǔn)確度 取已知雜質(zhì)含量的供試品6 份，各約25 mg，精密稱定，分別加入對照品溶液（1）適量，按“2.3.2”項下方法制備測試溶液，精密量取測試溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算回收率。2 種雜質(zhì)回收率RSD 均小于1.5%，見表4，表明該方法的準(zhǔn)確度較好。

表4 回收率試驗結(jié)果

2.4.5 專屬性 取供試品溶液分別進(jìn)行以下試驗：（A）高溫降解，取供試品溶液5 mL，置100 ℃水浴中加熱15 min，冷卻；（B）光降解，取供試品溶液5 mL，在3 500 lx 光照強度下放置20 h；（C）堿破壞，取供試品溶液5 mL，加0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL，室溫放置5 min 后，加0.1 mol/L 鹽酸溶液1 mL，搖勻；（D）酸降解，取供試品溶液5 mL，加10 mol/L 鹽酸溶液2 mL，室溫放置30 min 后，加10 mol/L 氫氧化鈉溶液2 mL，搖勻；（E）氧化降解，取供試品溶液5 mL，加30%過氧化氫溶液2 mL，搖勻，室溫放置2 d。吸取上述5 種降解溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

結(jié)果顯示，鹽酸金霉素對高溫、堿、酸、氧化非常敏感。高溫條件下主要降解為4-差向金霉素、雜質(zhì)J、雜質(zhì)L；酸性條件下主要降解為雜質(zhì)G、雜質(zhì)J、雜質(zhì)L；堿性條件下主要降解為雜質(zhì)G；氧化條件下主要降解為雜質(zhì)H。鹽酸金霉素經(jīng)強制降解后，各雜質(zhì)峰與主峰之間均能有效分離，表明方法的專屬性強。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液在室溫下放置，分別于不同時間（0、1、2、4、6、8、10、12 h）進(jìn)樣分析，計算各雜質(zhì)百分含量。結(jié)果顯示供試品溶液中4-差向金霉素含量變化RSD 為31.4%，增加約1.4倍；雜質(zhì)J 和雜質(zhì)L 含量呈增加趨勢；其他雜質(zhì)含量變化均較小。說明供試品溶液不穩(wěn)定，需臨用新制。

2.5 樣品測定

按“2.3”項下方法制備鹽酸金霉素供試品溶液、對照品溶液、靈敏度溶液，按“2.1”項下色譜條件對13 批鹽酸金霉素原料藥進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，結(jié)果均檢出鹽酸四環(huán)素、4-差向金霉素、雜質(zhì)B、雜質(zhì)E、雜質(zhì)J、雜質(zhì)L，未檢出雜質(zhì)D、G、H、I、K 及其他未知雜質(zhì)。除鹽酸四環(huán)素含量為4.1%～5.2%，4-差向金霉素含量為0.9%～2.3%外，其他雜質(zhì)總量為0.6%～1.0%，其中雜質(zhì)B 含量為0.1%～0.4%，雜質(zhì)E 含量為0.3%～0.6%，雜質(zhì)J 含量為0.03%～0.07%，雜質(zhì)L 含量為0.06%～0.15%，13 批原料藥批間差異較大，但均在擬定限度范圍內(nèi)。

3 討論

3.1 流動相及系統(tǒng)適用性試驗的確定

通過降低流動相中二甲基亞砜比例，并調(diào)節(jié)甲醇、乙腈比例進(jìn)行梯度洗脫的方法，可明顯解決現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中高比例的二甲基亞砜易致系統(tǒng)超壓且色譜峰保留時間漂移大、等度洗脫難以將雜質(zhì)完全洗脫出來以致雜質(zhì)殘留加快色譜柱柱效降低等問題。

利用鹽酸金霉素對照品進(jìn)行熱降解，采用單個雜質(zhì)對照品對各雜質(zhì)峰進(jìn)行定位，結(jié)果顯示該降解溶液色譜圖中主要雜質(zhì)峰與BP 或EP 中系統(tǒng)適用性對照品中雜質(zhì)峰一致，鹽酸金霉素及其11 個已知雜質(zhì)均能有效分離，確定了系統(tǒng)適用性試驗方法及要求。

3.2 各雜質(zhì)計算方法及限度的確定

BP 或EP 收載的鹽酸金霉素原料藥有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)計算方法，鹽酸四環(huán)素采用外標(biāo)法計算不得過6.0%；雜質(zhì)G、J、K、L 采用加校正因子（依次為1.4、0.3、0.4、0.4）主成分外標(biāo)法計算，依次不得過0.2%、0.3%、0.15%、0.2%；雜質(zhì)A、B、D、E、H 均采用不加校正因子主成分外標(biāo)法計算，依次不得過4.0%、1.0%、0.2%、1.0%、0.2%，其他單個雜質(zhì)不得過0.10%，雜質(zhì)拋棄限為0.05%，各雜質(zhì)總和（除鹽酸四環(huán)素、雜質(zhì)A 外）不得過2.0%。

對原料藥中檢出的雜質(zhì)J、L 按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法計算含量分別為0.1%～0.3%、0.2%～0.5%，平均含量為0.2%、0.3%，雜質(zhì)J 含量大于0.2%的樣品率為38.5%，雜質(zhì)L 含量超出BP 或EP 限度樣品率為92.3%，顯然該計算方法不合理。本研究考察了雜質(zhì)J、K、L 的相對校正因子，結(jié)果差異甚小，因此相對校正因子及限度均參照BP 和EP；雜質(zhì)G 在原料藥及制劑中均未檢出，不作為特定雜質(zhì)進(jìn)行控制；其他雜質(zhì)除雜質(zhì)E 限度一致外，雜質(zhì)B（不得過0.5%）和雜質(zhì)D、H、I、K（均不得過0.1%）限度均低于BP 或EP 標(biāo)準(zhǔn)；鹽酸四環(huán)素和雜質(zhì)A 計算方法與限度仍參照現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)控制國內(nèi)鹽酸金霉素原料藥的質(zhì)量。