于曉慶，周銘懿，郭雪松

錦州醫(yī)科大學食品與健康學院（錦州 121000）

山楂葉能夠促進血液循環(huán)，消除淤血，調(diào)理氣血流通，降低血脂[1]，富含黃酮類、多糖類、三萜類等多種化合物[2]，具有較強的抗氧化和抗自由基活性[3]。番石榴葉是指屬于番石榴科植物在干燥狀態(tài)下的葉子或者帶有葉子的新鮮莖。在一些國家，番石榴葉具有傳統(tǒng)民間醫(yī)藥用途，可治療多種常見疾病，如風濕病、腹瀉、糖尿病和咳嗽等。多項研究顯示，番石榴葉具有對抗糖尿病的活性成分[4]。

植物乳桿菌具有較高的活菌數(shù)量，可以大量產(chǎn)酸，從而最大程度縮短發(fā)酵周期[5]，且由于耐酸性好，大部分菌種在胃液、膽汁內(nèi)可以存活并發(fā)揮功效，因此在制作復合發(fā)酵飲料時選擇更為適合的植物乳桿菌作為發(fā)酵劑。山楂葉和番石榴葉經(jīng)過植物乳酸桿菌發(fā)酵研制復合發(fā)酵飲料，為山楂葉和番石榴葉的精細加工和全面利用提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂葉、番石榴葉（干葉，亳州市益壽山藥業(yè)有限公司）；白砂糖（食品級，南京甘汁園股份有限公司）；海藻酸鈉（食品級，青島明月海藻集團有限公司）；植物乳酸桿菌（上海微生物保藏中心）。

乳酸菌培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

101-1型電熱鼓風干燥箱（上海喆鈦機械制造）；FW-100型高速萬能粉碎機（東莞市房太電器有限公司）；M4-AL204型電子分析天平（北京天星科儀科技有限公司）；OSP-520E型超聲波清洗機（石家莊奧斯派機械科技有限公司）；DE-52CS型離心機（廣州吉迪儀器有限公司）；YX-280B型高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）；CJ-840型水平超凈工作臺（東莞市弘維凈化科技有限公司）；DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱（上海捷呈實驗儀器有限公司）；RM-755B型紫外分光光度計（青島瑞明儀器設備有限公司）；YY-400型pH計（上海三信儀表廠）；GJJ-0.06/100型均質(zhì)機（東方化?？萍加邢薰荆?/p>

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程原料葉→清洗去雜→烘干→粉碎→浸提→離心→接種→發(fā)酵→配料→均質(zhì)→成品

1.3.2 浸提液的制備

選擇表面整潔、無霉變和蟲蛀的山楂葉和番石榴葉，用清水沖洗3遍除去其表面的雜質(zhì)，在80 ℃烘箱中烘干。將烘干后的山楂葉和番石榴葉用粉碎機粉碎成粉末狀，過0.425 mm（40目）篩，分別以料水比1∶20（g/mL），在70 ℃條件下進行超聲波輔助浸提60 min。浸提液經(jīng)離心后取上清液，備用。

1.3.3 菌種的活化

植物乳桿菌的活化及擴大培養(yǎng)：配制100 mL的MRS肉湯培養(yǎng)基，在121 ℃下滅菌15 min后冷卻至40℃左右；將甘油保存的植物乳桿菌在超凈工作臺上轉(zhuǎn)移到MRS肉湯培養(yǎng)基中，并且放置在恒溫培養(yǎng)箱中以37±1 ℃的溫度培養(yǎng)48 h；將3 mL培養(yǎng)液取出后，轉(zhuǎn)移到新的MRS肉湯培養(yǎng)基中，并將其放置在恒溫培養(yǎng)箱中（溫度37±1 ℃）進行48 h培養(yǎng)，得到活化2次的植物乳桿菌懸液，備用。

1.3.4 山楂葉番石榴葉復合發(fā)酵飲料的制備

將活化后的植物乳桿菌懸液加入浸提液中并充分攪拌混合后放入恒溫培養(yǎng)箱中進行一段時間的發(fā)酵，完成發(fā)酵后，以總浸提液的體積為基數(shù)加入5%白砂糖、0.25%海藻酸鈉，進行2次25 MPa的均質(zhì)處理后得到成品。

1.3.5 植物乳桿菌發(fā)酵單因素試驗

在乳酸菌發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵液中乳酸菌不斷繁殖，乳酸菌數(shù)量逐漸增多，根據(jù)白長勝等[6]運用吸光度法快速進行乳酸菌活菌計數(shù)的研究，乳酸菌發(fā)酵液在600 nm波長下測得的吸光度能反映乳酸菌發(fā)酵過程中乳酸菌活菌數(shù)的數(shù)量，因此單因素試驗以A600（發(fā)酵液在600 nm波長下測得的吸光度）為指標考察發(fā)酵條件。單因素試驗條件設置：以發(fā)酵后飲料的A600為評價指標，固定接種量4%、發(fā)酵時間36 h，設置發(fā)酵溫度31，33，35，37和39 ℃，探究發(fā)酵溫度對飲料A600的影響；固定發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間36 h，設定植物乳桿菌的接種量2%，3%，4%，5%和6%，探究接種量對飲料A600的影響；固定乳桿菌接種量4%、發(fā)酵溫度37 ℃，將原料浸提液分別發(fā)酵36，40，44，48和52 h，探究發(fā)酵時間對飲料A600的影響。

1.3.6 發(fā)酵工藝優(yōu)化

基于單因素試驗，根據(jù)發(fā)酵液的A600，使用Box-Behnken設計響應面試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)。響應面試驗因素水平如表1所示。

表1 響應面因素水平表

1.3.7 產(chǎn)品質(zhì)量指標檢測

1.3.71 pH的測定

采用pH計測量復合發(fā)酵飲料的pH。

1.3.72 總酸的測定

根據(jù)GB 12456—2021《食品中總酸的測定》[7]測定飲料總酸。

1.3.73 可溶性蛋白含量的測定

根據(jù)可溶性蛋白試劑盒使用說明，使用雙縮脲法測定飲料中可溶性蛋白含量。

1.3.74 微生物指標測定

乳酸菌活菌數(shù)的測定，根據(jù) GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》[8]進行乳酸菌的測定；根據(jù)GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)的測定》[9]方法，對飲料中乳酸菌活菌數(shù)進行測定；大腸菌群的測定，根據(jù)GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)》[10]測定飲料大腸菌群；霉菌和酵母菌測定，根據(jù)GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母菌計數(shù)》[11]測定飲料霉菌和酵母菌。

1.3.8 感官評價

感官評價采用百分制的評分方法，請15位品評人員參照表2的感官評價標準對制作的復合發(fā)酵飲料進行評價，評價內(nèi)容包括組織狀態(tài)、口感、氣味和整體接受度4個方面，評價標準采用無記名打分方式。

表2 復合發(fā)酵飲料的感官評價標準

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

各試驗平行重復3次，以“平均值±標準偏差”的形式描述試驗結(jié)果。以P＜0.05計為統(tǒng)計具有顯著性差異，P＜0.01計為統(tǒng)計差異極顯著。用Design-Expert 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌發(fā)酵最佳工藝參數(shù)

2.1.1 接種量對復合發(fā)酵飲料A600的影響

如圖1所示，A600隨著接種量的增加而增加。接種量超過5%后，A600沒有明顯變化。這是由于植物乳酸桿菌不斷繁殖，導致乳酸產(chǎn)量增加，發(fā)酵液的pH下降，從而抑制乳桿菌的生長。因此，選取接種量較低、A600較高的發(fā)酵條件，即選擇5%作為適宜的接種量。

圖1 接種量對A600的影響

2.1.2 發(fā)酵時間對復合發(fā)酵飲料A600的影響

從圖2可以觀察到，復合發(fā)酵飲料的A600隨著發(fā)酵時間的延長而增加，發(fā)酵時間44 h后，A600的增加量逐漸趨于穩(wěn)定。這是因為植物乳桿菌利用原料中的碳水化合物不斷產(chǎn)酸，不斷提高的酸度及其代謝產(chǎn)物對植物乳桿菌的生長起到抑制作用，降低其繁殖速度。初步考慮，發(fā)酵時間約44 h。

圖2 發(fā)酵時間對A600的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度對復合發(fā)酵飲料A600的影響

由圖3可得，發(fā)酵溫度過低或過高均會抑制植物乳桿菌的生長，發(fā)酵溫度保持在35 ℃時，復合發(fā)酵飲料的A600達到最高值，同時飲料中的活菌數(shù)也達到最高水平，因此，選擇發(fā)酵溫度35 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對A600的影響

2.2 發(fā)酵工藝響應面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 Box-Behnken試驗設計與結(jié)果

基于單因素試驗，在復合發(fā)酵飲料中，以A600作為指標，進行響應面試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，參數(shù)包括接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度。表3展示響應面試驗的設計和結(jié)果。

表3 響應面優(yōu)化試驗設計及結(jié)果

利用Design-Expert 13.0軟件對表3中的A600進行回歸擬合，得到二次多項回歸方程：A600=0.650 6+0.022 3A+0.019 4B+0.025 6C-0.000 3AB+0.005 8AC+0.004 5BC-0.048 6A2-0.060 3B2-0.122 8C2。

2.2.2 回歸模型有效性及顯著性

對響應面模型進行顯著性分析，結(jié)果如表4所示。

表4 回歸模型的方差分析

結(jié)果表明：回歸模型F=712，模型P值＜0.01，說明回歸模型極顯著；失擬項P值＞0.05，為不顯著，模型合理。決定因素R2=0.998 9，這說明回歸方程具有良好的擬合性，能有效描述因素與響應值之間的關系；Radj2=0.997 5，表明試驗誤差小，可靠性高。在回歸模型中，一次項和二次項的顯著性非常高，P值小于0.000 1，對A600均有極顯著影響。通過F值，可以判斷植物乳桿菌發(fā)酵山楂葉番石榴葉復合飲料A600的結(jié)果受到發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵時間3個考察因素的影響程度，按照大小順序排列為發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時間。

2.2.3 響應面因素交互作用分析

在對復合發(fā)酵飲料A600的影響進行綜合考察時，通過將其中1個因素保持不變，選擇其他2個因素觀察它們對A600的影響。通過Design-Expert 13.0軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行分析，得出等高線圖和響應曲面。

從圖4可以觀察出，植物乳桿菌的發(fā)酵參數(shù)呈現(xiàn)為橢圓形等高線圖，揭示接種量和發(fā)酵溫度之間有明顯交互作用，通過增大這2個因素，觀察到A600呈先升高后下降的趨勢。通過觀察響應曲面圖，可以發(fā)現(xiàn)增加發(fā)酵溫度對A600影響更明顯，相比之下增加接種量對A600的影響較小，說明發(fā)酵溫度對A600影響較大。

圖4 接種量和發(fā)酵溫度的響應曲面圖（左）和等高線圖（右）

根據(jù)圖5可以觀察到，植物乳桿菌的發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的等高線圖形呈不明顯的橢圓形狀，這表明發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度2個因素之間的相互影響作用較小。發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度逐漸增加，導致A600先增加后減少，但發(fā)酵溫度的增加幅度顯著高于發(fā)酵時間，表明發(fā)酵溫度對A600有更大影響。

圖5 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的響應曲面圖（左）和等高線圖（右）

從圖6可以看出，植物乳桿菌的發(fā)酵時間和接種量之間的相互作用不明顯，它們的等高線圖形呈現(xiàn)一個不明顯的橢圓狀。這表明發(fā)酵時間和接種量這2個因素之間的相互影響并不顯著。隨著植物乳桿菌接種量和發(fā)酵時間的增加，A600的測量值呈現(xiàn)先增加后減少趨勢。通過觀察該響應曲面，可以發(fā)現(xiàn)它們的上升幅度相似，即2個因素對A600的影響程度相當。

圖6 接種量和發(fā)酵時間的響應曲面圖（左）和等高線圖（右）

3個因素之間的相互作用及對A600的影響與方差分析結(jié)果一致，運用Design-Expert 13.0軟件得出該數(shù)據(jù)模型的最大值點，即植物乳桿菌發(fā)酵復合飲料的最佳生產(chǎn)工藝條件為接種量5.235%，發(fā)酵溫度35.225℃，發(fā)酵時間44.659 h，最大A600為0.656。為方便試驗操作，對發(fā)酵條件進行調(diào)整和優(yōu)化，即接種量5%，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時間44 h。通過對優(yōu)化后的試驗條件進行3次驗證試驗，測定其A600并得到平均值0.651±0.004。與模型預測值相比，誤差僅0.76%，這表明試驗結(jié)果與預測值的符合程度相當良好。因此，Box-Behnken設計不僅方案準確可靠，而且具有可操作性，能夠確保各個因素的添加量被準確把握。

2.2.4 產(chǎn)品質(zhì)量指標檢測結(jié)果

根據(jù)1.3.7產(chǎn)品質(zhì)量指標檢測中方法進行檢測，結(jié)果如表5所示。

表5 產(chǎn)品質(zhì)量指標檢測結(jié)果

由表5可知：復合發(fā)酵飲料中可溶性蛋白質(zhì)含量為0.32±0.01 mg/mL，乳酸菌總數(shù)為1.9±0.2×107CFU/mL，總酸度為0.31±0.03 g/L，大腸桿菌、酵母菌、霉菌數(shù)均符合國家標準要求。

2.2.5 感官評價結(jié)果

由圖7可以看出，15位品評人員中大部分認為該復合發(fā)酵飲料無異味，酸甜適中，口味純正，風味良好，具有山楂葉番石榴葉的清香。

圖7 感官評分

3 結(jié)論

以植物乳桿菌作為發(fā)酵劑對山楂葉和番石榴葉的浸提液進行發(fā)酵以制備復合飲料，最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為接種量5%、發(fā)酵時間44 h、發(fā)酵溫度35 ℃，在此條件下制備的發(fā)酵飲料A600為0.651±0.004，得到的復合發(fā)酵飲料酸甜可口，風味良好，大腸桿菌、酵母菌、霉菌數(shù)均符合國家標準要求。