張曉君，徐萬幫，唐剛?cè)A*

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）在乳腺癌、結(jié)直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌及非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達，與癌癥發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及血管生成密切相關(guān)，這使得EGFR 成為抗癌藥物研究的熱點之一。目前已有多種針對EGFR 的靶向藥物用于臨床治療并取得良好的療效，但仍有一些病人無法從中獲益[1]。由于EGFR 的過表達是預估腫瘤侵襲性及放化療耐藥性、判斷預后的可靠指標，因此提前篩選對靶向治療敏感的人群，對于提高療效和評估預后十分必要。常規(guī)的分子病理學手段受取樣及腫瘤異質(zhì)性的限制，難以完整地評估腫瘤EGFR 的表達與變異狀況，容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，而免疫正電子發(fā)射體層成像（PET）作為一種分子成像技術(shù)，以其高度特異性及可重復性顯示出獨特的優(yōu)越性[2]。

1 靶向EGFR 免疫PET 的原理及應用

EGFR 又稱為ErbB1、HER1，是ErbB 蛋白家族（在人類中被稱為HER 家族）的成員之一。它是一種單鏈的跨膜糖蛋白，由膜外配體結(jié)合域、疏水性跨膜域及胞內(nèi)受體酪氨酸激酶結(jié)合域3 個主要結(jié)構(gòu)域組成。EGFR 通過配體誘導的二聚化啟動信號級聯(lián)反應，激活多個下游信號通路，從而促進細胞的增殖、分化、遷移及抑制細胞凋亡[3]。

PET 是分子成像領(lǐng)域的一項新技術(shù)，可以對腫瘤組織的代謝和分子表達進行全身性、無創(chuàng)性評估。18F-FDG 作為一種反映細胞代謝情況的葡萄糖類似物，是最早使用且目前臨床最常用的PET 顯像劑。然而，18F-FDG 無法提供腫瘤分子靶點表達的信息，且基于葡萄糖代謝的顯像難以鑒別良、惡性病灶，容易造成假陽性的結(jié)果，因此需要特異性更高的顯像劑。目前靶向EGFR 的PET 顯像劑主要有抗體類、小分子酪氨酸酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI）類及EGFR 配體3 種。目前常用的TKI 多為喹唑啉衍生物，可與三磷酸腺苷競爭胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，從而抑制下游的信號傳導通路。然而，TKI 較高的親脂性可能導致非特異性結(jié)合，使顯像劑在肝膽系統(tǒng)及腹腔內(nèi)蓄積，干擾相應部位病灶的成像；且TKI 在血液循環(huán)中產(chǎn)生的放射性代謝產(chǎn)物也會影響其放射性分布[4-5]。EGFR 的天然配體具有清除快、腫瘤與非靶器官比值低的缺點，且肝臟對其的高攝取及不良生理反應限制了天然配體的廣泛應用?；诳贵w類顯像劑的免疫PET以正電子核素標記的單克隆抗體及其片段作為顯像劑進行顯像，可以評估特定抗原靶點在體內(nèi)的分布與表達。它結(jié)合了單克隆抗體高度的靶向特異性及PET 的高敏感度及分辨率的優(yōu)點，除了作為檢測原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移的工具外，也可對腫瘤進行分期、分型，預測腫瘤對靶向治療的反應及評估靶向治療的療效[6-7]。通過靶向EGFR 的免疫PET 顯像，可以在靶向治療前篩選敏感人群，在治療過程中監(jiān)測EGFR 的表達并及時調(diào)整治療方案，有助于臨床更精準、合理地用藥。

2 免疫PET 常用正電子核素

目前應用于免疫PET 的正電子核素主要以長半衰期核素為主，如89Zr、64Cu、86Y 及124I 等。其中89Zr是最早用于抗體成像的核素，其半衰期（T1/2=78.4 h）與免疫球蛋白的生物半衰期相匹配，具有適用于抗體成像的良好的物理特性。與其他核素相比，89Zr 所產(chǎn)生的正電子能量合適，操作較安全，生產(chǎn)成本低，體內(nèi)穩(wěn)定性好，是目前最常用于免疫PET 顯像的核素。89Zr 標記的顯像劑在注射數(shù)天后仍可滯留在腫瘤細胞內(nèi)，從而呈現(xiàn)出低背景、高對比度的影像[8]。多數(shù)89Zr 標記的化合物通過去鐵胺（deferoxamine，DFO）與靶向配體螯合，但89Zr-DFO 復合物在體內(nèi)易解離，產(chǎn)生游離的Zr4+沉積在骨組織中。針對DFO的不足之處，開發(fā)出多種由DFO 衍生的螯合劑以解決DFO 的穩(wěn)定性問題，如DFO*及DFO*與對苯二異硫氰酸鹽[-pPhe-NCS（NCS 為其中3 個元素，結(jié)構(gòu)為-N=C=S）] 制備而成的DFO*-pPhe-NCS 等[6]。當前已有部分89Zr 標記的特異性抗體進入臨床試驗階段，成功實現(xiàn)了卵巢癌、頭頸部鱗狀細胞癌、淋巴瘤等腫瘤病灶的可視化。與89Zr 相比，64Cu 的半衰期相對較短（T1/2=12.7 h），因此更適合用于標記抗體片段；由于64Cu 發(fā)射的正電子能量低于89Zr，可獲得分辨率更好、質(zhì)量更高的影像。此外，64Cu 還可發(fā)射β-射線，故其不僅是一種顯像劑，還是一種很有應用前景的治療性核素。然而，由于64Cu 主要經(jīng)過肝膽系統(tǒng)清除，可導致肝膽、腸道對顯像劑的攝取較高，限制了相應部位及鄰近器官組織病灶的檢測[6，9]。86Y（T1/2=14.7 h）可作為治療性核素90Y 的替代物，可較為精確地反映90Y 在體內(nèi)的生物分布及劑量。124I 雖具有較為合適的半衰期（T1/2=4.2 d），但其在體內(nèi)的脫鹵作用限制了它的臨床應用。除了上述長半衰期的核素外，近年來隨著各種納米抗體、親合體等小分子底物的開發(fā)，半衰期更短的68Ga、18F 也開始用于免疫PET 成像，在更快實現(xiàn)診斷性顯像的同時可減少病人的輻射吸收劑量[6]。

3 靶向放射性藥物

3.1 全長抗體 完整的單克隆抗體具有高靶向親和力，是最經(jīng)典的腫瘤靶向EGFR 的治療藥物及免疫PET 放射性核素標記的底物，目前最常用于顯像的單克隆抗體包括西妥昔單抗、帕尼單抗以及尼妥珠單抗等。

西妥昔單抗是最早用于PET 顯像的單克隆抗體，目前已有利用不同的放射性核素標記西妥昔單抗進行臨床前及臨床研究。Song 等[10]將西妥昔單抗與雙功能螯合基團3,6,9,15-四氮雜雙環(huán)[9.3.1]十五烷-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸（PCTA）連接，采用標記合成的64Cu-/177Lu-PCTA-西妥昔單抗對EGFR 陽性的食管鱗癌進行免疫PET 成像及放射免疫治療，實現(xiàn)了腫瘤的診療一體化。Benedetto等[11]研究表明89Zr-DFO-西妥昔單抗可用于評估頭頸部鱗癌對西妥昔單抗的攝取，并推測其還可用于監(jiān)測由于EGFR 表達下調(diào)導致的化療耐藥。有研究者[12]開展的一項臨床研究實現(xiàn)了EGFR 表達的可視化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在晚期結(jié)直腸癌病灶及轉(zhuǎn)移灶中均有89Zr-西妥昔單抗的攝取，且在注射顯像劑后第6 天達到最佳的顯像效果，但在后續(xù)的研究中，89Zr-西妥昔單抗未能預測RAS 野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌病人的療效[13]。此外，van Loon 等[14]研究表明，使用89Zr-西妥昔單抗進行成像前需注射未標記的西妥昔單抗使肝細胞的EGFR 預飽和，以期達到令人滿意的顯像效果。此外，Matsumoto 等[15]設(shè)計了一種與西妥昔單抗具有相同氨基酸序列的抗EGFR 單抗NCAB001 并使用64Cu 進行標記，通過腹腔給藥的方式成功檢測了小鼠胰腺中直徑≥3 mm 的小腫瘤病變。

帕尼單抗是一種完全人源性IgG2 抗體，用于治療難治性、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。有臨床前研究[2]顯示帕尼單抗對EGFR 的親和力大于西妥昔單抗。Niu等[16]在早期將帕尼單抗與螯合基團1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-四乙酸（DOTA）結(jié)合，并使用64Cu 標記合成的64Cu-DOTA-帕尼單抗未能體現(xiàn)其與腫瘤模型中EGFR 表達之間的相關(guān)性，他們推測這可能是腫瘤內(nèi)部微血管密度低、血管通透性差及顯像劑與靶點間存在結(jié)合位點屏障等原因所致。后續(xù)用89Zr 及86Y 標記帕尼單抗的試驗中，顯像劑的攝取與腫瘤的EGFR 表達之間表現(xiàn)出了相關(guān)性，表明核素標記的帕尼單抗作為顯像劑具有良好的特異性及靶向性[17-18]。Lindenberg 等[19]對3 例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌病人進行的臨床研究中也觀察到了腫瘤對89Zr-帕尼單抗的特異性攝取，但仍然存在肝臟本底過高、病人接受輻射劑量過大的情況。最近，Hoang 等[20]合成的89Zr-DFO-帕尼單抗在皮下及原位2 種膀胱癌模型中均實現(xiàn)了EGFR 陽性腫瘤的可視化。

與前兩種單抗相比，尼妥珠單抗具有更低的皮膚毒性，這說明它在低表達EGFR 的正常組織中結(jié)合率更低，對于腫瘤特異性顯像更有優(yōu)勢。Chekol等[21]合成的89Zr-DFO-尼妥珠單抗在EGFR 表達的腫瘤中表現(xiàn)出了早期、高度、持續(xù)的攝取，而周圍正常器官的攝取較低，這使早期腫瘤定位成為可能。除此之外，89Zr-DFO-尼妥珠單抗的有效劑量低于同樣方法標記的西妥昔單抗及帕尼單抗，在37 MBq 的人體劑量下，顯像劑的預測輻射吸收劑量與18F-FDG相近甚至更低，這使得89Zr-DFO-尼妥珠單抗允許重復掃描及隨訪檢查，有利于隨訪檢測體內(nèi)EGFR的表達水平。Tang 等[22]后續(xù)針對異種移植膠質(zhì)瘤的研究也表明89Zr-DFO-尼妥珠單抗具有良好的穩(wěn)定性與靶向性。Solomon 等[23]使用一種名為SpyTag/SpyCatcher 的蛋白共價連接方法，利用顯像核素89Zr及治療性核素225Ac 標記尼妥珠單抗，分別取得了良好的腫瘤靶向顯像效果及抑制腫瘤生長的效果，實現(xiàn)了腫瘤的診療一體化。

除了上述3 種常用的單克隆抗體外，還有研究者利用核素標記其他靶向EGFR 的單克隆抗體。Tikum 等[24]用89Zr 標記的馬妥珠單抗在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出了良好的腫瘤特異性攝取。且馬妥珠單抗與尼妥珠單抗雖同時靶向EGFR，但由于兩者結(jié)合位點不同，89Zr 標記的馬妥珠單抗可動態(tài)監(jiān)測使用尼妥珠單抗進行靶向治療病人體內(nèi)EGFR 的表達情況，而不受另一種抗體的干擾。

3.2 抗體片段 盡管基于全長抗體的顯像劑在一系列臨床前及臨床試驗中取得良好的結(jié)果，但由于全長抗體的分子質(zhì)量（150 ku）較大，超出腎小球的清除能力，腫瘤攝取及血液清除緩慢，導致標記全長抗體成像具有靶本底比值（T/B）不理想、需重復成像、成本高、病人所受輻射劑量大等缺點，且往往需要數(shù)天才能達到最佳的成像效果，不利于臨床應用。此外，由于其生物半衰期較長，需要配合半衰期同樣長的放射性核素，全長抗體在免疫PET 上的應用也受到限制[6]。

二價抗原結(jié)合片段F(ab′)2 由2 個以二硫鍵結(jié)合的抗原結(jié)合區(qū)組成，相比單價抗原結(jié)合片段（Fab）親和力更高；且F(ab′)2 在保留了全長抗體靶向性高的特點的同時，還具有免疫原性低、血液清除及腫瘤細胞內(nèi)累積較快的優(yōu)點[25]，可實現(xiàn)注射后的當天成像。Boyle 等[26]將帕尼單抗的F(ab′)2 片段與1,4,7-三氮雜環(huán)九烷基-1,4,7-三乙酸（NOTA）結(jié)合，合成的64Cu-NOTA-帕尼單抗-F(ab')2 顯示出了較高的親和力及特異性，且荷瘤鼠肝臟中的放射性攝取要低于完整的帕尼單抗，有助于肝臟病灶的檢出。Turker 等[27]發(fā)現(xiàn)與18F-FDG 相比，由于64Cu-西妥昔單抗-F(ab′)2 不被炎癥組織攝取，更有利于結(jié)腸炎背景下的結(jié)腸癌病灶的檢出，且腫瘤病灶位置與顯像劑高攝取區(qū)存在解剖學上的相關(guān)性。Chakravarty 等[28]研究利用44Sc 及64Cu 標記西妥昔單抗-F(ab′)2 片段在小鼠異位移植的腦膠質(zhì)瘤及頭頸部鱗狀細胞癌模型上均體現(xiàn)了靶向性高及全身清除快的特性。近期，Rudd 等[29]開發(fā)了一種酶介導的64Cu 及89Zr 標記的抗EGFR Fab528 片段，在注射后3 h 即可獲得高質(zhì)量的影像；且除了快速攝取外，顯像劑能在腫瘤細胞內(nèi)滯留，注射18 h 后腫瘤部位依然觀察到相當高的放射性分布。

3.3 親合體 親合體分子是一種由58 個氨基酸殘基組成的小分子工程支架蛋白，其功能與抗體相似。與單克隆抗體及抗體片段相比，親合體分子具有分子質(zhì)量更?。s6.5 ku）、化學穩(wěn)定性好、特異性及親和力高的特點，能快速地通過腎臟等排泄器官清除，使影像的敏感度、對比度更高，是一種非常有應用前景的分子探針[8]。

目前研究中常用于成像的靶向EGFR 的親合體分子主要有ZEGFR:1907及ZEGFR:2377兩種。ZEGFR:1907是第2 代親合體分子，具有良好的親和力。Zhao 等[30]分別用64Cu 及Alexa680 標記ZEGFR:1907，用于肝癌細胞的PET 顯像及近紅外熒光成像，結(jié)果顯示64Cu-DOTA-ZEGFR:1907在高、中表達EGFR 的Hep3B、PLC/PRF/5 腫瘤模型內(nèi)均有明顯的攝取，而在低表達EGFR 的HepG2 腫瘤模型內(nèi)沒有明顯攝取，表明基于ZEGFR:1907的PET 顯像比光學成像更能區(qū)別肝癌腫瘤細胞的異質(zhì)性。Miao 等[31]設(shè)計的18F-FBEM-Cys-ZEGFR:1907以高水平的親和力與EGFR 陽性的A431 腫瘤細胞結(jié)合，且當與45 μg 的Ac-Cys-ZEGFR:1907共同注射時可獲得更高對比度的圖像。

ZEGFR:2377是靶向EGFR 親合力最高、被研究最多的親合體分子[32]。Garousi 等[33]研究合成的89Zr-DFO-ZEGFR:2377在注射顯像劑后3、24 h 兩個時間點的腫瘤與器官（腎臟除外）比值均高于89Zr-DFO-西妥昔單抗，提示前者具有更高的成像敏感度。Garousi等[34]及Mitran 等[35]先后以57Co 作為55Co 的替代物，合成的57Co-DOTA-ZEGFR:2377表現(xiàn)出良好的靶向性以及優(yōu)秀的腫瘤與背景比值，即57Co-DOTA-ZEGFR:2377的腫瘤與肝臟比值約為3，較68Ga-DOTA-ZEGFR:2377高7 倍，是目前基于親合體的顯像劑中腫瘤與器官比值最高的。同時，由于預先注射的過量西妥昔單抗能阻斷腫瘤細胞的攝取，57Co-DOTA-ZEGFR:2377可用于檢測西妥昔單抗治療期間EGFR 受體的占比情況。Oroujeni 等[36]合成的68Ga-DFO-ZEGFR:2377對比89Zr-DFO-ZEGFR:2377具有更高的腫瘤攝取及腫瘤與背景比值；其腫瘤與肝臟比值雖不如57Co-DOTA-ZEGFR:2377，但由于68Ga 比55Co 更易獲得，因此前者更適用于臨床對肺、肝及骨骼等部位腫瘤轉(zhuǎn)移灶的檢測。Oroujeni等[37]隨后嘗試用半衰期更長的66Ga（T1/2=9.49 h）標記ZEGFR:2377，在注射24 h 后獲得相比68Ga 及89Zr 標記的ZEGFR:2377更高的成像對比度。

3.4 納米抗體 納米抗體又稱為單域抗體，是駱駝重鏈抗體的可變區(qū)，它是目前最小的抗原結(jié)合單位（15 ku），具有容易克隆、親和力及穩(wěn)定性高的優(yōu)點，被稱為腫瘤分子成像的“神奇子彈”[38]。由于納米抗體體積小、腎臟清除快，故在注射1～3 h 內(nèi)即可對其進行定量檢測，從而減輕病人的輻射負擔[39]。目前已有數(shù)種抗EGFR 納米抗體被開發(fā)用于PET 及單光子發(fā)射體層成像（SPECT），如7D12、7C12 及D10等，但尚未有顯像劑成功實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化[40]。其中，7D12 是其中唯一用于PET 顯像的納米抗體，Vosjan等[41]合成的68Ga-Df-Bz-NCS-7D12 在裸鼠A431 異種移植模型中取得了高特異性的攝??；與放射性標記單抗相比，納米抗體成像的肝臟攝取明顯降低，而腫瘤的攝取量更高，這表明68Ga-Df-Bz-NCS-7D12 具有優(yōu)于放射性標記單抗的評估EGFR 表達的潛力。

4 臨床應用

作為分子成像技術(shù)的一種，免疫PET 顯像是一種非常有潛力的診斷工具。它不僅能夠從分子水平反映器官組織的功能學特征，且相比常規(guī)的18FFDG 顯像具有更高的特異性，能夠提供特定靶點的信息。對于某些早期18F-FDG 顯像陰性而EGFR 表達陽性的腫瘤（如胰腺癌等），靶向EGFR 的免疫PET 顯像能提高腫瘤的診斷率，從而通過早期干預改善預后。

除了作為輔助腫瘤診斷的成像工具外，免疫PET 顯像還可以通過預測及評估靶向治療效果，指導腫瘤病人的個體化治療。在治療前，可通過免疫PET 篩選EGFR 表達陽性的病人接受相應的抗體治療；而在治療后重復的免疫PET 顯像可通過對比治療前后靶點表達的情況，評估腫瘤組織對治療的反應，有助于調(diào)整下一步的治療方案。Chang 等[18]研究表明，腫瘤對89Zr-帕尼單抗的攝取與其EGFR 的表達存在良好的相關(guān)性。有研究者[12]利用89Zr-西妥昔單抗對10 例結(jié)直腸癌病人進行了PET 顯像評估，發(fā)現(xiàn)在6 例存在89Zr-西妥昔單抗的腫瘤攝取的病人中，有4 例病人對西妥昔單抗治療有所獲益，表明89Zr-西妥昔單抗可用于預測西妥昔單抗的療效。

此外，靶向EGFR 的免疫PET 能對抗癌藥物的研發(fā)起到指導作用。腫瘤靶向藥物的研發(fā)是一個復雜的過程，需要消耗大量的時間和經(jīng)濟成本，而靶向EGFR 的免疫PET 可通過可視化抗EGFR 類藥物在活體內(nèi)的藥代動力學特征及病灶對藥物的攝取，并評估藥物的靶向性及特異性，有助于直觀地評估抗癌藥物的體內(nèi)特性。且通過提供觀察藥物的組織分布及可視化靶點表達的信息，靶向EGFR 的免疫PET 有助于藥物研發(fā)人員優(yōu)化藥物的設(shè)計、劑量、給藥途徑，在臨床前階段預測藥物的毒性，并能選擇那些從相應藥物中最大程度獲益的病人，還有利于減少研發(fā)時間及降低經(jīng)濟成本[42]。

5 小結(jié)與展望

靶向EGFR 的免疫PET 顯像利用EGFR 在多種惡性腫瘤中高表達的特點，結(jié)合了抗體的高靶向性及PET 顯像的高敏感度，是定量、實時監(jiān)測病人體內(nèi)EGFR 表達的有效工具。它可以指導腫瘤靶向治療及藥物研發(fā)、評估療效，從而實現(xiàn)腫瘤病人的個體化治療。針對全長抗體類顯像劑分子量過大、血液清除及腫瘤攝取的不足，研究者們開始關(guān)注分子質(zhì)量更小的抗體片段、親合體分子及納米抗體類顯像劑，它們在克服了全長抗體成像效果不理想、需注射后數(shù)日成像及病人所受放射劑量過大等缺陷的同時，保留了全長抗體的高靶向性及特異性的優(yōu)點。除了與89Zr、64Cu 等顯像用核素結(jié)合外，上述顯像劑還可以與177Lu、90Y 等治療用核素結(jié)合，從而實現(xiàn)腫瘤的診療一體化。目前大部分免疫PET 探針僅在少數(shù)病人中進行了小范圍臨床試驗，缺乏大規(guī)模的臨床試驗數(shù)據(jù)，因此需要進行更大樣本、多中心的臨床評估。

綜上所述，靶向EGFR 的免疫PET 顯像劑的開發(fā)是研究的熱點之一，是腫瘤診療可靠的輔助工具。相信在不久的將來，靶向EGFR 的免疫PET 顯像劑將應用于臨床，服務于臨床醫(yī)生及病人。