毛 戩,溫萍萍,孫洪英,張舒雅,孟晨曦,張 佳

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,特征是神經(jīng)元過度同步放電出現(xiàn)短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙,還伴有一定程度的心理障礙、行為障礙以及認(rèn)知障礙[1]。目前全世界有超過7 000萬的癲癇患者,其中約三分之一為難治性癲癇[2]。癲癇的反復(fù)發(fā)作、高病死率加重了癲癇患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。神經(jīng)元高度同步異常放電是癲癇發(fā)作的根本原因,但具體的發(fā)病機(jī)制尚未明確。因此,研究癲癇的發(fā)病機(jī)制,尋找診斷和治療癲癇的新方法尤為重要。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA,因其半衰期較長、表達(dá)穩(wěn)定、不易降解等性質(zhì)被廣泛研究[4],其在腦組織中表達(dá)豐富,在神經(jīng)元功能中起著重要作用。據(jù)報(bào)道[5],circRNA與多發(fā)性硬化癥、帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān),然而,由于癲癇發(fā)病的具體機(jī)制尚不明確,且目前關(guān)于circRNA與癲癇的研究相對其他疾病開展的較少,病變通路、作用靶點(diǎn)尚未明確。該研究旨在對癲癇患者及對照組進(jìn)行基因芯片測序結(jié)果分析,并對circ_0017178在癲癇中的作用機(jī)制進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測,探究circ_0017178對戊四唑癲癇小鼠的行為學(xué)變化及海馬細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料RNeasy Kit(美國安捷倫科技有限公司,貨號(hào):DXT-74404)、 TRIZOL(德國themro,貨號(hào):15596026)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊有限公司,貨號(hào):R211-01/02),Fioll淋巴細(xì)胞分離液(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):P8610),戊四唑(美國Sigma,貨號(hào):P6500),Tunel細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司,貨號(hào):40308ES60),PBS洗液(上海源培生物科技公司,貨號(hào):B390KJ),人circRNA基因芯片(美國安捷倫科技有限公司,芯片ID085202)、SureScan Dx微陣列芯片掃描儀(美國安捷倫科技有限公司,型號(hào):G5791A),Agilent Bioanalyzer 2100(美國安捷倫科技有限公司,型號(hào):2100),qubit3.0定量儀(美國Thermo,型號(hào):Qubit 3.0 Nanodrop 2000),PCR擴(kuò)增儀(美國 ABI,型號(hào):7500),腦立體定位儀 (上海玉研儀器有限公司,型號(hào):SA-103-3),熒光倒置顯微鏡(日本 Olympus ,型號(hào):IX73)。

1.2 基因芯片分析

1.2.1病例資料 收集2018年11月—2019年3月就診于包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院癲癇門診和病房以及包頭市中心醫(yī)院癲癇門診的癲癇患者。納入標(biāo)準(zhǔn):符合2017年國際抗癲癇聯(lián)盟癲癇發(fā)作和癲癇新分類標(biāo)準(zhǔn)[6]。排除標(biāo)準(zhǔn):① 神經(jīng)學(xué)檢查或頭顱磁共振發(fā)現(xiàn)顱腦腫瘤、血管損傷或畸形以及癲癇發(fā)作相關(guān)的腦軟化灶;② 由頭顱外傷、產(chǎn)傷或感染引發(fā)的癲癇; ③ 患有精神系統(tǒng)疾病、其它神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性或發(fā)作性疾病或存在明顯的智力障礙; ④ 3代家屬內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在明確的癲癇病史。按照病例組年齡、性別匹配包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢健康人群作為健康對照組。該研究已通過包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有研究對象在抽血前均簽署知情同意書。

1.2.2基因芯片測序 EDTA管收集受試者外周肘靜脈血4 ml,依據(jù)Ficoll密度梯度離心法使用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),按照TRIzol試劑盒說明書提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取樣品的總RNA,并利用NanoDrop ND-2000定量檢測純度及濃度,使用qubit3.0熒光定量儀測定庫濃度,應(yīng)用Agilent Bioanalyzer 2100對RNA片段的大小進(jìn)行精確測定和濃度定量,使用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)軟件檢測總RNA的完整性,選取高質(zhì)量的RNA樣品用于后續(xù)芯片分析。應(yīng)用人circRNA芯片鑒定差異性表達(dá)的circRNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行標(biāo)記和擴(kuò)增。隨后使用熒光染料 Cyanine-3-CTP(Cy3) 進(jìn)行標(biāo)記,利用Agilent Scanner掃描得到原始圖像。采用Feature Extraction軟件(version12.0.3.1, Agilent Technologies)處理原始圖像、提取原始數(shù)據(jù);利用Genespring軟件(version14.8, Agilent Technologies)進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化和后續(xù)處理;使用火山圖可視化兩組之間的差異circRNA,并進(jìn)行分層聚類以顯示樣品之間可區(qū)分的circRNA表達(dá)模式。本部分由北京閱微基因技術(shù)有限公司完成。

1.3 生物信息學(xué)分析使用circPrimer生信軟件[7](www.bio-inf.cn/circPrimer)分析circ_0017178的組成及可能結(jié)合的腺苷酸N6位(N6-methyladenosine,m6A)的甲基化修飾位點(diǎn)、核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internalribosome entrysite, IRES )和開放閱讀框架(open reading frame,ORF)結(jié)合位點(diǎn);使用circMir生物信息學(xué)軟件(www.bio-inf.cn/circmir)自帶的miRANDA工具和RNAhybird工具分別預(yù)測circ_0017178可能結(jié)合的miRNA,結(jié)果取交集得到的miRNA為circ_0017178可能結(jié)合的miRNA;使用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_80/)生物信息學(xué)網(wǎng)站,將circMir所得的miRNA與癲癇基因可能結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測,預(yù)測結(jié)果以CWCS(cumulative weighted context++ score)評(píng)分分?jǐn)?shù)進(jìn)行評(píng)估,以CWCS分?jǐn)?shù)<-0.1為最低的要求標(biāo)準(zhǔn),使用Cytoscape構(gòu)建circ_0017178相關(guān)miRNA及相關(guān)癲癇基因生物信息網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 30只C57BL/6雄性成年小鼠(下文簡稱小鼠),周齡為12～13周,中位年齡12.5周,平均體質(zhì)量為30～35 g,飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±2)℃,濕度 50%～60%,光照暗室循環(huán) 12 h,自由食水,并且在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前1周適應(yīng)所生活的環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)所涉及到關(guān)于動(dòng)物的使用和護(hù)理都符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)規(guī)定,并獲得了動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理學(xué)批號(hào):包醫(yī)倫審動(dòng)物2021第031號(hào))。將小鼠隨機(jī)分為3組:對照組、空載體腺病毒組(下文簡稱空載體組)、circ_0017178過表達(dá)腺病毒組(下文簡稱過表達(dá)組),每組10只。

1.4.2構(gòu)建腺病毒載體并進(jìn)行qRT-PCR檢測 Circ_0017178過表達(dá)的質(zhì)粒由由華大基因公司構(gòu)建,腺病毒載體由漢恒生物公司根據(jù)腺病毒操作手冊說明書進(jìn)行構(gòu)建。9只小鼠用來檢測腺病毒載體的表達(dá),隨機(jī)分為對照組、空載體組、過表達(dá)組3只/組,分別向各組小鼠海馬內(nèi)注射生理鹽水、空載體病毒載體、過表達(dá)腺病毒載體。1周后使用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測小鼠海馬組織circ_0017178表達(dá):參照TRIzol試劑說明書操作提取海馬組織總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄,按照上面的反應(yīng)體系進(jìn)行cDNA的合成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增,根據(jù)循環(huán)數(shù)閾值(cycle threshold,CT)值的結(jié)果,采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)水平,引物序列見表1。

表1 qRT-PCR擴(kuò)增引物序列表

1.4.3顱內(nèi)立體注射轉(zhuǎn)染腺病毒載體 腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉麻醉1.4.1和1.4.2項(xiàng)的小鼠,使用前囟進(jìn)行顱骨標(biāo)志法定位:前囟和后囟處于水平,之間的間距大約0～0.1 mm,以前囟出為“0點(diǎn)”,前囟向嘴側(cè)的方向?yàn)椤?”,向尾側(cè)的方向?yàn)椤?”。使用腦立體定位儀固定小鼠頭部,剪去頭部毛發(fā)后消毒,沿矢狀縫切開3 cm的創(chuàng)口,緩慢分離皮下的相關(guān)組織,暴露小鼠的前囟、人字縫及矢狀縫。將金屬定位針置于矢狀縫上方,定位針前囟確定標(biāo)準(zhǔn)中線后在前囟后方2 mm,矢狀縫旁開2.5 mm處定位,即為海馬平面所在位置。鉆孔針顱骨鉆孔后于下降2 mm處對雙側(cè)海馬各注射1 μl的腺病毒液體,對照組注射等量的生理鹽水。縫合皮下組織和頭皮,對齊組織,用酒精對創(chuàng)口消毒。染毒后恢復(fù)1周,將1.4.2小鼠進(jìn)行qRT-PCR檢測circ_0017178的表達(dá)驗(yàn)證腺病毒構(gòu)建情況,將1.4.1項(xiàng)小鼠用來構(gòu)建戊四唑癲癇模型及檢測海馬組織細(xì)胞凋亡的情況。

1.4.4構(gòu)建戊四氮癲癇小鼠模型 用0.9%生理鹽水溶液將戊四氮配成100 mg/ml,每天上午9時(shí)到12時(shí)按照35 mg/kg對1.4.1項(xiàng)小鼠經(jīng)腹腔給予戊四唑(pentylenetetrazole, PTZ)注射,持續(xù)21 d,每次注射完P(guān)TZ 后0.5 h內(nèi)記錄小鼠行為變化,按照癲癇發(fā)作程度的Racine評(píng)分[8]評(píng)估,具體的動(dòng)物行為學(xué)觀察內(nèi)容包括:① 潛伏期:首次達(dá)到Racine 4級(jí)及以上的天數(shù);② 發(fā)作頻率:每次注射PTZ后癲癇小鼠的發(fā)作次數(shù);③ 發(fā)作時(shí)間:每次注射PTZ后癲癇小鼠的發(fā)作時(shí)間。

1.4.5Tunel染色法檢測海馬組織細(xì)胞凋亡情況 腹腔注射50 mg/kg苯巴比妥鈉麻醉1.4.1項(xiàng)分組小鼠,安樂死后提取海馬組織制備切片。按照Tunel細(xì)胞凋亡檢驗(yàn)試劑盒說明書對海馬組織切片進(jìn)行Tunel染色,使用熒光顯微鏡對樣本的海馬組織CA1區(qū)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測分析計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理芯片數(shù)據(jù)利用差異倍數(shù)及t檢驗(yàn)的P值進(jìn)行差異circRNA的篩選:上調(diào)或者下調(diào)差異倍數(shù)≥2.0 且P值<0.05為有生物學(xué)重復(fù)性,上調(diào)或者下調(diào)差異倍數(shù)<2無生物學(xué)重復(fù)性;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)正態(tài)分布計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,不符合正態(tài)分布或方差不齊數(shù)據(jù)采用M(P25,P75)來表示;采用Levene 檢驗(yàn)方差齊性,方差齊則使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較;數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊時(shí)使用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較;計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間的比較。分別使用SPSS 25.0、GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和做統(tǒng)計(jì)圖,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例臨床一般資料本研究納入癲癇組(EP)和正常對照組(NC)受試者各3例,3組受試者按照病例組的年齡、性別匹配選出,一般臨床資料見表2。

表2 病例臨床一般資料

2.2 基因芯片分析結(jié)果

2.2.1總RNA質(zhì)量 經(jīng)qubit3.0定量儀檢測兩組總RNA的純度和濃度,按照質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn),A260/A280比值1.8～2.1則符合circRNA芯片實(shí)驗(yàn)要求;Agilent2100生物分析RIN≥7則樣品RNA完整性良好。該研究癲癇組和對照組所有樣本RNA 質(zhì)量符合后續(xù)circRNA芯片實(shí)驗(yàn)的要求,見表3。

表3 癲癇組和對照組的總RNA質(zhì)檢結(jié)果

2.2.2circRNA表達(dá)譜分析結(jié)果 circRNA在癲癇組和對照組中表達(dá)倍數(shù)變化及統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著程度以火

山圖呈現(xiàn)(圖1A),根據(jù)circRNA表達(dá)水平的不同,經(jīng)過圖像采集和數(shù)據(jù)分析后篩選得差異circRNA(圖1B)。與健康對照組對比,癲癇組差異性表達(dá)的circRNA 共21 988條,上調(diào)的circRNA 11 488條,下調(diào)的共10 500條;上調(diào)的circRNA中有6條(circ_0069272、circ_0073442、circ_0033065、circ_0033063、circ_0017178、circ_0049415)有生物學(xué)重復(fù)性(表4);下調(diào)的circRNA中有3條(circ_0083773、circ_0088262、circ_0016396)有生物學(xué)重復(fù)性(表5); 9條有生物學(xué)重復(fù)性的環(huán)狀RNA中, circ_0017178的來源基因CHRM3與癲癇易感性有關(guān)。因此,接下來對circ_0017178進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對circ_0017178與癲癇的關(guān)系展開研究。

圖1 癲癇組和對照組環(huán)狀RNA差異倍數(shù)火山圖和RNA聚類圖

表4 癲癇組與對照組相比顯著上調(diào)的6條差異circRNA

表5 癲癇組與對照組相比顯著下調(diào)的3條差異circRNA

2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.3.1CircPrimer生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果 如圖2所示,circ_0017178是CHRM3基因的表達(dá)產(chǎn)物,由CHRM3的外顯子exon8聚合形成的外顯子型環(huán)狀RNA,含有127個(gè)堿基序列。使用“DEACH”功能發(fā)現(xiàn)circ_0017178可能結(jié)合的m6A甲基化位點(diǎn)一共有3個(gè)(表6),使用“高度匹配”功能發(fā)現(xiàn)circ_0017178可能結(jié)合的m6A甲基化位點(diǎn)為1個(gè),位置位于27號(hào)位點(diǎn),同時(shí),circ_0017178具備1個(gè)ORF1和IRES的潛在結(jié)合位點(diǎn)。

圖2 CircPrimer對circ_0017178的生物信息學(xué)分析圖

表6 ORF與m6A結(jié)合位點(diǎn)信息

2.3.2CircMir生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果 circMir生物信息學(xué)軟件分析circ_0017178可能結(jié)合的miRNA顯示circ_0017178可能結(jié)合51個(gè)miRNA,RNAhybird工具分析顯示circ_0017178可能結(jié)合299個(gè)miRNA,取交集共有26個(gè)miRNA。分別為:miR-363-5pmiR-3681-5p、miR-4298、miR-433-3p、miR-4433b-3p、miR-4436b-3p、miR-4475、miR-4651、miR-4740-3p、miR-4776-5p、miR-4786-5p、miR-4800-5p、miR-584-3p、miR-656-5p、miR-665、miR-6735-5p、miR-6736-3p、miR-6782-5p、miR-6847-5p、miR-6879-5p、miR-8071、miR-877-5p、miR-4632-5p、miR-6738-5p、miR-184、miR-4726-5p。見圖3。

圖3 CircMir對circ_0017178的生物信息學(xué)分析結(jié)果圖

2.3.3TargetScan生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測 將26個(gè)miRNA與癲癇相關(guān)基因運(yùn)用TargetScan,將取得的結(jié)果以CWCS<-0.1分為條件, 6個(gè)miRNA (miR-4632-5p、miR-6738-5p、miR-184、miR-4726-5p、miR-877-5p、miR-433-3p) 沒有找到符合條件的癲癇基因,另外20個(gè)miRNA可以交互匹配到39個(gè)癲癇基因,共96條路線參與構(gòu)成生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)。見圖4。

圖4 生物信息學(xué)預(yù)測得到的circ_0017178調(diào)控癲癇基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 Circ_0017178對癲癇小鼠的影響

2.4.1qRT-PCR法檢測circ_001718過表達(dá)腺病毒載體水平 1.4.2小鼠在對照組和空載體組中,未檢測出circ_0017178的表達(dá);在circ_0017178過表達(dá)組海馬組織中,內(nèi)參平均CT值為16.43,circ_0017178的平均CT值為24.54,表明circ_001718腺病毒載體構(gòu)建成功。

2.4.2Circ_0017178對癲癇小鼠生物行為學(xué)變化的影響 1.4.1小鼠構(gòu)建PTZ癲癇模型過程中,對照組小鼠死亡1只,9只小鼠成功構(gòu)建PTZ癲癇模型;空載體組C57BL/6小鼠死亡2只,8只小鼠成功構(gòu)建PTZ癲癇模型;過表達(dá)circ_0017178組C57BL/6小鼠死亡2只,8只小鼠成功構(gòu)建PTZ癲癇模型。三組小鼠的潛伏期、發(fā)作時(shí)間、發(fā)作次數(shù)均符合計(jì)量資料正態(tài)分布,且方差齊(P>0.05)。與對照組及空載體組相比,circ_0017178過表達(dá)組癲癇的潛伏期明顯縮短(t=12.78、13.39,均P<0.05)、發(fā)作時(shí)間明顯延長(t=12.86、10.88, 均P<0.05)、發(fā)作次數(shù)明顯增加(t=8.92、6.79,均P<0.05);空載體組及對照組間無差異。結(jié)果見圖5。

圖5 各組癲癇小鼠動(dòng)物行為學(xué)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析圖

2.4.3Circ_0017178對癲癇小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的影響 在1.4.1中對照組、空載體組、過表達(dá)組三組癲癇小鼠海馬CA1區(qū)中可見紅色熒光信號(hào)(紅光代表細(xì)胞凋亡),相比于對照組和空載體組,過表達(dá)組海馬組織CA1區(qū)熒光信號(hào)更強(qiáng)。見圖6A。采取圖像分析計(jì)數(shù),卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示空載體組和對照組之間細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.66,P>0.05),過表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組和空載體組(χ2=49.38、41.11,均P<0.05)。見圖6B。表明,相比于空載體組和對照組,Circ_0017178過表達(dá)組海馬組織CA1區(qū)細(xì)胞凋亡更嚴(yán)重。

圖6 Tunel染色細(xì)胞凋亡結(jié)果

3 討論

CircRNA在疾病中的功能是結(jié)合miRNA以“分子海綿”發(fā)揮作用,此外,還具備吸附蛋白 、調(diào)控其它基因轉(zhuǎn)錄 、干擾其它基因剪接 、翻譯多肽、作為生物學(xué)標(biāo)記物等多種功能[9],目前circRNA在癲癇中的研究很少。本研究結(jié)果表明circ_0017178與癲癇密切相關(guān)。

circRNA發(fā)揮功能與其來源的位置密不可分,circRNA根據(jù)其來源分為外含子circRNA、內(nèi)顯子circRNA以及外含子-內(nèi)顯子混合的circRNA。外顯子circRNA在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定表達(dá),可以與miRNA或RNA結(jié)合蛋白相互作用,甚至包繞具備翻譯起始密碼子的區(qū)域,可能在基因表達(dá)和翻譯中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[10]。相比之下,內(nèi)顯子circRNA更多位于細(xì)胞核中,受其他因素干擾較小,表達(dá)穩(wěn)定[11]。外顯子-內(nèi)含子circRNA同時(shí)具有外顯子和內(nèi)含子circRNA特征。本研究通過circPrimer生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)circ_0017178為外顯子型circRNA,其可能具備“分子海綿”的功能結(jié)合miRNA調(diào)節(jié)癲癇基因的表達(dá)在癲癇中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示circ_0017178可能結(jié)合的miRNA共有26個(gè),運(yùn)用TargetScan匹配發(fā)現(xiàn)其中20個(gè)miRNA匹配到39個(gè)癲癇基因,共96條ceRNA通路。

本研究顯示circ_0017178在結(jié)構(gòu)上不僅具備m6A甲基化的位點(diǎn),還具備與ORF1、IRES結(jié)合的位點(diǎn)。研究[12]表明m6A修飾會(huì)影響circRNA的發(fā)生、翻譯、降解和細(xì)胞定位,在circRNA的代謝過程中起到生理或病理生理調(diào)節(jié)作用。m6A可能促進(jìn)circRNA的翻譯能力[13]。IRES、ORF和m6A修飾三個(gè)基本元素賦予circRNA 編碼蛋白質(zhì)的獨(dú)特能力,從而具備翻譯的潛力[12]。因此circ_0017178的 具備的m6A結(jié)合位點(diǎn)可能通過表觀遺傳學(xué)在癲癇中發(fā)揮作用,circ_0017178甚至還具備翻譯的潛能。

研究表明[14]circRNA可能通過影響神經(jīng)元凋亡過程從而對癲癇產(chǎn)生影響。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序性的死亡,受到嚴(yán)格的程序性生物控制。細(xì)胞凋亡有利于維持多細(xì)胞生物組織和器官的完整性和平衡性,使機(jī)體更容易適應(yīng)體內(nèi)不斷變化的環(huán)境,對生物具有特殊的意義[15]。本研究癲癇小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circ_0017178過表達(dá)后可以更加快速地誘發(fā)癲癇發(fā)作,以及加重癲癇的嚴(yán)重程度,同時(shí)利用Tunel染色觀察到過表達(dá)circ_0017178后加劇了癲癇小鼠海馬組織的凋亡程度,這表明circ_0017178可能通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡參與癲癇的發(fā)生和發(fā)展。

本研究亦存在不足,如僅運(yùn)用PTZ癲癇模型進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),僅運(yùn)用Tunel染色驗(yàn)證細(xì)胞凋亡,因此在后期實(shí)驗(yàn)中將設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建其他癲癇模型進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn),同時(shí)用檢測Capase-3、死亡受體等方式多維度對細(xì)胞凋亡進(jìn)行研究;生物信息學(xué)方面,將進(jìn)一步探究circRNA-miRNA-mRNA的相互關(guān)系。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和circ RNA 研究的不斷深入,未來將更深刻的了解circRNA與癲癇的關(guān)系,為癲癇防治提供新的方法,為治療策略及新藥研發(fā)開辟新的切入點(diǎn)。