周雪冰, 林千千, 李艷春

（吉林大學第一醫(yī)院小兒呼吸科，吉林 長春 130021）

近年來，呼吸道病毒引起機體炎癥因子風暴的機制成為研究熱點。研究［1］顯示：非典型肺炎病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）、中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（respiratory syndrome coronavirus in the Middle East，MERS-CoV）、SARS-CoV2 和甲型流感病毒H1N1 等呼吸道病毒具有傳染性強和高致病性等特點，可導致重癥呼吸道感染，嚴重者會產生呼吸衰竭，其病情進展與病毒和機體免疫系統(tǒng)相互作用后所致的過度炎癥性免疫反應誘發(fā)細胞因子風暴有關。因此，通過調節(jié)免疫反應輔助治療呼吸道感染，特別是預防病情進展方面的研究受到廣泛關注。

細胞因子風暴涉及多種炎癥因子，如白細胞介素6 （interleukin-6， IL-6）、 腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、單核細胞趨化因子1（monocyte chemoattractic facter-1，MCP-1）、巨噬細胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein）-1α 和MIP-1β 等。聚巖藻多糖是一類主要由L-巖藻糖和硫酸酯基團構成的多糖，主要來源于褐藻和海洋無脊椎生物，其生物活性與多糖的相對分子質量及化學結構有密切關聯(lián)［2-3］。研究［4］顯示：聚巖藻多糖具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌、免疫調節(jié)、降血糖和降血脂等多種生物活性，在醫(yī)藥領域有較大的應用潛力。不同的原料及提取分離純化的方法對其結構均有一定影響，進而影響其生物活性。巨噬細胞是來源于造血系統(tǒng)的免疫細胞，在維持組織穩(wěn)態(tài)和炎癥反應中起關鍵作用，可執(zhí)行必要的組織特異性功能并保護機體免受感染［5］。關于聚巖藻多糖對巨噬細胞分泌炎癥因子IL-6 和TNF-α 及趨化因子的影響尚未完全闡明。本研究以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 刺激的RAW264.7 細胞為體外模型，探討聚巖藻多糖對巨噬細胞分泌炎癥因子IL-6 和TNF-α 及趨化因子MCP-1、MIP-1α 和MIP-1β 的影響，并闡明其免疫調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器小鼠RAW264.7 細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。LPS 購自美國Sigma 公司， 10% 胎牛血清和DEME 培養(yǎng)基購于美國Gibco 公司，聚巖藻多糖由吉林省中科晶恒醫(yī)藥科技有限責任公司李帆博士自山東明月海藻集團購置原料后加工、制備并贈予，IL-6、TNF-α、MCP-1 和MIP-1β 等酶聯(lián)免疫吸附試 驗 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒購自美國Cloud-Clone Crop 公司，MIP-1α ELISA 試劑盒購自美國Bio-techne 公司。Epoch 2 酶標儀購自美國Bio-Tek 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組RAW264.7 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。將RAW264.7 細胞分為對照組（DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)）、LPS 組（給予400 μg·L－1LPS） 和LPS+聚巖藻多糖組（給予400 μ g·L―1LPS 和100 mg·L－1聚巖藻多糖）。

1.3 CCK-8 法檢測各組RAW264.7 細胞存活率取對數(shù)生長期RAW264.7 細胞，以每孔1×106個細胞的密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，每組6 個復孔，并設計調零孔。于培養(yǎng)12~16 h 后于待測孔中加入10 μL CCK-8 試劑，混勻后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。去除孔內氣泡，采用酶標儀于波長450 nm 處測定各孔吸光度（A）值，計算各組細胞存活率。細胞存活率=（實驗組A 值－空白組A值）/（對照組A值－空白組A值）×100%。

1.4 ELISA 法檢測各組RAW264.7 細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子水平取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞，以每孔1×106個細胞的密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，待細胞貼壁后棄去上清液，分別加入400 μg·L－1LPS 或100 mg·L－1聚巖藻多糖單獨或聯(lián)合孵化16 h，離心后收集上清液，采用ELISA 法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中IL-6、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β 和TNF-α 水平，單位均為ng·L－1。以上操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組細胞存活率和各組細胞培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α、MCP-1、MIP-1α 及MIP-1β 水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用Turkey 檢驗法。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組RAW264.7 細胞存活率與對照組比較，LPS 組和LPS+聚巖藻多糖組細胞存活率均明顯升高（P<0.01）。與LPS 組比較，LPS+聚巖藻多糖組細胞存活率明顯降低（P<0.01）。見圖1。

圖1 各組細胞存活率Fig. 1 Survival rates of cells in various groups

2.2 各組RAW264.7 細胞培養(yǎng)上清中IL-6 和TNF-α 水平與對照組比較，LPS 組和LPS+聚巖藻多糖組細胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α 水平均明顯升高（P<0.01）。與LPS 組比較，LPS+聚巖藻多糖組細胞培養(yǎng)上清中IL-6 和TNF-α 水平均明顯降低（P<0.01）。見圖2。

圖2 各組細胞培養(yǎng)上清中IL-6（A）和TNF-α（B）水平Fig. 2 Levels of IL-6(A) and TNF-α(B) in culture supernatant of cells in various groups

2.3 各組RAW264.7 細胞培養(yǎng)上清中MCP-1、MIP-1α 和MIP-1β 水平與對照組比較，LPS 組和LPS+聚巖藻多糖組細胞培養(yǎng)上清中MCP-1、MIP-1α 和MIP-1β 水平均明顯升高（P<0.01）。與LPS 組比較，LPS+聚巖藻多糖組細胞培養(yǎng)上清中MCP-1、MIP-1α 和MIP-1β 水平均明顯降低（P<0.01）。見圖3。

圖3 各組細胞培養(yǎng)上清中MCP-1（A）、MIP-1α（B）和MIP-1β（C）水平Fig. 3 Levels of MCP-1(A), MIP-1α(B), and MIP-1β(C) in culture supernatant of cells in various groups

3 討 論

細胞因子風暴是一種全身系統(tǒng)炎癥反應，與傳染性和非傳染性疾病有關，可由感染和藥物等多種因素誘發(fā)，是阻礙重癥呼吸道病毒感染恢復并導致其進展為急性呼吸窘迫綜合征和多器官衰竭乃至死亡的關鍵因素［6-8］。IL-6 和TNF-α 是細胞因子風暴中重要的細胞因子，聚巖藻多糖對IL-6 和TNF-α分泌的影響目前尚未完全闡明。由褐藻裙帶菜中純化的褐藻糖膠可促進人類中性粒細胞和自然殺傷細胞（natural killer cell，NK） 的活化及促炎細胞因子IL-6、IL-8 和TNF-α 產生，并延遲其自發(fā)凋亡［9-10］。但體外細胞系和動物模型的體內實驗［6］均證實聚巖藻多糖可減少IL-6 和TNF-α 的分泌，減輕炎癥反應。研究［11-12］顯示：由褐藻中純化的多糖可降低LPS 刺激后的RAW264.7細胞系分泌IL-6和TNF-α，多糖可能通過下調核因子κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB） 和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 信號通路而發(fā)揮作用。

趨化因子是一類結構相似和具有趨化功能的小分子細胞因子，組織損傷時趨化因子表達增加，大部分趨化因子被認為是促炎因子［13］。促炎趨化因子的釋放導致中性粒細胞、單核細胞/巨噬細胞和淋巴細胞等免疫系統(tǒng)細胞聚集到感染部位，而微環(huán)境中細胞浸潤的類型和豐度對細胞因子風暴反饋回路的發(fā)展至關重要［14-16］。MCP-1、MIP-1α 和MIP-1β均為趨化因子CC 家族成員。研究［17］顯示：與健康對照組比較，新型冠狀病毒感染（Corona Virus Disease 2019，COVID-19） 患者血清中MCP-1、MIP-1α 和MIP-1β 水平升高， 且入住ICU 后COVID-19 患者具有更高水平的MCP-1 和MIP-1α。研究［18］顯示：與對照組比較，COVID-19 患者支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）樣本中MCP-1、MIP-1α 和MIP-1β 水平明顯升高，同時還觀察到MCP-1 受體CCR2 和MIP-1α 受體CCR5 等趨化因子受體的轉錄增加。MIP-1α 和MIP-1β 水平的變化還與肺部其他疾病有關聯(lián)，矽肺患者血清中MIP-1α 和MIP-1β 水平較正常健康者升高，重癥肺炎患者和多發(fā)傷所致急性呼吸窘迫綜合征并發(fā)肺部感染患者血清中MIP-1α 水平均升高，且與疾病嚴重程度有關聯(lián)［19-21］。

目前關于聚巖藻多糖對趨化因子MCP-1、MIP-1α 和MIP-1β 影響的研究較少。研究者［22］通過構建放射性肺損傷的小鼠模型，采用聚巖藻多糖干預發(fā)現(xiàn)聚巖藻多糖可降低小鼠胸水中MCP-1 的表達。BUIJSERS 等［23］在實驗性腎小球腎炎小鼠模型中證實聚巖藻多糖能夠降低實驗小鼠血漿中MCP-1 水平。HUWAIT 等［24］在人單核THP-1 巨噬細胞的體外實驗中證實聚巖藻多糖能夠顯著降低MCP-1 的水平。研究［25-27］顯示：從海地瓜和美國海參中提取的聚巖藻多糖能夠有效改善胰島素抵抗小鼠的肝臟炎癥反應，降低MIP-1 水平。本研究應用RAW264.7 小鼠巨噬細胞系在體外實驗中證實，聚巖藻多糖可降低巨噬細胞對趨化因子MCP-1 分泌的影響，且能夠降低巨噬細胞中MIP-1α和MIP-1β趨化因子的分泌。

綜上所述，聚巖藻多糖可降低小鼠巨噬細胞對炎癥因子IL-6、TNF-α、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β分泌的影響，具有減輕細胞因子風暴的潛能，可能成為臨床上調節(jié)重癥肺炎免疫功能的備選物質，為聚巖藻多糖的臨床應用提供實驗依據。