雷 波,邱明星,劉健男

腎結(jié)石是晶體物質(zhì)在腎臟的異常聚積所致,是一種常見的泌尿系統(tǒng)疾病。據(jù)報道,2016年我國腎結(jié)石的患病率約為 5.8%～7.5%[1],而2020年美國腎結(jié)石患病率約為10%[2]。目前,臨床常采用超聲、手術(shù)治療腎結(jié)石,但存在易復發(fā)、尿路感染及腎臟損傷等隱患。研究[3]表明,超過70%結(jié)石類型為草酸鈣(calcium oxalate,CaOx))結(jié)石,其起源于腎乳頭鈣化斑塊Randall斑,而Randall斑的形成與腎組織細胞成骨分化有關(guān)[4]。研究[5]顯示,miR-23b-3p在Randall斑與正常腎乳頭狀組織中差異表達。肌細胞增強因子2(myocyte enhancer factor 2,MEF2)C是MEF2亞家族的成員之一,在MgCl2誘導的成骨分化后的小鼠間充質(zhì)干細胞中表達上調(diào)[6]。上述研究結(jié)果提示,miR-23b-3p和MEF2C均參與細胞成骨分化過程,但具體調(diào)控機制不明。因此,該研究旨在探討miR-23b-3p是否通過靶向調(diào)控MEF2C對腎間質(zhì)成纖維細胞(human renal interstitial fibroblasts,hRIFs)成骨樣分化的影響,旨在為防治CaOx結(jié)石提供新方向。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2019年11月至2021年6月期間在西南醫(yī)科大學臨床學院治療的37例CaOx結(jié)石患者的Randall斑(Randall plaque, RP)組織作為研究組,另收集同時期26例在西南醫(yī)科大學臨床學院接受腎切除術(shù)的腎腫瘤患者的正常乳頭狀(normal Randall plaque, nRP)組織作為對照組。其中研究組患者男性20例,女性17例,年齡范圍:21～63(43±8.57)歲;對照組患者均無泌尿系結(jié)石病史,其中男性14例,女性12例,年齡范圍:28～62(41±6.28)歲。兩組患者年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義。本研究通過本院倫理委員會批準(編號:LZ201901023),患者和家屬均簽署知情同意書。RP和nRP組織標本通過手術(shù)取出后迅速置于液氮中,之后將標本移至-80 ℃冰箱凍存,用于后續(xù)實驗。

1.2 主要試劑和儀器DMEM/F12培養(yǎng)基、opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C購自美國Sigma公司;青-鏈霉素(P-S)、成骨細胞礦化結(jié)節(jié)染色試劑盒(茜素紅S法)、Triton X-100、牛血清白蛋白(BSA)、Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;人堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)ELISA試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司;miR-23b-3p過表達質(zhì)粒pSi-miR-23b-3p及其陰性空載質(zhì)粒pSi-NC、MEF2C慢病毒過表達質(zhì)粒Lv-MEF2C(滴度:4.51×108TU/ml)及其空載質(zhì)粒Lv-NC(滴度:1.73×108TU/ml)、miR-23b-3p mimic及其陰性對照mimic NC由上海漢恒生物科技有限公司合成;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、pmirGLO載體購自武漢金開瑞生物工程有限公司;通用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR premix Ex Taq PCR試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒、miRNA qPCR試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司;引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成;波形蛋白(Vimentin)抗體、鈣黏蛋白E(E-cadherin)抗體、MEF2C抗體、GAPDH抗體購自美國Affinity公司;Cy3標記的羊抗兔二抗、HRP標記的羊抗兔二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。超凈工作臺(SW-CJ-2D)購自蘇州凈化設備有限公司;CO2培養(yǎng)箱(MCO-18AC)購自日本松下公司;倒置熒光顯微鏡(XD-202)南京江南永新光學有限公司;酶標分析儀(AMR-100)購自杭州奧盛儀器有限公司;化學發(fā)光成像系統(tǒng)(ChemiDoc Touch)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1hRIFs細胞分離、培養(yǎng)及鑒定 主刀醫(yī)師對腎腫瘤患者行腫瘤切除手術(shù),取距腫瘤邊緣> 5 cm處1 mm3大小的正常組織塊,參考張和平 等[7]膠原酶法分離出hRIFs細胞,用含10%胎牛血清、1% P-S 的DMEM/F12完全培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3～4 d換液1次。顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài),待細胞生長至80%～90%融合度時,以1 ∶2傳代比例進行傳代培養(yǎng)。選取第2代(P2)對數(shù)生長期細胞,采用免疫熒光實驗鑒定hRIFs,觀察細胞中Vimentin和E-cadherin蛋白表達及分布情況,Vimentin陽性表達、E-cadherin陰性表達即為hRIFs細胞。

1.3.2hRIFs細胞成骨誘導及成骨分化能力鑒定 取第3代對數(shù)生長期hRIFs細胞,以1×105個細胞/孔接種至6孔板,置于培養(yǎng)箱過夜,更換成骨誘導液(10% 胎牛血清+0.1 μmol地塞米松+10 mmol β-甘油磷酸鈉+50 μg/ml 維生素C+1% P/S+DMEM/F12)繼續(xù)培養(yǎng),每2～3 d換液1次。分別于第0、3、5、7、14 天時,取細胞上清按下述ELISA法檢測ALP活性,繪制標準曲線,計算各組細胞上清中ALP水平(ng/ml);取細胞按下述qRT-PCR法檢測成骨標志物(OCN、OPN、Runx2)mRNA表達水平;于成骨誘導第14 天采用下述茜素紅染色法檢測細胞礦化結(jié)節(jié)形成情況。

1.3.3 實驗分組及細胞轉(zhuǎn)染取第3代對數(shù)生長期hRIFs細胞,以1×105個細胞/孔接種至6孔板,置于培養(yǎng)箱過夜。第一部分探討miR-23b-3p過表達對hRIFs細胞成骨樣分化的影響,先將hRIFs細胞分為3組:① blank組;② pSi-NC組,轉(zhuǎn)染攜帶pSi-NC質(zhì)粒至細胞中;③ pSi-miR-23b-3p組,轉(zhuǎn)染攜帶pSi-miR-23b-3p過表達質(zhì)粒至細胞中;轉(zhuǎn)染成功后各組均成骨誘導14 d。第二部分探究miR-23b-3p通過調(diào)控MEF2C基因表達參與hRIFs細胞成骨樣分化的調(diào)節(jié)作用,先將hRIFs細胞分為4組:① pSi-NC組;② pSi-miR-23b-3p組;③ pSi-miR-23b-3p+Lv-NC組,共轉(zhuǎn)染攜帶pSi-miR-23b-3p過表達質(zhì)粒和Lv-NC慢病毒至細胞中;④ pSi-miR-23b-3p+Lv-MEF2C組,共轉(zhuǎn)染攜帶pSi-miR-23b-3p過表達質(zhì)粒和Lv-MEF2C慢病毒至細胞中,轉(zhuǎn)染成功后均成骨誘導14 d。參照轉(zhuǎn)染試劑說明書,使用opti-MEM培養(yǎng)基和Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑將pSi-miR-23b-3p過表達質(zhì)粒及其陰性空載質(zhì)粒pSi-NC轉(zhuǎn)入hRIFs細胞中,轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基,48 h后收集部分細胞采用1.3.5項方法檢測轉(zhuǎn)染效率, 病毒轉(zhuǎn)染:參照病毒轉(zhuǎn)染說明書,使用含5 μg/ml聚凝胺完全培養(yǎng)基稀釋慢病毒,將慢病毒Lv-MEF2C及其空載病毒Lv-NC以感染復數(shù)為200感染hRIFs細胞,16 h后更換新鮮培養(yǎng)基,48 h后置于熒光顯微鏡下觀察感染效率。

1.3.4茜素紅檢測細胞礦化結(jié)節(jié)情況 去除培養(yǎng)液,PBS洗滌1次,4 %多聚甲醛固定20 min,PBS洗3次,加入適量茜素紅S染色液,室溫孵育30 min,PBS洗3次,顯微鏡下觀察和拍照細胞礦化結(jié)節(jié)情況。

1.3.5qRT-PCR檢測 收集RP和nRP組織、成骨誘導不同時間(0、3、5、7、14 d)及1.3.3項下第一部分和第二部分各組處理后的細胞,加入TRIzol裂解液提取總RNA,mRNA檢測:使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用SYBR premix Ex Taq PCR試劑盒進行mRNA熒光定量分析;miRNA檢測:使用miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒將樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用miRNA qPCR試劑盒進行miRNA熒光定量分析。引物序列見表1。反應條件:95 ℃預變性60 s,95 ℃、20 s,65 ℃、30 s,共循環(huán)40次。以U6和GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計算RP和nRP組織及各組細胞中miR-23b-3p和MEF2C、OCN、OPN、Runx2 mRNA表達水平。

表1 引物序列表

1.3.6Western blot檢測 消化離心收集成骨誘導不同時間(0、3、5、7、14 d)及1.3.3項下第一部分和第二部分各組處理后的細胞,加入預冷PBS洗滌1次,加入適量含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液,冰上裂解30 min后于4 ℃、12 000 r/min離心提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量,將蛋白樣品使用金屬浴煮沸10 min變性,各組取40 μg蛋白上樣進行電泳,進行轉(zhuǎn)膜處理后加入封閉液室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,加入一抗MEF2C抗體(1 ∶1 000),GAPDH抗體(1 ∶5 000),4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次,加入HRP標記的羊抗兔二抗(1 ∶2 000),室溫孵育1 h,滴加ECL顯影液,曝光,采用ImageJ軟件分析條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.3.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-23b-3p與MEF2C靶向關(guān)系 采用miRNA靶基因在線預測網(wǎng)站TargetScanHuman 7.2預測miR-23b-3p與MEF2C的靶向結(jié)合位點,并在hRIFs細胞中驗證miR-23b-3p與MEF2C的靶向關(guān)系。將野生型(WT)和突變型(MUT)MEF2C序列構(gòu)建入pmirGLO載體中(WT-MEF2C和MUT-MEF2C)。取P3代對數(shù)生長期hRIFs細胞,以5 104個/孔接種至24孔板中,采用Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑將WT-MEF2C和MT-MEF2C質(zhì)粒與miR-23b-3p mimic或mimic NC共轉(zhuǎn)染48 h。參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行檢測,采用熒光酶標儀測定相對光度(relative light unit,RLU)值并計算熒光素酶活性。熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶RLU值/海腎熒光素酶RLU值。

2 結(jié)果

2.1 CaOx結(jié)石患者Randall斑組織中miR-23b-3p與MEF2C表達水平及其相關(guān)性與nRP組織比較,RP組織中miR-23b-3p表達水平明顯降低(P<0.05),而MEF2C mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖1A、B。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,在RP組織中,miR-23b-3p與MEF2C mRNA表達水平呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.462,P=0.004)見圖1C。

圖1 CaOx結(jié)石患者Randall斑組織中miR-23b-3p與MEF2C表達水平及其相關(guān)性分析

2.2 Vimentin和E-cadherin在hRIFs細胞中的分布特點免疫熒光結(jié)果顯示,細胞中Vimentin蛋白呈陽性表達,E-cadherin蛋白呈陰性表達,提示hRIFs細胞分離成功。見圖2。

圖2 hRIFs細胞中Vimentin蛋白和E-cadherin蛋白表達 免疫熒光 ×400

2.3 成骨誘導液對hRIFs細胞礦化結(jié)節(jié)、ALP水平及成骨標志物的變化茜素紅染色結(jié)果顯示,與0 d比較,成骨誘導至14 d時細胞時出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)。見圖3A。ELISA結(jié)果顯示,不同成骨誘導時間(3、5、7、14 d)ALP水平分別為(12.12±0.68)ng/ml、(20.33±3.57)ng/ml、(30.65±2.88)ng/ml、(45.81±3.33)ng/ml,(80.26±5.49)ng/ml;細胞中ALP水平隨成骨誘導時間延長呈上升趨勢(t=3.91、10.86、17.19、21.34,均P<0.05)。見圖3B。qRT-PCR結(jié)果顯示,不同時間點的細胞中OCN、OPN、Runx2 mRNA表達水平差異具有統(tǒng)計學意義(tOCN=9.82、16.93、9.93、16.90,均P<0.05;tOPN=5.05、10.35、13.94、23.25,均P<0.05;tRunx2=15.24、21.55、9.58、14.72,均P<0.05),且隨著時間的延長,細胞中OCN、OPN、Runx2 mRNA表達水平逐漸上升。見圖3C。

圖3 hRIFs細胞成骨誘導分化鑒定

2.4 miR-23b-3p過表達對hRIFs細胞成骨樣分化的影響qRT-PCR結(jié)果顯示,與0 d比較,隨著成骨誘導時間(3、5、7、14 d)的延長,細胞中miR-23b-3p表達水平均逐漸降低(t=6.43、6.33、22.58、154.20,均P<0.05)。見圖4A。與blank組或pSi-NC組比較,pSi-miR-23b-3p組hRIFs細胞中miR-23b-3p表達水平明顯升高(t=18.20、18.04,均P<0.05),提示miR-23b-3p過表達成功。見圖4B。各組hRIFs細胞成骨誘導14 d后,與blank組或pSi-NC組比較,pSi-miR-23b-3p組細胞中成骨標志物OCN、OPN、Runx2 mRNA表達水平均明顯降低(t=22.25、12.18,10.39、8.59、53.96、20.91,均P<0.05)。見圖4C。茜素紅染色結(jié)果顯示,各組hRIFs細胞成骨誘導14 d后,與blank組或pSi-NC組比較,pSi-miR-23b-3p組細胞形成礦化結(jié)節(jié)能力減弱。見圖4D。

圖4 miR-23b-3p過表達對hRIFs細胞成骨樣分化的影響

2.5 MEF2C基因參與hRIFs細胞成骨樣分化的調(diào)節(jié)qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與0 d比較,隨著成骨誘導時間(3、5、7、14 d)的延長,細胞中MEF2C mRNA和蛋白表達水平逐漸升高(tmRNA=4.07、11.17、9.01、14.45,均P<0.05;t蛋白=5.42、14.72、14.79、8.91,均P<0.05)。見圖5。

圖5 qRT-PCR(A)和Western blot(B)檢測不同成骨誘導時間點細胞中MEF2C mRNA和蛋白表達水平

2.6 miR-23b-3p通過調(diào)控MEF2C基因表達參與hRIFs細胞成骨樣分化的調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)染后,qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與pSi-NC組比較,pSi-miR-23b-3p組和pSi-miR-23b-3p+Lv-NC組hRIFs細胞中MEF2C mRNA和蛋白表達水平明顯降低(均P<0.05);與pSi-miR-23b-3p+Lv-NC組比較,pSi-miR- 23b-3p+Lv-MEF2C組hRIFs細胞中MEF2C mRNA和蛋白表達水平明顯升高(均P<0.05)。見圖6A、6B。成骨誘導14 d后,與pSi-NC組比較,pSi-miR-23b-3p組和pSi-miR-23b-3p+Lv-NC組細胞中OCN、OPN、Runx2 等mRNA表達水平明顯降低(均P<0.05);pSi-miR-23b-3p+Lv-NC組比較,pSi-miR-23b-3p+ Lv-MEF2C組細胞中OCN、OPN、Runx2 等mRNA表達明顯升高(均P<0.05)。見圖6C。茜素紅染色結(jié)果顯示,與pSi-NC組比較,pSi-miR-23b-3p組和pSi-miR-23b-3p +Lv-NC組細胞礦化結(jié)節(jié)形成能力減弱;與pSi-miR-23b-3p+Lv-NC組比較,pSi-miR-23b-3p+Lv-MEF2C組細胞礦化結(jié)節(jié)能力形成增強。見圖6D。

圖6 miR-23b-3p通過調(diào)控MEF2C基因表達參與hRIFs細胞成骨樣分化的調(diào)節(jié)

2.7 miR-23b-3p靶向負調(diào)控MEF2CmiRNA靶基因在線預測網(wǎng)站TargetScanHuman 7.2預測結(jié)果顯示,miR-23b-3p與MEF2C 3′-UTR區(qū)域存在互補的結(jié)合位點。見圖7A。雙熒光素酶基因檢測報告結(jié)果顯示,在MUT-MEF2C細胞中,與mimic NC組(1.01±0.04)比較,miR-23b-3p mimic組細胞熒光素酶活性(0.23±0.01)明顯降低(P<0.05);然而,在WT-MEF2C細胞中,與mimic NC組(1.02±0.05)比較,miR-23b-3p mimic組細胞熒光素酶活性(0.98±0.04)無明顯變化(P>0.05)。見圖7B。表明miR-23b-3p能靶向負調(diào)控MEF2C表達。另外,qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與blank組或pSi-NC組比較,pSi-miR-23b-3p組細胞中MEF2C mRNA和蛋白表達水平明顯降低(均P<0.05)。見圖7C、7D。

圖7 miR-23b-3p與MEF2C靶向關(guān)系驗證

3 討論

Randall斑是一種腎乳頭上皮組織下存在的鈣化斑塊,始發(fā)于髓袢細段腎小管上皮細胞的基底膜,逐漸延伸至腎髓質(zhì)的間質(zhì),最后沉積在腎乳頭的間質(zhì)組織中。O′Kell et al[8]認為,Randall斑是特發(fā)性CaOx結(jié)石形成的先決條件,CaOx成核并附著于Randall斑上,進一步發(fā)展形成結(jié)石。臨床研究[9]發(fā)現(xiàn),Randall斑覆蓋的面積與CaOx結(jié)石數(shù)量呈正相關(guān)。張一帆 等[10]研究通過分析Randall斑結(jié)石患者24 h尿液成分分析發(fā)現(xiàn)Randall斑患者24 h尿液中草酸、磷酸、鈉、鈣含量顯著升高。因此,Randall斑與CaOx結(jié)石形成關(guān)系密切,值得深入研究。

近年來,miR-23b-3p在骨代謝的作用機制受到廣泛關(guān)注。Li et al研究[11]表明,miR-23b-3p在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的小鼠骨組織中表達上調(diào),降低其表達可上調(diào)Runx2、OCN、Osterix的表達和提高ALP活性從而促進小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。Yu et al研究[12]顯示,lncRNA RP11-84C13.1通過吸收miRNA-23b-3p上調(diào)Runx2表達,從而誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。Zhu et al[13]研究顯示,hRIFs成骨樣分化增強可促進Randall斑的形成。而本研究結(jié)果顯示,與正常乳頭狀組織比較,CaOx結(jié)石患者Randall斑組織中miR-23b-3p表達水平下調(diào);且體外細胞實驗結(jié)果顯示,miR-23b-3p高表達可下調(diào)成骨標志物(OCN、OPN、Runx2)mRNA表達水平,降低細胞礦化結(jié)節(jié)形成的能力,從而抑制hRIFs細胞成骨分化。提示miR-23b-3p可能具有通過抑制hRIFs成骨樣表型進而阻止Randall斑形成的潛能。

MEF2C是MEF2家族轉(zhuǎn)錄因子之一,其編碼的蛋白質(zhì)參與多種生物進程,如心血管系統(tǒng)發(fā)育、肌肉生成和骨代謝。近年來研究[14]顯示,MEF2C在骨代謝過程中發(fā)揮促進作用。Jiang et al研究[15]發(fā)現(xiàn),MEF2C在成骨分化后的人骨髓間充質(zhì)干細胞中表達上調(diào),沉默其表達可抑制骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。因此,MEF2C可能成為抑制細胞成骨分化的重要靶點,從而抑制Ranall斑形成。本研究結(jié)果顯示,與正常乳頭狀組織比較,CaOx結(jié)石患者Randall斑組織中MEF2C表達水平上調(diào),推測MEF2C高表達可能促進Randall斑形成,確定其作用機制可以為CaOx結(jié)石的早期診斷和治療提供新的理論基礎。然而miR-23b-3p與MEF2C是否調(diào)控hRIFs細胞成骨分化從而參與Randall斑形成尚未可知。因此,本研究將miR-23b-3p過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入hRIFs細胞中,發(fā)現(xiàn)miR-23b-3p過表達可下調(diào)MEF2C表達水平,雙熒光素酶實驗結(jié)果也表明miR-23b-3p可靶向調(diào)控MEF2C,提示miR-23b-3p可能通過靶向下調(diào)MEF2C從而抑制細胞成骨分化,從而抑制Randall斑形成。為進一步驗證結(jié)論,本研究將miR-23b-3p過表達質(zhì)粒和MEF2C過表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染hRIFs細胞,顯示MEF2C過表達可逆轉(zhuǎn)miR-23b-3p過表達對hRIFs細胞成骨分化抑制作用,提示miR-23b-3p可通過靶向調(diào)控MEF2C抑制hRIFs細胞成骨分化從而參與Randall斑形成。

綜上所述,miR-23b-3p在CaOx結(jié)石患者Randall斑組織中低表達,且miR-23b-3p可靶向調(diào)控MEF2C抑制hRIFs細胞成骨分化,從而參與Randall斑形成,最終導致CaOx結(jié)石產(chǎn)生,本研究為CaOx結(jié)石的防治提供了一個新的潛在靶點。但仍存在一些不足之處,本研究僅從細胞層面研究了miR-23b-3p與MEF2C調(diào)控腎間質(zhì)成纖維細胞成骨分化,后續(xù)將從動物層面著手,構(gòu)建CaOx結(jié)石動物模型,深入探究miR-23b-3p與MEF2C對體內(nèi)CaOx結(jié)石的作用機制。