陳美璇, 黃 霞, 李秉鈞, 榮俊冬, 鄭郁善, 陳禮光

(福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院,福建 福州 350002)

福建柏(Fokieniahodginsii),又名建柏、滇柏,是國(guó)家二級(jí)保護(hù)瀕危植物,主要分布于越南以及中國(guó)西南部、南部至東部,以福建中部最多。始載于《經(jīng)濟(jì)植物手冊(cè)》,據(jù)《中華本草》摘錄福建柏心材含揮發(fā)油,以其心材作藥材基源,具有行氣止痛、降逆止嘔的功效[1]。目前關(guān)于福建柏精油的研究主要集中于葉精油成分及其生物活性,主要采用水蒸氣蒸餾法提取,并利用GC-MS對(duì)其成分進(jìn)行分析,但前人的研究結(jié)果存在較大差異。潘炯光等[2]研究發(fā)現(xiàn)精油得率為0.5%,主要成分為α-蒎烯(24.89%)、檸檬烯(8.46%)、石竹烯氧化物(4.01%);張艷平等[3]研究得出福建柏精油的主要成分為β-橙椒烯(22.514%)、τ-杜松醇(19.883%)、石竹烯(10.133%)、γ-畢澄茄烯(8.307%)和α-杜松醇(5.519%);盧鈺鐸等[4]研究得出精油得率為0.12%,密度為0.736 g/mL,主要成分為α-蒎烯(29.25%)、馬鞭烯醇(10.88%)和石竹烯氧化物(9.64%),精油對(duì)白紋伊蚊和致倦庫(kù)蚊都有很好的毒殺作用,其生物活性與精油中所含的化學(xué)成分α-蒎烯和石竹烯氧化物有關(guān);黃霞等[5]對(duì)福建柏不同部位的精油成分和含量進(jìn)行了分析研究,發(fā)現(xiàn)福建柏葉精油和福建柏心材精油成分存在很大差異?，F(xiàn)如今柏科植物精油早已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、農(nóng)藥等領(lǐng)域,福建柏所產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體具有一定的保健效果,福建柏葉精油雖然已逐漸用于化妝品[6]和滅蚊產(chǎn)品,但其康養(yǎng)效果和生物活性的研究仍具有深入研究的價(jià)值,在社會(huì)市場(chǎng)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用中具有極大潛力。本研究采用超聲波輔助的水蒸氣蒸餾法提取不同種源的福建柏葉精油,通過(guò)GC-MS對(duì)精油的成分進(jìn)行檢測(cè),對(duì)精油的得率、感官性狀、成分及其GC含量進(jìn)行分析比較,探究不同種源福建柏葉精油含量及其成分的差異性和相關(guān)性,篩選出更有應(yīng)用價(jià)值的福建柏種源,以期為福建柏工業(yè)原料林營(yíng)造和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考,為福建柏葉精油開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福建柏(Fokieniahodginsii(Dunn) A. Henry et H. H. Thomas),鮮葉于2020年9月24日采自福建省安溪豐田國(guó)有林場(chǎng),福建柏種源試驗(yàn)林(4年生)。選擇中坡位、生長(zhǎng)良好的標(biāo)準(zhǔn)木5株,將每株葉子分上、中、下3部分,各層取500 g混合后作為精油提取原料。無(wú)水硫酸鈉,分析純;正己烷,色譜純,麥克林生化科技有限公司。

2010QP-PLUS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)儀,日本島津公司;超聲波提取機(jī),濟(jì)寧天華超聲儀器有限公司;0.45 μm的尼龍濾(Nylon)膜,天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;5 mL揮發(fā)油量管。

1.2 原料預(yù)處理和精油提取

新鮮福建柏葉-80 ℃冷凍保存,避免反復(fù)凍融,取出粉碎至粒度基本一致,取100 g放入1 000 mL圓底燒瓶,加入一定量去離子水,超聲波處理一定時(shí)間后,加熱至沸騰,再保持微沸,進(jìn)行水蒸氣蒸餾。收集提取液上層油狀物質(zhì),無(wú)水硫酸鈉干燥。所得淡黃色透明油狀物,低溫4 ℃暗保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 精油提取工藝優(yōu)化

在查閱文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以福建泉州安溪種源福建柏葉為原料,超聲波功率240 W,按1.2節(jié)方法提取精油。通過(guò)單因素試驗(yàn)考察提取時(shí)間(沸騰后開(kāi)始計(jì)時(shí),2、 4、 6、 8、 10 h)、超聲波處理時(shí)間(10、 20、 30、 40、 50 min)、液料比(3∶1、 4∶1、 5∶1、 6∶1、 7∶1,mL∶g,下同)對(duì)福建柏葉精油得率的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件。

1.4 精油成分GC-MS分析

取100 μL的精油溶于1 mL正己烷,過(guò)孔徑為0.45 μm的Nylon膜,進(jìn)行GC-MS成分測(cè)定,利用譜圖庫(kù)自動(dòng)檢索,結(jié)合人工篩選,鑒定出其主要成分,采用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

色譜條件:HP-5MS石英彈性毛細(xì)管柱(30 m×250 μm ×0.25 μm);載氣為超純氦氣;總流速40 mL/min,柱內(nèi)流速1.0 mL/min,進(jìn)樣口溫度250 ℃,進(jìn)樣量1 μL,分流比為50∶1,GC和MS接口溫度270 ℃。升溫程序:柱溫40 ℃保持1 min,以10 ℃/min的速率升溫至100 ℃,再以20 ℃/min升溫至140 ℃并保持2 min,最后以20 ℃/min的速率升溫至250 ℃后,保持3 min。

質(zhì)譜條件:電子轟擊能量70 eV,離子源溫度230 ℃,掃描范圍(m/z)15～500,并采用峰面積歸一化法初步定量。

1.5 得率計(jì)算

運(yùn)用ISO 279—1998(參比法)在20 ℃時(shí)測(cè)定精油相對(duì)密度,以精油得率作為福建柏葉精油產(chǎn)量的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),精油得率(y)計(jì)算公式如下:

y=m1/m0×100%

式中:m0—樣品質(zhì)量,g;m1—精油質(zhì)量,g。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同條件對(duì)精油得率的影響

2.1.1提取時(shí)間 在液料比5∶1、超聲波處理時(shí)間30 min、超聲波功率240 W條件下,提取時(shí)間對(duì)精油得率的影響見(jiàn)圖1(a)。由圖可知,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),福建柏葉精油的得率有所增加,2～6 h增加迅速,6 h后增加變緩,8 h后略有減少?？赡苁且?yàn)榍? h內(nèi)水分未能完全進(jìn)入植物細(xì)胞,精油未能及時(shí)隨蒸汽餾出,蒸餾時(shí)間大于8 h后,幾乎無(wú)精油餾出,蒸汽還可能導(dǎo)致精油部分成分分解或精油隨之揮發(fā)。綜合考慮精油得率、時(shí)間成本、能源消耗,提取時(shí)間以8 h為宜。

a.提取時(shí)間extracting time; b.超聲波處理時(shí)間ultrasonic treatment time; c.液料比ratio of liquid to material圖1 不同條件對(duì)精油得率的影響Fig.1 Effect of different conditions on the yield of essential oil

2.1.2超聲波處理時(shí)間 在液料比5∶1、提取時(shí)間6 h、超聲波功率240 W條件下,超聲波處理時(shí)間對(duì)精油得率的影響見(jiàn)圖1(b)。由圖可知,隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng),精油得率也有所升高,超聲波處理時(shí)間30 min時(shí),得率達(dá)到最高值,隨后緩慢降低。超聲波處理時(shí)間過(guò)短,福建柏葉細(xì)胞壁破裂及胞內(nèi)熱效應(yīng)程度低,精油無(wú)法完全溶出;但超聲波處理時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)使溫度升高,可能導(dǎo)致福建柏葉部分成分揮發(fā),造成精油得率降低[7]。這與盧錕等[8]利用超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取藍(lán)桉葉精油研究結(jié)果相似。故超聲處波處理時(shí)間應(yīng)為30 min。

2.1.3液料比 液料比會(huì)影響液體與物料的接觸,合適的液料比能保持物料與水的接觸,水蒸氣能更好地帶出精油[9]。在提取時(shí)間6 h、超聲處波理時(shí)間30 min、超聲波功率240 W條件下,液料比值對(duì)精油得率的影響見(jiàn)圖1(c)。由圖可知,隨著液料比值增大,精油得率增加;當(dāng)液料比值為4時(shí),精油得率最高;當(dāng)液料比值增大到5時(shí),精油得率降低,但不顯著(P>0.05);隨著液料比值繼續(xù)增大,精油分散在水中濃度會(huì)逐步減小,精油得率持續(xù)降低。故液料比選擇4∶1。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取提取時(shí)間、超聲波處理時(shí)間、液料比這3個(gè)因素,并加入空白列考察試驗(yàn)誤差,采用L9(34)正交試驗(yàn),以精油得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),優(yōu)化得到福建柏葉精油最佳提取工藝,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。由表1中R值分析可知,RC>RA>RB,說(shuō)明影響福建柏葉精油得率各因素的主次順序?yàn)橐毫媳?超聲波處理時(shí)間>提取時(shí)間。最優(yōu)組合為A2B2C1,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該組合下福建柏葉精油的得率為0.252%,與正交試驗(yàn)結(jié)果相近,證明正交優(yōu)化有效。因此,福建柏葉最佳提取工藝為超聲波處理時(shí)間30 min、提取時(shí)間8 h、液料比3.5∶1。

表1 精油提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Orthogonal test design and results for extraction of essential oil

2.3 不同種源福建柏葉精油提取結(jié)果和性狀分析

由表2可以看出,不同種源的福建柏葉精油得率具有顯著差異(P<0.05)。

表2 不同種源福建柏葉精油得率及感官性質(zhì)差異Table 2 Difference of essential oil yield and sensory properties of F. hodginsii leaves from different provenances

即使是同省不同市,如2號(hào)與1、 3號(hào)種源,11號(hào)與福建省其他種源的精油得率均存在顯著差異,甚至同市不同縣也可能存在顯著差異如9和10號(hào)。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在樹(shù)上部(頂部)與下部(靠地面)采摘的葉精油得率相當(dāng),中部精油得率相對(duì)較少但不顯著。不同種源福建柏葉精油的得率存在顯著差異,同省不同市也存在較大差異,精油得率最高的是福建三明大田(0.290%),廣西來(lái)賓金秀精油得率最低(0.153%),精油得率較高者大多精油顏色較淺、澄清、香味較淡,精油得率較低者則反之,這可能是受種源地的不同,精油成分中揮發(fā)性萜類物質(zhì)的含量存在差異,使得精油的氣味和所呈顏色存在差異。

2.4 不同種源福建柏葉精油成分分析結(jié)果

2.4.1GC-MS分析 精油經(jīng)過(guò)GC-MS分析后,通過(guò)譜圖庫(kù)自動(dòng)檢索,進(jìn)一步人工匹配篩選出相似度90%以上,且穩(wěn)定存在的成分,再通過(guò)面積歸一法計(jì)算得到各化學(xué)成分的GC含量。如圖2和表3所示,各種源精油成分相似,主要為倍半烯萜類,但主要成分(GC含量大于1%)GC含量有較大的差異,如在時(shí)間為17.5 min左右分離出的化學(xué)成分刺柏烯醇僅在種源福建泉州安溪、漳州華安、三明大田、龍巖上杭和龍巖長(zhǎng)汀葉精油中大量存在,其余種源未檢出或GC含量遠(yuǎn)低于1%;重慶江津種源精油成分與其他種源也有較明顯差異,(+)-表雙環(huán)倍半水芹烯和α-杜松醇為獨(dú)有的主要成分,β-蓽澄茄烯、β-欖香烯和γ-依蘭油烯的GC含量也高于其他種源,但α-蒎烯、β-蒎烯和β-石竹烯的GC含量遠(yuǎn)低于其他種源,其中α-蒎烯的GC含量?jī)H高于廣西來(lái)賓金秀。

表3 不同種源福建柏葉精油主要成分GC含量Table 3 GC content of the main components of essential oil of F. hodginsii from different provenances %

圖2 CT(a)和GY(b)種源福建柏葉精油的總離子流色譜Fig.2 TIC of F. hodginsii leaf essential oils from provenances of CT(a) and GY(b)

2.4.2主成分分析 不同種源福建柏葉精油成分的方差分解和載荷矩陣結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 福建柏葉精油成分指標(biāo)的主成分分析Table 4 Principal components analysis of essential oil components indexes in the leaves of F. hodginsii

由表4可知,葉精油成分可分為5個(gè)主成分,載荷解釋原有變量貢獻(xiàn)率達(dá)88.613%。第一主成分貢獻(xiàn)率為29.032%,其中貢獻(xiàn)較大的是α-杜松醇、γ-依蘭油烯、β-杜松烯、β-欖香烯;第二主成分貢獻(xiàn)率為19.530%,其中貢獻(xiàn)較大的是γ-杜松醇、τ-杜松烯和1-辛烯-3-醇,第三主成分貢獻(xiàn)率為19.432%,其中貢獻(xiàn)較大的是β-蒎烯、β-蓽澄茄烯、β-石竹烯;第四主成分貢獻(xiàn)率為10.554%,其中貢獻(xiàn)較大的是β-月桂烯、刺柏烯醇;第五主成分貢獻(xiàn)率為10.066%,其中貢獻(xiàn)較大的是D-檸檬烯。這12個(gè)成分影響著不同種源福建柏葉精油質(zhì)量。

各種源福建柏葉精油在每一主成分上的得分(FAC),計(jì)算得到綜合得分(F),結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同種源葉福建柏精油新變量值1)Table 5 New variable values of different provenances essential oil of F. hodginsii

根據(jù)得分可直觀反映出各種源地成分差異,可分為含不同主成分類別。得分為正則表示與負(fù)荷量表值正相關(guān),為負(fù)則為負(fù)相關(guān);若同一種源地某主成分得分較高,則表示對(duì)該主成分貢獻(xiàn)率較為突出;某主成分最大值所對(duì)應(yīng)的種源為含該主成分最高的種源。不同種源福建柏葉精油主成分及其GC含量綜合得分最高種源地為廣西來(lái)賓金秀,與其他種源精油相比其α-蒎烯和β-蒎烯含量較低;綜合得分最低為福建莆田仙游,與其他種源精油相比其α-蒎烯含量較高、β-蒎烯較低。

2.4.3聚類分析 基于不同種源福建柏葉精油主成分采用分層聚類法進(jìn)行聚類分析。采用離差平方和法利用歐氏距離作為樣品的測(cè)度[10-11],每2個(gè)樣本間用類間平均聯(lián)鎖法鏈接,獲得分層聚類分析圖,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 14個(gè)種源福建柏葉精油聚類樹(shù)形Fig.3 Cluster tree diagram of F. hodginsii leaf essential oil obtained from 14 provenances

當(dāng)歐氏平方距離(NUM)=20時(shí),可將不同種源福建柏葉精油成分聚類為3類:第一類為5號(hào)樣品組成,第二類由9號(hào)和14號(hào)樣品組成,第三類由其余11組樣品組成,表明5號(hào)重慶江津種源與其他種源精油成分及其GC含量差異較大,其中與福建福州永泰、福建三明大田、廣西桂林灌陽(yáng)和廣西南寧大明山這4個(gè)種源差異最大。

當(dāng)NUM=15時(shí),可將不同種源福建柏葉精油成分聚類為3類:第一類由5號(hào)樣品組成,第二類由9、 14號(hào)2組樣品組成,第三類由其他11組樣品組成。

當(dāng)NUM=10時(shí),可將不同種源福建柏葉精油成分聚類為6類:第一類由5號(hào)樣品組成,第二類由9、 14號(hào)2組樣品組成,第三類由2號(hào)樣品組成,第四類由4、 12、 6、 10號(hào)4組樣品組成,第五類由7、 8號(hào)2組樣品組成,第六類由1、 3、 13、 11號(hào)4組樣品組成。第六類均為福建、廣西省區(qū)內(nèi)的種源樣品組成,第五、第四和第二類主要為福建省內(nèi)種源,第三和第一類為單獨(dú)的廣西種源和重慶種源。

當(dāng)NUM=5時(shí),進(jìn)一步將福建省內(nèi)9個(gè)種源精油成分聚類為7類:只有龍巖長(zhǎng)汀與漳州華安、福州閩清與泉州永春各聚為一類,其他福建省的種源地全部分為單獨(dú)或與其他省份種源為一類,如廣西桂林灌陽(yáng)、廣西南寧大明山與福建福州永泰聚為一類,廣西來(lái)賓金秀單獨(dú)為一類,與廣西另外2個(gè)種源葉成分及其GC含量差異較大。

重慶江津福建柏葉精油成分及其GC含量與其他種源差異明顯;福建省內(nèi)福建柏葉精油成分及其GC含量具有相關(guān)性和差異性,龍巖長(zhǎng)汀和漳州華安與福建省其他種源相關(guān)性較弱,但種源地理位置相近的福建柏葉精油均有較強(qiáng)的相關(guān)性;廣西來(lái)賓金秀,與其他2個(gè)廣西種源精油成分及其GC含量差異性較大;廣西的桂林灌陽(yáng)和南寧大明山,以及廣東深圳南嶺種源均與福建種源葉精油成分有較強(qiáng)的相關(guān)性。

2.5 討論

造成植物體內(nèi)精油主要成分及其GC含量不同的原因是多方面的,除生長(zhǎng)環(huán)境(土壤、氣候、季節(jié)等)、樹(shù)齡、采集部位、采集運(yùn)輸過(guò)程和提取工藝等外在因素以外,植物種源不同也是造成精油主要化學(xué)成分及其GC含量差異的主要因素[12-16]。當(dāng)環(huán)境因子一定、正常生長(zhǎng)時(shí),基因控制著福建柏葉精油的成分及其GC含量,表明福建柏葉精油主要成分及其GC含量受遺傳基因影響顯著。福建柏葉精油中α-蒎烯的GC含量較高,約占總成分的50%,與松針精油成分相似。松針精油的市場(chǎng)應(yīng)用很廣泛,因此福建柏葉精油同樣具有很高的研究?jī)r(jià)值。α-蒎烯是合成香料的主要原料,主要用于合成松油醇、芳樟醇以及一些檀香型香料,也可用于日化產(chǎn)品以及其他工業(yè)品的加香,在工業(yè)上經(jīng)常被用于合成潤(rùn)滑劑和增塑劑。α-蒎烯微毒,高濃度時(shí)會(huì)對(duì)人體造成危害。有研究發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)高于50 mL/L時(shí)α-蒎烯對(duì)小麥中的害蟲(chóng)以及玉米中的玉米象和雜擬谷盜有較為理想的殺蟲(chóng)效果。α-蒎烯還具有抗腺病毒作用,為研發(fā)天然、高效、低毒的抗腺病毒藥物提供了科學(xué)依據(jù)[17]。福建柏葉精油中β-蒎烯的GC含量占總成分的4%左右,有研究以β-蒎烯為原料,經(jīng)化學(xué)反應(yīng)制備了二氫枯茗酸酰胺等6類共45種新化合物,這些化合物中的大部分具有一定的抑菌作用以及一定的廣譜抗菌性[18]。不同種源福建柏葉精油主要成分中α-蒎烯和β-蒎烯的含量差異較小,相較于其他種源地,廣西各種源地的福建柏葉精油中α-蒎烯和β-蒎烯含量較高,這可能是受種源地遺傳基因的影響。

3 結(jié) 論

3.1通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化,得到福建柏葉精油超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取的最佳工藝條件為:液料比3.5∶1(mL∶g)、提取時(shí)間8 h,超聲波處理時(shí)間30 min和超聲波功率240 W。此條件下,精油得率為0.252%。

3.2不同種源福建柏葉精油得率、主要成分及其GC含量的差異顯著,精油得率較高的種源為福建三明大田、廣西南寧大明山、廣西桂林灌陽(yáng),主要成分GC含量較高的種源為廣西南寧大明山、福建三明大田、廣東深圳南嶺,影響福建柏葉精油品質(zhì)的主要成分為α-杜松醇、γ-依蘭油烯、β-蓽澄茄烯、β-欖香烯、β-杜松烯、γ-杜松烯、τ-杜松醇、β-蒎烯、β-石竹烯、D-檸檬烯、刺柏烯醇、β-月桂烯。地理位置相距較近種源間福建柏葉精油成分及其GC含量相關(guān)性較強(qiáng),表明福建柏葉精油得率、化學(xué)成分及其GC含量受基因遺傳因素影響顯著,并有穩(wěn)定遺傳可能。

3.3不同種源福建柏葉精油主成分綜合得分最高種源地為廣西來(lái)賓金秀,α-蒎烯含量較低;綜合得分最低為福建莆田仙游,α-蒎烯含量較高。根據(jù)福建柏葉精油得率、主要成分GC含量,種源廣西南寧大明山、福建三明大田均為較合適選擇,可用于早期選育品種,其精油成分更具有生產(chǎn)價(jià)值,可以為福建柏工業(yè)原料林營(yíng)造和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考,為福建柏精油開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù),從而充分發(fā)揮福建柏的應(yīng)用價(jià)值。