張 涵,盧殿杰,莊科勤,徐菁岐,孟雨晴,馬 威,董文龍

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 動物科技學(xué)院,吉林 吉林 132109)

化膿隱秘桿菌又稱化膿放線菌(Corynebacteriumpyogenes),化膿棒狀桿菌(Actinomycespyogenes),于1997年被歸類為隱秘桿菌屬[1]。該菌為革蘭氏陽性菌,主要分布于動物的呼吸道、消化道、泌尿生殖道等部位,可以引起肺炎、胸膜炎等疾病[2-3],同時(shí),化膿隱秘桿菌對人也有一定致病性[4-5]。有關(guān)研究表明,大多數(shù)化膿隱秘桿菌攜帶的毒力基因有溶血素基因(plo)、神經(jīng)氨酸酶基因(nanH與nanP)以及膠原結(jié)合蛋白基因(cpbA)[5]。

獸醫(yī)在臨床治療中長期不合理應(yīng)用抗生素,導(dǎo)致化膿隱秘桿菌耐藥水平不斷提升。相關(guān)研究表明,目前化膿隱秘桿菌對氨基糖苷類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類藥物、四環(huán)素類藥物等產(chǎn)生不同程度的耐藥性,給化膿隱秘桿菌病的臨床治療帶來困難[6-9]。

1 材料和方法

1.1 病料來源

吉林省某豬場一頭患病死母豬肺臟樣品。

1.2 分離培養(yǎng)

將剪刀、手術(shù)刀、接種環(huán)徹底灼燒滅菌后,用剪刀在肺部表面燙出一塊無菌區(qū),用手術(shù)刀切開肺部,接種環(huán)蘸取肺部分泌液,接種于Brain Heart infusion Agar(BHIA)平板上,37 ℃需氧培養(yǎng)36 h后進(jìn)行純化培養(yǎng),至鏡檢細(xì)菌形態(tài)單一后命名為TP11,將單一菌落接種于Brian Heart Infusion(BHI)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h備用。

1.3 16S rRNA基因序列測序

基因組DNA提取:取0.5 mL的過夜菌液,按照北京全式新細(xì)菌基因組DNA純化試劑盒說明書進(jìn)行提取DNA。

PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系為premix Taq 酶12.5 μL,去離子水9.5 μL,上下游引物各1 μL,引物序列為16S rRNA-F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和16S rRNA-R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),模板DNA 1 μL。

反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,53 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

PCR測序:16S rRNA基因組通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,其切膠純化產(chǎn)物送往庫美生物科技有限公司(長春)測序。

1.4 MIC測定

參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)指南,采用瓊脂稀釋法對TP11的MIC值進(jìn)行測定[10]?？股匕t霉素、強(qiáng)力霉素、慶大霉素、克林霉素、氯霉素、四環(huán)素、磺胺甲氧嘧啶、頭孢噻呋、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、阿米卡星、恩諾沙星。選用化膿隱秘桿菌ATCC19411作為質(zhì)控菌株。

1.5 化膿隱秘桿菌全基因組測定

由百邁客生物科技有限公司(Biomarker Technologies)進(jìn)行全基因組測序及分析。

1.5.1 基因組組分分析 采用BluePippin全自動核酸回收系統(tǒng)回收大片段DNA后,使用軟件Guppy v3.2.6、Canuv.1.5、Prodigal v2.6.3、RepeatMasker v4.0.5和Infernal v1.1.3、Genewise v2.2.0分別進(jìn)行測序數(shù)據(jù)質(zhì)控、基因組組裝、編碼基因預(yù)測、重復(fù)序列預(yù)測和rRNA假基因測序的預(yù)測。最后利用軟件circos繪制基因組圈圖。

1.5.2 耐藥基因分析 通過使用BLAST軟件預(yù)測菌株TP11的氨基酸序列,采用Comprehensive Antibiotic Research Database(CARD)數(shù)據(jù)庫提供的Resistance Gene Identifier (RGI)軟件將目標(biāo)物種的氨基酸序列與CARD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對 (RGI內(nèi)置blastp,默認(rèn)evalue≤1e-30),根據(jù)RGI 的比對結(jié)果,統(tǒng)計(jì)注釋到數(shù)據(jù)庫的抗性基因信息,最終得到化膿隱秘桿菌TP11的所有耐藥基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA測序結(jié)果

TP11的測序結(jié)果在Gen Bank數(shù)據(jù)庫中經(jīng)Blast分析,結(jié)果顯示該菌與化膿隱秘桿菌的同源性為99.9%,證實(shí)分離菌株為化膿隱秘桿菌。

2.2 MIC試驗(yàn)測定結(jié)果

MIC試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),化膿隱秘桿菌TP11對紅霉素、強(qiáng)力霉素、克林霉素、四環(huán)素具有多重耐藥性,紅霉素的MIC≥1,強(qiáng)力霉素的MIC≥8,克林霉素和四環(huán)素的MIC≥4,對慶大霉素、氯霉素、磺胺間甲氧嘧啶、頭孢噻呋、環(huán)丙沙星、阿米卡星等敏感(表1)。

2.3 TP11全基因組測序基本信息及全基因組圈圖

TP11全基因組序列的大小為2 374 784 bp,G+C含量為59.36%,分析所得的編碼基因?yàn)? 123個(gè),其編碼基因總長度為2 148 837 bp,平均長度為1 012 bp;重復(fù)序列總長度為5 805 bp,占總基因組的0.24%。rRNA為9個(gè)(其中16S rRNA 3個(gè),5S rRNA 3個(gè),23S rRNA 3個(gè)。

利用組裝和預(yù)測得到的基因組信息,如tRNA、rRNA、重復(fù)序列、G+C含量及基因功能信息等,應(yīng)用軟件Circos v0.66繪制基因組圈圖。Circos可視化基因組,可以更清晰的探索基因組組分間在基因組上的位置關(guān)系。圖1展示了組裝后基因組的圈圖。

表1 TP11的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 TP11 drug sensitivity test results

2.4 耐藥基因比對分析

全基因組測序及序列分析比對分析顯示,TP11攜帶有tet(W)和erm(B) 2種化膿隱秘桿菌典型耐藥基因(表2)。

3 討 論

化膿隱秘桿菌在隱秘桿菌屬具有最強(qiáng)的致病力[11],能夠引起動物的化膿性感染,已經(jīng)成為影響我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)的重要病原微生物。目前,國內(nèi)關(guān)于豬源化膿隱秘桿菌相關(guān)報(bào)道呈上升趨勢,吉林省內(nèi)也相繼出現(xiàn)了豬源化膿隱秘桿菌感染的病例[12],化膿隱秘桿菌病對養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)。

大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物原為最常用的治療化膿隱秘桿菌的藥物之一,但化膿隱秘桿菌攜帶的抗性基因erm(B)介導(dǎo)其對大環(huán)內(nèi)酯類藥物產(chǎn)生耐藥性。Rezanejad等[13]在患有乳房炎的病畜中分離出化膿隱秘桿菌,并通過PCR定性的方法評估推定出其含有大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因erm(B)和erm(X)。相關(guān)研究表明,由于美國對肉用動物的疾病治療首選大環(huán)內(nèi)脂類的藥物,如預(yù)防肝膿腫等[14],導(dǎo)致該地區(qū)所分離出的化膿隱秘桿菌大部分對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥。Jost等[15]在美國分離出的48株化膿隱秘桿菌,結(jié)果顯示其不僅對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物表現(xiàn)出較高的耐藥性,也對林可酰胺類抗菌藥物表現(xiàn)出較高的耐藥性。本次全基因組測序檢測出TP11攜帶抗性基因erm(B),MIC試驗(yàn)結(jié)果也顯示其對大環(huán)內(nèi)酯類藥物出現(xiàn)耐藥的情況。

圖1 TP11的全基因組測序的圈圖Fig. 1 Circle diagram of whole genome sequencing of TP11

表2 耐藥基因檢測結(jié)果Table 2 Drug resistance gene test results

耐藥基因tet(W)是當(dāng)前為止研究較多的四環(huán)素耐藥基因之一,其介導(dǎo)化膿隱秘桿菌對四環(huán)素耐藥。當(dāng)其存在時(shí),會使四環(huán)素類抗菌藥物與細(xì)菌核糖體的結(jié)合能力減弱,進(jìn)而使化膿隱秘桿菌對四環(huán)素類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。Billington等[16]分析發(fā)現(xiàn),豬源臨床化膿隱秘桿菌分離株對四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥情況較為嚴(yán)重,其耐藥表型主要與tet(W)耐藥基因相關(guān)。Iradj等[17]在2018年分離出65株化膿隱秘桿菌,進(jìn)行MIC試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)對四環(huán)素和阿奇霉素有不同程度的耐藥性。Malinowski等[18]對161株分離于奶牛的化膿隱秘桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離株對青霉素、氨芐西林、氯唑西林、頭孢匹林、頭孢哌酮、新霉素、林可霉素等抗生素具有不同程度的耐藥性,其中63.7%的分離株對四環(huán)素具有耐藥性。

本次MIC試驗(yàn)結(jié)果還顯示,化膿隱秘桿菌對克林霉素耐藥,相關(guān)研究表明,抗性基因erm(B)在基因島中可以對林可酰胺類藥物表現(xiàn)出抗性[19]。Kasimanickam等[20]分離出17株化膿隱秘桿菌中有6株有擴(kuò)增子aadA24-ORF1,同時(shí)這些菌株對磺胺嘧啶、桿菌肽、青霉素、克林霉素和紅霉素耐藥。

綜上所述,國內(nèi)外的研究均發(fā)現(xiàn)化膿隱秘桿菌對多種抗菌藥物具有廣泛耐藥性,特別是對四環(huán)素類抗菌藥物和大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥情況比較嚴(yán)重,且耐藥性逐漸增強(qiáng)。需要警惕化膿隱秘桿菌作為耐藥基因的儲備庫傳播給其它臨床常見致病菌或其它臨床常見致病菌作為耐藥基因儲備庫傳播給其它致病菌。

4 結(jié) 論

本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豬源TP11對紅霉素、強(qiáng)力霉素、克林霉素、四環(huán)素等多種抗生素有耐藥性,與測序結(jié)果的耐藥基因型相符,這為治療化膿隱秘桿菌提供了參考。