李金鳳,崔夢祥,龍奕妃,孟春燕,任 琦,馮福民

抗結核藥物性肝損傷(antituberculosis drug-induced liver injury,ADLI)是抗結核藥物最嚴重且最常見的副反應,嚴重的ADLI會導致肝功能衰竭甚至死亡,但其發(fā)生發(fā)展機制尚未完全闡明。沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(silence informationregulator 1, SIRT1)是一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)依賴性的Ⅲ型組蛋白去乙?；?其引起的組蛋白乙?；漠惓ＥcADLI的發(fā)生發(fā)展密不可分[1]。有研究[2]顯示組蛋白乙?；降母淖兛赏ㄟ^調(diào)控細胞凋亡參與ADLI進程。SIRT1可調(diào)控核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)的穩(wěn)定性與表達[3]。在正常情況下,Nrf2能與細胞質(zhì)中的Kelch樣ECH關聯(lián)蛋白1(Kelch like ECH associated protein 1, Keap1)結合,導致Nrf2的活動暫時受到抑制。而SIRT1可觸發(fā)Nrf2與Keap1分離,Nrf2轉(zhuǎn)位進入細胞核,同時改變細胞內(nèi)正常的生理狀態(tài)[4]。因此本研究推測SIRT1/Nrf2信號通路在ADLI進展中可能發(fā)揮重要作用。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)能夠與NAD+相互轉(zhuǎn)換,參與細胞氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié),其外源給藥可以預防魚藤酮誘導的細胞損傷并調(diào)節(jié)凋亡相關基因的表達[5]。因此,本研究擬應用一線抗結核藥物異煙肼、利福平、吡嗪酰胺構建ADLI小鼠模型,利用NADH進行干預,旨在探討NADH通過調(diào)節(jié)SIRT1/Nrf2通路,改變凋亡信號從而調(diào)控小鼠ADLI的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器異煙肼(貨號:84-85-3)、利福平(貨號:13292-46-1)、吡嗪酰胺(貨號:98-96-4)購于日本TCI公司;TRIzol試劑盒(貨號:RP1001)購于北京百泰克生物技術有限公司;qRT-PCR試劑盒(貨號:MF303-05)購于北京聚合美生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:AG11705)購于湖南艾科瑞生物工程有限公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)(貨號:C009-2-1)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)(貨號:C010-2-1)、乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)試劑盒(貨號:A020-2-2)購于南京建成生物工程研究所;SIRT1抗體(貨號:13161-1-AP)、Nrf2抗體(貨號:16396-1-AP)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體(貨號:26593-1-AP)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)抗體(貨號:60267-1-AP)、caspase-3抗體(貨號:19677-1-AP)、β-actin抗體(貨號:8115-1-RR)、HRP標記羊抗兔二抗(貨號:PR30011)均購于武漢三鷹生物技術有限公司;NADH(貨號:ST358)、BCA蛋白定量試劑盒(貨號:P0012)購于上海碧云天生物技術有限公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(貨號:ZD304)購于北京莊盟國際生物科技有限公司。電泳儀(型號:DYY-8)、全波長酶標儀(型號:SpectraMax Plus 384型)購于上海美谷分子儀器有限公司;快速濕轉(zhuǎn)儀(型號:L00686C)購于南京金斯瑞生物科技有限公司;熒光定量PCR儀(型號:StepOnePlus)購于美國Applied Biosystems公司;光學顯微鏡(型號:CX43)購于日本奧林巴斯株式會社;Alpha凝膠成像系統(tǒng)(型號:Alpha Imager HP型)購于美國AlphaInotech公司。

1.2 ADLI小鼠模型和NADH干預組模型制備24只6周齡SPF級雄性小鼠,飼養(yǎng)于華北理工大學實驗動物中心屏障實驗室(實驗動物許可證號:SYXK冀2020-007),體質(zhì)量20～30 g,飼養(yǎng)溫度18～25 ℃,相對濕度40%～60%。適應性飼養(yǎng)1周后,隨機分為4組,每組6只。其中, ADLI組用90 mg/(kg·d)異煙肼+135 mg/(kg·d)利福平+315 mg/(kg·d)吡嗪酰胺灌胃處理(劑量按照臨床成人正常用藥劑量的9倍計算所得);對照組用ADLI組相同體積生理鹽水灌胃;NADH組在對照組的基礎上應用NADH 30 mg/kg灌胃處理;NADH干預組在ADLI組的基礎上應用NADH 30 mg/kg灌胃處理。每d灌胃1次,連續(xù)灌胃7 d,末次灌胃后處死小鼠并收集血清和肝組織,-80 ℃保存。

1.3 HE染色法檢測肝組織形態(tài)小鼠肝組織標本收集后經(jīng)固定→透明→包埋→切片等步驟制作病理切片,HE染色后,在光學顯微鏡下觀察小鼠肝組織的病理形態(tài)學改變。

1.4 qRT-PCR法檢測SIRT1、Nrf2、Bcl-2、Bax、caspase-3mRNA表達情況按照Trizol試劑盒說明書提取小鼠肝組織中的總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。構建PCR反應體系,共20 μl,其中Mix 10 μl,無酶水6 μl,cDNA 2 μl,上下游引物共2 μl;反應條件為95 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。以GADPH作為內(nèi)參。具體引物序列如下表1所示。

表1 引物序列表

1.5 Western blot法檢測蛋白表達情況取1.2中提及的不同處理組的小鼠肝組織,提取總蛋白,應用BCA蛋白定量試劑盒對各組細胞提取的蛋白進行定量。經(jīng)上樣→SDS-PAGE電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→一抗孵育→二抗孵育→洗膜→顯色等步驟觀察蛋白表達情況,其中一抗?jié)舛葹? ∶1 000,4 ℃條件下孵育過夜;羊抗兔二抗?jié)舛葹? ∶10 000,室溫條件下孵育2 h。應用ImageJ軟件分析蛋白灰度值。

1.6 微板法檢測肝損傷指標的表達情況按照ALT、AST、LDH試劑盒要求,將雙蒸水、丙酮酸標準液、待測樣本、基質(zhì)緩沖液、輔酶Ⅰ混合,37 ℃溫育15 min,加入2,4-二硝基苯肼后,再次混合,37 ℃溫育15 min,最后加入NaOH溶液混勻,于450 nm波長處檢測吸光度值。

2 結果

2.1 NADH對SIRT1/Nrf2通路表達水平的影響與對照組相比,ADLI組小鼠SIRT1和Nrf2蛋白和mRNA表達均降低(t=5.18、6.21、8.09、6.29,均P<0.05);與ADLI組相比,NADH干預后SIRT1、Nrf2蛋白和mRNA表達均升高(t=4.17、8.00、6.14、4.49,均P<0.05),SIRT1/Nrf2信號通路被激活,表明NADH可逆轉(zhuǎn)抗結核藥物引起的各指標的低表達。見圖1。

圖1 SIRT1/Nrf2通路相關指標mRNA和蛋白檢測結果(n=3)

2.2 NADH對小鼠肝組織形態(tài)學的影響HE染色結果顯示,與對照組相比,ADLI組小鼠肝組織結構紊亂,細胞明顯腫脹、邊界不清;而NADH干預后,肝組織結構較清晰,細胞呈多邊形。見圖2。

圖2 小鼠HE染色肝組織形態(tài)圖(×40)

2.3 NADH對小鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)的影響與對照組相比,ADLI組小鼠肝指數(shù)升高、體質(zhì)量降低(t=8.51、4.38,均P<0.05);NADH干預后,ADLI組小鼠肝指數(shù)明顯降低、體質(zhì)量升高(t=6.10、3.49,均P<0.05)。見圖3。

圖3 各組小鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)比較(n=3)

2.4 NADH對小鼠血清中凋亡指標的影響與對照組相比,ADLI組抗凋亡因子Bcl-2的蛋白及mRNA表達降低(t=5.20、4.89,均P<0.05),凋亡指標Bax、caspase-3的蛋白、mRNA表達水平均升高(t=8.16、8.85、3.89、8.03,均P<0.05);而NADH干預后,Bcl-2的蛋白、mRNA表達升高(t=6.16、5.01,均P<0.05),凋亡指標Bax、caspase-3的蛋白及mRNA表達水平均降低(t=9.39、6.10、3.81、7.29,均P<0.05),逆轉(zhuǎn)了抗結核藥物引起的指標變化。見圖4。

圖4 凋亡相關指標mRNA及蛋白檢測結果(n=3)

2.5 NADH對小鼠血清中肝損傷指標的影響結果顯示,與對照組相比,ADLI組小鼠ALT、AST、LDH活性增強(t=6.29、10.81、8.51,均P<0.05);而NADH干預后ALT、AST、LDH活性降低(t=3.64、9.63、4.80,均P<0.05)。見圖5。

圖5 各組血清中肝損傷指標活性比較(n=3)

3 討論

抗結核藥物性肝損傷是異煙肼、利福平、乙醇丁胺和吡嗪酰胺等一線抗結核藥物長期聯(lián)合應用導致的最嚴重的副反應,其機制至今尚未完全闡明。本研究應用抗結核藥物構建小鼠ADLI模型,并給予NADH處理,探討NADH通過SIRT1/Nrf2信號通路在ADLI發(fā)展中的調(diào)控機制。結果表明,NADH處理后,SIRT1/Nrf2信號通路被激活,小鼠肝細胞形態(tài)趨于正常,肝臟損傷得到緩解,凋亡水平下降,證實NADH可激活SIRT1/Nrf2信號通路,并改變凋亡指標蛋白和mRNA表達情況,緩解ADLI。

有研究[6-7]證實,抗結核藥物在肝臟代謝產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物會誘導炎癥反應和細胞凋亡,但其具體機制尚未完全闡明。本研究在ADLI模型中發(fā)現(xiàn)抗結核藥物能夠引起肝細胞腫脹、邊界不清等現(xiàn)象,ALT、AST、LDH等肝損傷指標表達上調(diào),凋亡相關因子Bcl-2蛋白、mRNA表達降低,Bax、caspase-3蛋白和mRNA表達升高,與前期研究[8]結果一致。

此外,ADLI的發(fā)生被認為與組蛋白修飾密不可分,SIRT1是組蛋白去乙酰化酶Sirtuins家族的主要成員,已被證實可以發(fā)揮去乙?；δ?緩解抗結核藥物引起的細胞損傷[2]。SIRT1還可以去除Nrf2基因的乙?；揎?并通過生成抗氧化酶促進其功能的發(fā)揮[9],因此,SIRT1/Nrf2信號通路在腎臟損傷[10]、肝損傷[11]等疾病中具有重要的調(diào)節(jié)功能,被認為是調(diào)節(jié)基因表達、緩解氧化損傷的關鍵信號通路。本研究顯示ADLI小鼠模型的SIRT1/Nrf2通路受到抑制,SIRT1和Nrf2的mRNA和蛋白表達水平均明顯降低,而在應用NADH后,該通路被激活,二者活性明顯增強。有研究[12]表明,在對乙酰氨基酚誘導的人正常肝細胞損傷中應用SIRT1的特異性激動劑,不僅會激活SIRT1的表達,使其活性增強,還可顯著促進Nrf2的表達,最終逆轉(zhuǎn)對乙酰氨基酚誘導的小鼠肝損傷。SIRT1/Nrf2通路還可在乙醇誘導的肝纖維化中抑制炎性因子的表達,從而改善酒精性肝纖維化[13]。這與本研究結果相一致,可見在ADLI的發(fā)生發(fā)展過程中,SIRT1/Nrf2通路也可發(fā)揮抗炎作用。

SIRT1 作為NAD+依賴性的去乙?；?降低NAD+含量能夠明顯抑制SIRT1蛋白的表達和活性[14-15]。因此,本研究在ADLI小鼠模型中應用NADH,SIRT1和Nrf2的水平均升高,可見NADH增加了小鼠體內(nèi)NAD+的含量,為SIRT1提供底物,激活了SIRT1/Nrf2信號通路。除此之外,NADH的作用機制與改善線粒體功能、增加抗凋亡蛋白、降低促凋亡蛋白的表達有關。本研究顯示NADH改變了小鼠肝組織中凋亡相關指標Bcl-2、Bax、caspase-3的表達,引起了凋亡信號的變化;同時ALT、AST、LDH等肝損傷指標活性均降低,ADLI小鼠炎癥反應得到緩解。

本研究通過在ADLI小鼠中應用NADH,證明了NADH可改變SIRT1/Nrf2信號通路中SIRT1、Nrf2蛋白和mRNA的表達,緩解ADLI小鼠的炎癥反應和細胞凋亡,為ADLI的治療提供新的方向。但本研究尚有不足之處。首先,本研究僅以小鼠為研究對象,在體內(nèi)水平進行研究,研究結果不能外推。其次,僅觀察了SIRT1/Nrf2信號通路中SIRT1、Nrf2蛋白和mRNA的表達情況,并未研究二者之間的相互作用機制,具有一定的局限性。未來應從人群、體外等水平進一步探討NADH對ADLI的保護作用,并深入研究SIRT1對Nrf2的具體調(diào)控機制,為闡明ADLI的發(fā)生機制提供理論依據(jù)。