徐艷輝,王圓圓△,郗艷菊,陸 安, 郭云霞*, 郝慶紅,4*

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071001;2.河北省功能性飼料添加劑技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 石家莊 050011;3. 石家莊九五堂生物科技有限公司, 河北 石家莊 050011;4 . 河北省飼用微生物技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 保定 071001)

生物發(fā)酵飼料可降低飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量,產(chǎn)生多種活性益生菌菌體、活性小肽及未知促生長因子等,改善飼料的營養(yǎng)價(jià)值和飼用價(jià)值[1-2]。飼喂發(fā)酵飼料可改善胃腸道發(fā)育與健康,增強(qiáng)機(jī)體的免疫水平,增強(qiáng)動(dòng)物對疾病的抵抗能力[3-4]。瘤胃是反芻動(dòng)物特有的消化器官,營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收與瘤胃的代謝密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道,飼喂發(fā)酵飼料可改善宿主瘤胃微生態(tài)平衡,調(diào)控瘤胃發(fā)酵效率,達(dá)到促生長的目的[5]。張棋煒等[6]通過添加活性酵母菌發(fā)酵飼料,有效改善了瘤胃的發(fā)酵參數(shù)。童殷迪[7]研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵飼料替代花生秧提高了瘤胃中氨態(tài)氮的濃度,提高了黑山羊瘤胃對飼料蛋白的消化利用,并將瘤胃發(fā)酵類型向丙酸型轉(zhuǎn)換,從而提高動(dòng)物對飼料的消化吸收。

瘤胃發(fā)酵體外模擬方法不受試驗(yàn)動(dòng)物的限制,可以在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行研究,被廣泛應(yīng)用于評估飼料的營養(yǎng)價(jià)值, 并在實(shí)踐生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)不同飼料資源的優(yōu)勢互補(bǔ),充分發(fā)揮飼料間的正組合效應(yīng)[8-10]。目前,復(fù)合益生菌發(fā)酵玉米-豆粕型日糧對體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響未見報(bào)道。本研究通過體外瘤胃發(fā)酵技術(shù)對發(fā)酵過程中產(chǎn)氣量和瘤胃發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行測量與計(jì)算,評價(jià)發(fā)酵飼料對綿羊體外瘤胃發(fā)酵的效果,以期為復(fù)合益生菌發(fā)酵料在生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵菌種及飼料

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B-1、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)Y5-39、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)RSG-1保藏于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物醫(yī)藥系。豆粕、麩皮、玉米面購自保定農(nóng)資市場。

1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基:10 g 蛋白胨、5 g 牛肉粉、4 g 酵母粉、20 g 葡萄糖、1 mL 吐溫 80、2 g 磷酸氫二鉀、5 g 乙酸鈉、2 g 檸檬酸三銨、0.2 g 硫酸鎂、0.05 g 硫酸錳、1 000 mL 蒸餾水。NB液體培養(yǎng)基:NaCl 5 g,牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,溶到1 000 mL蒸餾水中。調(diào)pH到 7.2～7.4。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵菌種的制備 將地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌接種至NB液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖床培養(yǎng)24 h。乳酸菌接種至MRS培養(yǎng)基,37 ℃搖床培養(yǎng)48 h。按植物乳桿菌∶枯草芽孢桿菌∶地衣芽孢桿菌=1∶1∶4配制混合菌液。

1.3.2 發(fā)酵飼料的準(zhǔn)備 將玉米、豆粕、麩皮按60%、25%、15%的比例均勻混合后,空白對照組不加菌,試驗(yàn)組加入10%配制混合菌液(1.0×108CFU/mL),調(diào)整水分含量為45%,分裝入發(fā)酵瓶中壓實(shí)密封,避光、室溫發(fā)酵14 d,每組10個(gè)重復(fù)。

1.3.3 人工瘤胃培養(yǎng)液的制備 人工唾液鹽的制備:A液:10 g MnCl2·4H2O、13.2 g CaCl2·2H2O、8 g FeCl3·6H2O、1 g CoCl2·6H2O溶于少量蒸餾水并定容至100 mL;B液:4g NH4HCO3、35 g NaHCO3,加蒸餾水定容至100 mL;C液:5.7 g Na2HPO4、6.2 g KH2PO4、0.6 g MgSO4·7H2O溶于少量蒸餾水并定容至1 000 mL;刃天青溶液:100 mg刃天青溶解于 100 mL蒸餾水中;還原劑:0.16 g NaOH、0.625 g Na2S·9H2O溶于少量蒸餾水并定容至100 mL。瘤胃液采集:河北保定唐縣瑞麗屠宰場采集新鮮屠宰的羊瘤胃液,四層紗布過濾,置于保溫瓶,-20 ℃保存?zhèn)溆?。人工瘤胃培養(yǎng)液制備:瘤胃緩沖液參考李金輝等[9]的方法配制,將保存?zhèn)溆玫牧鑫敢航鈨霾㈩A(yù)熱至39 ℃,再經(jīng)四層紗布過濾,將人工瘤胃緩沖液與瘤胃液按體積比 2∶1混合制成人工瘤胃培養(yǎng)液。

1.3.4 體外發(fā)酵 準(zhǔn)確稱取飼料1.5 g裝入纖維袋,封口、標(biāo)號,放入培養(yǎng)袋中,用硅膠塞密封袋口,開口處使用平面袋真空包裝機(jī)除氧密封。

采用100 mL注射器通過硅膠塞注射口注入200 mL混合瘤胃液,使纖維袋浸于混合瘤胃液中,39 ℃恒溫水浴搖床,搖床頻率為45 r/min,進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

在體外發(fā)酵4 h、8 h、12 h、24 h、48 h時(shí),使用注射器經(jīng)培養(yǎng)袋斜口硅膠塞處抽出氣體并記錄產(chǎn)氣量。待發(fā)酵48 h結(jié)束后,快速將發(fā)酵袋放入冰水浴中冷卻終止發(fā)酵。測定培養(yǎng)液pH,每袋取10 mL人工瘤胃培養(yǎng)液于15 mL離心管中,-20 ℃冷凍保存,備用。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 產(chǎn)氣參數(shù) 將未發(fā)酵和發(fā)酵飼料4 h、8 h、12 h、24 h、48 h時(shí)的產(chǎn)氣量帶入產(chǎn)氣量模型,參考李金輝等[9]的方法計(jì)算產(chǎn)氣參數(shù)。

GP=a+b(1-e-ct)

式中:t:發(fā)酵時(shí)間(h);GP:t 時(shí)產(chǎn)氣量 (mL);a :快速降解部分產(chǎn)氣量(mL);b:慢速降解部分產(chǎn)氣量(mL);c:b 的產(chǎn)氣速率(%/h); a+b :理論總產(chǎn)氣量(mL)。

1.4.2 常規(guī)營養(yǎng)成分 未發(fā)酵飼料和復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料中干物質(zhì)(Dry Matter, DM)、粗蛋白(Crud Protein, CP)參照AOAC[10]的方法進(jìn)行;中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)參照Van Soest等[11]的方法進(jìn)行測定;總能(Globe Energy,GE)采用全自動(dòng)量熱儀測定。

1.4.3 氨態(tài)氮和菌體蛋白 樣品采集后,參考李金輝等[9]的方法靛酚藍(lán)比色法測定氨態(tài)氮,考馬斯亮藍(lán)法測定菌體蛋白(MCP)。

1.4.4 揮發(fā)性脂肪酸測定 參考田旭等[12]、常影等[13]氣相色譜法測定揮發(fā)性脂肪酸,測定參數(shù):載氣N2,溫度220 ℃,進(jìn)樣量1 μL;色譜柱參數(shù):HP-INNOwax 毛細(xì)管色譜柱恒流模式,流量2.0 mL/min,平均線速度38 cm/sec;柱溫箱參數(shù):程序升溫120 ℃(3 min),10 ℃/min,180 ℃(1 min);檢測器參數(shù):H2流量40 mL/min,空氣流量450 mL/min,FID溫度250 ℃。重復(fù)進(jìn)樣,利用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中揮發(fā)酸濃度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵飼料對產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)的影響

由表1可知,與未發(fā)酵飼料組相比,在4 h時(shí)發(fā)酵飼料組略有下降,但差異不顯著(P>0.05)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,8 h后兩組體外產(chǎn)氣量迅速上升,結(jié)果顯示,8 h、12 h、24 h和48 h發(fā)酵飼料均極顯著低于未發(fā)酵飼料組(P<0.01)。從產(chǎn)氣參數(shù)看,發(fā)酵飼料產(chǎn)氣速率極顯著低于未發(fā)酵飼料組(P<0.01),理論總產(chǎn)氣量極顯著低于未發(fā)酵料組(P<0.01)。

表1 復(fù)合益生菌發(fā)酵對產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)的影響Table 1 Effect of compound probiotics fermentation on gas yield and gas production parameters

2.2 發(fā)酵飼料對營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

發(fā)酵原料玉米、麩皮、豆粕中含有豐富氮源,不再單獨(dú)添加氮源。由表2可知,與未發(fā)酵飼料組相比,體外發(fā)酵48 h發(fā)酵飼料組DM含量極顯著下降了12.76%(P<0.01),CP含量極顯著增加了26.61%(P<0.01),而ADF和NDF含量極顯著降低了37.20%和41.86%(P<0.01),GE顯著下降(P<0.05)。

表2 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對營養(yǎng)水平的影響Table 2 Effect of compound probiotics fermented feed on nutrient levels

2.3 發(fā)酵飼料對氨態(tài)氮和MCP的影響

由表3可知,與未發(fā)酵飼料組相比,發(fā)酵飼料組NH3-N含量極顯著增加了22.49%(P<0.01),MCP含量則極顯著降低了12.23%(P<0.01)。

表3 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對NH3-N和MCP的影響Table 3 Effect of compound probiotics fermented feed on NH3-N and MCP

2.4 發(fā)酵飼料對揮發(fā)性脂肪酸和pH的影響

由表4可知,與未發(fā)酵飼料組相比,發(fā)酵飼料組乙酸和丁酸的含量分別顯著下降了42.18%(P<0.05)和30.77%(P<0.01),總揮發(fā)性酸含量極顯著降低了28.18%(P<0.01),乙酸/丙酸比值極顯著下降了52.29%(P<0.01),丙酸含量極顯著增加了30.17% (P<0.01),異戊酸和戊酸含量差異不顯著(P>0.05)。而對于pH,發(fā)酵飼料組顯著低于未發(fā)酵飼料組(P<0.05)。

表4 復(fù)合益生菌發(fā)酵對揮發(fā)性脂肪酸和pH的影響Table 4 Effect of compound probiotics fermentation on volatile fatty acids and pH

3 討 論

3.1 發(fā)酵飼料對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

產(chǎn)氣量可以反映進(jìn)入瘤胃有機(jī)物的消解率,這與瘤胃微生物活動(dòng)及飼料中可消化養(yǎng)分的含量有關(guān)。一般認(rèn)為,瘤胃中飼料可發(fā)酵程度越高,微生物增殖越迅速,產(chǎn)氣量越多。瘤胃中氣體主要是由微生物降解碳水化合物和蛋白質(zhì)產(chǎn)生的,瘤胃微生物在發(fā)酵飼料的過程中產(chǎn)生大量二氧化碳、甲烷和氨,還有少量的氫氣及其它氣體,其中氫氣和甲烷在瘤胃中很難被吸收[14]。楊帆等[15]證實(shí),發(fā)酵后的面包渣和噴漿玉米皮可顯著降低瘤胃的總產(chǎn)氣量,其中發(fā)酵面包渣48 h甲烷產(chǎn)氣量顯著降低。Kim等[16]研究發(fā)現(xiàn),直接添加乙酸菌可降低反芻動(dòng)物甲烷產(chǎn)量。瘤胃前期產(chǎn)氣速率較快,12 h后趨于平緩,可能因?yàn)槲⑸锘钚允芰鑫傅胶庥绊?前期營養(yǎng)物質(zhì)充足,微生物可以進(jìn)行生長發(fā)育和繁殖,后期營養(yǎng)物質(zhì)減少,微生物活動(dòng)受限。本試驗(yàn)中,發(fā)酵飼料組的瘤胃產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)低于未發(fā)酵飼料組,可能由于其中的益生菌抑制了瘤胃中甲烷菌的生長,減少了瘤胃中甲烷氣體的產(chǎn)生,也可能是由于發(fā)酵飼料中酸溶蛋白增加,NDF和ADF含量下降,使得飼料中可降解利用的物質(zhì)減少,從而引起產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)的降低。

3.2 發(fā)酵飼料對瘤胃pH和VFA的影響

pH作為直接反映瘤胃發(fā)酵狀態(tài)的重要參數(shù),可以衡量內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。白天天等[17]發(fā)現(xiàn),pH的改變可影響瘤胃微生物對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,瘤胃液pH的波動(dòng)范圍為5.5～7.5。本試驗(yàn)中,瘤胃pH(6.40～6.48)均在瘤胃發(fā)酵的正常范圍內(nèi),與戶林其等[18]結(jié)果一致,與發(fā)酵飼料中含有有機(jī)酸和益生菌,可促進(jìn)飼料中營養(yǎng)物質(zhì)消化,增加VFA含量結(jié)果一致。VFA中丙酸是葡萄糖合成的前體物質(zhì),而乙酸是合成乳脂的主要成分。本試驗(yàn)乙酸/丙酸值在0.39～1.26,屬于丙酸型發(fā)酵。試驗(yàn)結(jié)果顯示,益生菌發(fā)酵飼料可以提高丙酸、TVFA的含量,與李月明等[19]研究發(fā)現(xiàn)益生菌發(fā)酵料中的枯草芽孢桿菌可提高體外發(fā)酵瘤胃液TVFA含量的結(jié)果一致。

3.3 發(fā)酵飼料對營養(yǎng)成分的影響

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),發(fā)酵飼料在瘤胃體外發(fā)酵48 h可顯著促進(jìn)NDF和ADF的降解,這可能與發(fā)酵飼料中使用的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的功能有關(guān)。據(jù)韓林等[20]報(bào)道,飼料中添加枯草芽孢桿菌能夠促進(jìn)瘤胃纖維降解菌的增殖,進(jìn)而增強(qiáng)纖維素酶的活性。本試驗(yàn)中,發(fā)酵飼料組粗蛋白含量顯著高于未發(fā)酵飼料組,這可能是由于發(fā)酵飼料中的小分子物質(zhì)更易被瘤胃微生物吸收利用,促進(jìn)了微生物的增殖,使得總蛋白的含量增加。張昕禹等[21]研究發(fā)現(xiàn),20%發(fā)酵玉米蛋白粉替代豆粕體外發(fā)酵48 h可顯著增加干物質(zhì)的降解率。發(fā)酵飼料組的粗蛋白含量和總能增長速率顯著高于未發(fā)酵飼料組,說明經(jīng)微生物發(fā)酵后的飼料更有利于被瘤胃內(nèi)微生物充分利用,提高飼料消化率。

3.4 發(fā)酵飼料對瘤胃菌體蛋白和氨態(tài)氮的影響

NH3-N濃度主要取決于瘤胃對飼料中氮的降解率和吸收率[22]。本試驗(yàn)中,體外發(fā)酵48 h發(fā)酵飼料組氨態(tài)氮含量顯著高于未發(fā)酵飼料組,同時(shí)菌體蛋白的含量顯著低于未發(fā)酵飼料組,表明發(fā)酵飼料中氮的降解率大于吸收率。推測可能是發(fā)酵飼料所用微生物菌種可分泌蛋白水解酶,這些水解酶系可將飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子如抗原蛋白、植酸、蛋白酶抑制因子等降解[23-24],提高飼料中小肽和小分子蛋白的含量[25],進(jìn)而促進(jìn)飼料在瘤胃內(nèi)的降解。由于體外瘤胃液與活體中的微生物菌群有所區(qū)別,且短時(shí)間內(nèi)對瘤胃微生物菌群的影響可能不會(huì)太大,導(dǎo)致微生物合成菌體蛋白效率低于NH3-N降解率。

4 結(jié) 論

益生菌發(fā)酵飼料可調(diào)節(jié)瘤胃代謝參數(shù),降低瘤胃產(chǎn)氣量,增加瘤胃中丙酸和總揮發(fā)性酸的含量,降低乙酸/丙酸比例,利于丙酸型發(fā)酵類型的形成,為發(fā)酵飼料在生產(chǎn)上更好地發(fā)揮其飼用價(jià)值提供理論依據(jù)。