摘 要：熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）廣泛存在于牛肉、魚(yú)類、家禽和乳制品等生鮮產(chǎn)品中，成為引發(fā)食源性疾病的重要原因。以熒光假單胞菌ATCC 13525作為供試菌株，研究異硫氰酸芐酯（benzyl isothiocyanate，BITC）對(duì)菌株的抑制作用及其應(yīng)用于牛肉的保鮮效果。結(jié)果表明：通過(guò)牛津杯實(shí)驗(yàn)法，得到BITC對(duì)熒光假單胞菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為0.25 mmol/L；表型實(shí)驗(yàn)表明BITC能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性并降低代謝活力；此外，相比于對(duì)照組，MIC處理組牛肉貯藏7 d內(nèi)菌落總數(shù)、色差值、pH值、總揮發(fā)性鹽基氮含量及氮氧化合物含量分別降低35.73%、21.52%、4.53%、54.39%和4.78%，而感官評(píng)分提高10.45%，說(shuō)明BITC可以顯著抑制熒光假單胞菌的生長(zhǎng)，改善牛肉的感官品質(zhì)及理化指標(biāo)。因此，BITC在冷鮮牛肉貯藏保鮮方面具有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：熒光假單胞菌；異硫氰酸芐酯；牛肉；抑菌作用；保鮮效果

Inhibitory Activity of Benzyl Isothiocyanate against Pseudomonas fluorescens and Its Application in Beef Preservation

GE Zitong， LIU Jianan， ZHANG Shuqi， BI Jingran， HOU Hongman， ZHANG Gongliang*

（1. Liaoning Key Laboratory for Aquatic Processing Quality and Safety， School of Food Science and Technology，

Dalian Polytechnic University， Dalian 116000， China）

Abstract： Pseudomonas fluorescens is widely found in raw animal products such as beef， fish， poultry and dairy products， and has become an important cause of foodborne diseases. The aim of this paper was to investigate the inhibitory effect of benzyl isothiocyanate （BITC） on P. fluorescens ATCC 13525 as a test strain and its application in beef for freshness preservation. The minimum inhibitory concentration （MIC） of BITC on P. fluorescens was observed to be 0.25 mmol/L by the Oxford cup method. Phenotyping experiments demonstrated that BITC was able to disrupt the permeability of bacterial cell membranes and reduce metabolic activity. In addition， compared with the control group， the total viable count， color difference， pH， total volatile basic nitrogen （TVB-N） content and nitrogen oxides content in the MIC-treated group were reduced by 35.73%， 21.52%， 4.53%， 54.39%， and 4.78%， respectively， after 7 days of storage， and the sensory score increased by 10.45%， indicating that BITC could significantly inhibit the growth of P. fluorescens and improve the sensory quality and physicochemical indexes of beef. Therefore， BITC has a good application prospect in the preservation of chilled beef.

Keywords： Pseudomonas fluorescens; benzyl isothiocyanate; beef; antibacterial effect; preservation effect

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240415-077

中圖分類號(hào)：TS251.1" " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2024）05-0027-09

引文格式：

葛子同， 劉佳楠， 張淑琪， 等. 異硫氰酸芐酯對(duì)熒光假單胞菌的抑菌活性及在牛肉保鮮的應(yīng)用[J]. 肉類研究， 2024， 38（5）： 27-35. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240415-077." " http：//www.rlyj.net.cn

GE Zitong， LIU Jianan， ZHANG Shuqi， et al. Inhibitory activity of benzyl isothiocyanate against Pseudomonas fluorescens and its application in beef preservation[J]. Meat Research， 2024， 38（5）： 27-35. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240415-077." " http：//www.rlyj.net.cn

牛肉味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，含有較高含量的維生素、肌氨酸、鐵及較低含量的脂肪和膽固醇，是人們生活中補(bǔ)充蛋白質(zhì)的重要來(lái)源[1-2]。牛肉在貯藏與運(yùn)輸過(guò)程中極易受到微生物的污染[3-4]，如假單胞菌[5]、腸桿菌[6]、乳酸桿菌[7]及熱鏈球菌等[8]。這些菌株通過(guò)加速蛋白質(zhì)和脂肪的降解，使牛肉產(chǎn)生黏液、異味及質(zhì)構(gòu)特性變化，并且菌株會(huì)釋放有害毒素，引發(fā)心臟、肺部、神經(jīng)系統(tǒng)或胃腸道炎癥[9-10]。因此，抑制牛肉在運(yùn)輸或加工過(guò)程中的腐敗已成為研究人員日益關(guān)注的重點(diǎn)[11]。

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一種常見(jiàn)的革蘭氏陰性細(xì)菌，屬于假單胞菌屬[12]。它具有強(qiáng)大的氧化能力，能夠在低溫下利用多種有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)物進(jìn)行代謝，被公認(rèn)為食品基質(zhì)微生物區(qū)系中最主要的腐敗細(xì)菌之一[13]。此外，熒光假單胞菌能夠產(chǎn)生多種酶類，包括蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等，以利用周圍環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[14]。假單胞菌屬已被證明是造成生鮮肉類變質(zhì)的主要菌種[15-17]，具有較強(qiáng)的蛋白和脂質(zhì)水解能力，容易導(dǎo)致肉類食品產(chǎn)生黏液并散發(fā)難聞氣味，從而降低肉品質(zhì)量、造成資源浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失[18]。因此，熒光假單胞菌對(duì)食品的污染以及對(duì)食品加工環(huán)境的危害需要進(jìn)一步的研究和控制。

隨著抗生素濫用導(dǎo)致的耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重，人們對(duì)天然提取物作為抗菌劑的研究日益深入。天然提取物是從植物、微生物、海洋生物等自然來(lái)源提取具有生物活性的化合物，具有廣泛的生物活性和較低的毒副作用。在抑菌領(lǐng)域，天然提取物展現(xiàn)出顯著潛力，為抗菌新藥的發(fā)展提供了新思路[19-21]。這些化合物具有不同的生物活性，能夠干擾細(xì)菌的代謝、膜結(jié)構(gòu)和DNA復(fù)制，從而達(dá)到抑菌效果[22]。王雅瑩[23]研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚對(duì)熒光假單胞菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為1.6 mmol/L，可以顯著抑制熒光假單胞菌的生物被膜生成、多糖產(chǎn)生、黏附性及運(yùn)動(dòng)性。Lan Weiqing等[24]研究顯示，殼聚糖-咖啡酸接枝共聚物以1.25 mg/mL（MIC）抑制了熒光假單胞菌的生長(zhǎng)，通過(guò)破壞菌體細(xì)胞、細(xì)胞膜、抑制菌體運(yùn)動(dòng)并破壞細(xì)菌DNA，從而阻礙熒光假單胞菌正常生長(zhǎng)繁殖。然而，這些天然抑制劑都需要較大的抑制濃度才能達(dá)到對(duì)熒光假單胞菌較好的抑菌效果。因此，研究能夠提高抑菌效率的天然抑菌劑，可以提高其在食品工業(yè)中的潛在應(yīng)用。

異硫氰酸芐酯（benzyl isothiocyanate，BITC）是由芥子酶介導(dǎo)的硫代葡萄糖苷的主要次級(jí)代謝物，通過(guò)啟動(dòng)硫代葡萄糖苷水解酶作為抵抗病原體的防御系統(tǒng)，以硫代葡萄糖苷的形式廣泛存在于豆瓣菜、卷心菜、花椰菜、甘藍(lán)和西蘭花等十字花科植物中[25-26]。其分子結(jié)構(gòu)中含有異硫氰基和芐酯基，這2 種基團(tuán)賦予BITC抗菌特性[27]。BITC對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌[28]、金黃色葡萄球菌[29]、大腸桿菌[30]和副溶血性弧菌[31]具有良好的抑菌效果。此外，Wu Hongyan等[32]研究發(fā)現(xiàn)，含有BITC的復(fù)合膜對(duì)牛肉具有良好的保護(hù)效果；Huang Yue等[33]研究證明，添加BITC的天然復(fù)合膜包裹處理后，對(duì)金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在雞肉表面的增殖具有持續(xù)抑制作用；Li Zhaolun等[34]研究結(jié)果同樣證明BITC減緩了雞肉中微生物的生長(zhǎng)，對(duì)雞肉中的細(xì)菌具有較好的抑制作用。BITC作為可使用的食品添加劑（GB 2769—2014

《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》），對(duì)大多數(shù)致病菌具有抑制作用，但鮮有其對(duì)熒光假單胞菌抑制效果以及直接對(duì)冷鮮牛肉抑菌保鮮的相關(guān)研究與報(bào)道，因而B(niǎo)ITC作為一種具有多種生物活性的天然化合物，在食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。

本研究以不同濃度的BITC作為保鮮抑制劑，通過(guò)牛津杯實(shí)驗(yàn)探究BITC對(duì)熒光假單胞菌的MIC。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)和代謝活力探明不同濃度BITC對(duì)熒光假單胞菌活性的影響。此外，將BITC應(yīng)用于牛肉中，通過(guò)菌落總數(shù)、色差、pH值、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、電子鼻測(cè)定及感官評(píng)定，研究BITC對(duì)被熒光假單胞菌侵染的牛肉品質(zhì)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛上腦 大連市華潤(rùn)萬(wàn)家超市；熒光假單胞菌ATCC 13525 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

BITC（分析純，純度98%） 美國(guó)Sigma公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，分析純）天津大茂化學(xué)試劑廠；氯化鈉 北京寶希迪科技有限公司；LB肉湯、瓊脂粉、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、甲醛、無(wú)菌采樣袋 山東海博生物公司；磷鎢酸負(fù)染色液（2%，pH 7.0） 北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GN1324型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；DGG-9140A型高壓滅菌鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ZHWY-100B型恒溫培養(yǎng)振蕩器、

ZHJH-C1112C型超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司；DDS-11A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 海爾集團(tuán)股份有限公司；SpectraMax M2型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)MD儀器公司；JEM-2100型透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM） 日本東京電子公司；

T50型勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；HZP-L502型pH計(jì) 華志（福建）電子科技限公司；K9840型自動(dòng)凱氏定氮儀海能未來(lái)技術(shù)集團(tuán)股份有限公司；DS-700D型分光測(cè)色儀"深圳市金準(zhǔn)儀器設(shè)備有限公司；PEN3型電子鼻 埃爾森斯（北京）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

BITC儲(chǔ)備液制備：吸取適量BITC原液，用適量的DMSO溶解至1 mol/L。

無(wú)菌生理鹽水制備：稱取0.85 g氯化鈉于100 mL去離子水中，121 ℃高壓蒸汽滅菌處理后，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

無(wú)菌牛肉制備：將超市采購(gòu)的現(xiàn)殺牛肉在超凈工作臺(tái)中使用無(wú)菌水清洗表面，紫外照射1 h。隨后，使用滅菌處理的剪刀將鮮牛肉剪切成3 g的方形肉塊，并裝進(jìn)帶壓條的無(wú)菌采樣袋（12 cm×18 cm）中密封備用。熒光假單胞菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期，使用無(wú)菌生理鹽水將菌液稀釋至104 CFU/mL，與BITC儲(chǔ)備液（終濃度為1/2 MIC和MIC）混合，對(duì)照組加入生理鹽水，吸取1 mL混合液加入無(wú)菌采樣袋中的牛肉上，通過(guò)勻漿機(jī)（3 000 r/min、3 min）使混合液與牛肉充分接觸。對(duì)照組、MIC處理組和1/2 MIC處理組均制備3 份樣品，每份為7 d所需的樣品量（21 塊牛肉）。一份肉塊與無(wú)菌生理鹽水1∶9（V/V）稀釋后均質(zhì)，吸取上清液涂板用于測(cè)定菌落總數(shù)；一份用于色差、電子鼻及pH值測(cè)定；一份用于TVB-N含量測(cè)定。每一樣品設(shè)置3 個(gè)平行。將制備好的樣品置于4 ℃培養(yǎng)7 d，每隔1 d進(jìn)行菌落總數(shù)、pH值、色差、TVB-N含量、電子鼻測(cè)定和感官評(píng)價(jià)，結(jié)合各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)以評(píng)價(jià)冷藏期間牛肉的新鮮度變化。

1.3.2 菌種活化及培養(yǎng)

1.3.2.1 菌種活化

使用接種環(huán)蘸?。?0 ℃保存的熒光假單胞菌于LB瓊脂平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)24 h。挑取熒光假單胞菌單菌落加入100 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。重復(fù)上述活化步驟2 次，將培養(yǎng)好的單菌落平板于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 菌種培養(yǎng)

無(wú)菌環(huán)境中，使用接種環(huán)挑取熒光假單胞菌單菌落加入100 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.3.3 BITC對(duì)熒光假單胞菌抑制效果研究

1.3.3.1 牛津杯實(shí)驗(yàn)

參照趙玉明等[35]牛津杯實(shí)驗(yàn)法測(cè)定BITC對(duì)熒光假單胞菌的MIC。菌株在30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至104 CFU/mL用于檢測(cè)。無(wú)菌LB固體培養(yǎng)基倒入已滅菌的玻璃皿中，牛津杯打孔，凝固后將配制好的菌懸液涂布，在孔中加入70 μL稀釋至不同終濃度的BITC（0、0.03、0.06、0.13、0.25、0.50 mmol/L），30 ℃培養(yǎng)24 h后觀察熒光假單胞菌生長(zhǎng)情況，以無(wú)菌落生長(zhǎng)的BITC濃度作為MIC。

1.3.3.2 菌體形態(tài)觀察

根據(jù)Shu Huizhen等[36]的研究稍加改動(dòng)。熒光假單胞菌在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，通過(guò)0、1/2 MIC和MIC的BITC處理，并在30 ℃培養(yǎng)12 h。取一滴細(xì)菌懸浮液漂浮在銅網(wǎng)格上5 min，使用磷鎢酸染色法進(jìn)行染色。在TEM上采集圖像，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3.3.3 代謝活力測(cè)定

熒光假單胞菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期，使用PBS清洗菌體。處理過(guò)的菌懸液與BITC（0、1/2 MIC和MIC）于30 ℃培養(yǎng)3、12 h。培養(yǎng)結(jié)束后，12 000×g離心2 min，無(wú)菌PBS清洗菌體。使用甲醇-水溶液（1∶1，V/V）配制0.01 mol/L碘硝基氯化四氮唑藍(lán)（iodonitrotetrazolium chloride，INT）溶液，INT溶液與菌懸液1∶9（V/V）混合，30 ℃條件下培養(yǎng)30 min，測(cè)定630 nm波長(zhǎng)處的光密度（optical density，OD）[37]。

1.3.4 BITC對(duì)牛肉的保鮮效果研究

1.3.4.1 菌落總數(shù)測(cè)定

參照GB 4789.2—2022《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》，處理后的菌液涂布在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定。

1.3.4.2 色差測(cè)定

將樣品用濾紙吸干多余液體，使用分光測(cè)色儀測(cè)定牛肉的色澤，測(cè)量前儀器用黑色和白色標(biāo)準(zhǔn)板校準(zhǔn)，每個(gè)牛肉樣品至少測(cè)定3 個(gè)不同的區(qū)域。色差值（ΔE）按下式計(jì)算[38]：

式中：ΔL*表示所測(cè)亮度值（L*）與初始L*之差；Δa*表示所測(cè)紅度值（a*）與初始a*之差；Δb*表示所測(cè)黃度值（b*）與初始b*之差。

1.3.4.3 pH值測(cè)定

參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測(cè)定》。

1.3.4.4 TVB-N含量測(cè)定

參照GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》。

1.3.4.5 電子鼻測(cè)定

電子鼻是可以檢測(cè)復(fù)雜氣味的電化學(xué)傳感器系統(tǒng)，包含10 種傳感器，不同傳感器對(duì)不同類型氣味具有不同的敏感程度，具體描述見(jiàn)表1[39]。將樣品絞碎，靜置30 min后進(jìn)行電子鼻檢測(cè)。

1.3.4.6 感官評(píng)價(jià)

參照GB 2707—2016《鮮（凍）畜、禽產(chǎn)品》對(duì)牛肉的感官品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。由15 名專業(yè)人員組成感官評(píng)定小組，根據(jù)視覺(jué)、嗅覺(jué)、觸覺(jué)判斷牛肉色澤、氣味、形態(tài)及質(zhì)地狀態(tài)。同一樣品、同一項(xiàng)目評(píng)分取平均值，同一天的總評(píng)分為各個(gè)評(píng)價(jià)項(xiàng)目分?jǐn)?shù)平均值的總和。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 組平行，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用OriginPro 2019b軟件（美國(guó)Origin Lab公司）進(jìn)行繪圖，SPSS Statistic 27軟件（美國(guó)SPSS公司）進(jìn)行方差分析，使用單因素方差分析和Tukey檢驗(yàn)校正法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)間的差異是否顯著，P＜0.05表明有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 BITC對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)情況的影響

如表3所示，牛津杯實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)BITC濃度超過(guò)0.06 mmol/L時(shí)，BITC對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)出現(xiàn)抑制作用。當(dāng)BITC濃度達(dá)到0.25 mmol/L，熒光假單胞菌的生長(zhǎng)完全受到抑制，說(shuō)明BITC對(duì)熒光假單胞菌的MIC為0.25 mmol/L。

微生物的微觀結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)容物（蛋白質(zhì)和核酸）、生理活動(dòng)所需能量及相關(guān)酶類對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖十分必要[40]。而抑菌劑可以通過(guò)影響這些微觀結(jié)構(gòu)達(dá)到抑制微生物的作用[41]。因此，BITC可能通過(guò)影響一種或多種微觀結(jié)構(gòu)，從而具有較好的抑菌性能。

2.2 BITC對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞形態(tài)和代謝活力的影響

如圖1A所示，對(duì)照組的熒光假單胞菌細(xì)胞形態(tài)完整，呈橢圓桿狀，菌體數(shù)量較多且無(wú)透光部位出現(xiàn)。MIC處理后，細(xì)胞邊緣出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸等內(nèi)容物泄露，這可能是細(xì)菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁受到破壞所引起的[42]，說(shuō)明BITC會(huì)導(dǎo)致熒光假單胞菌細(xì)胞膜的損傷，并且高濃度處理組損傷程度更嚴(yán)重。Shu Huizhen等[36]研究表明，3-蒈烯處理后，熒光假單胞菌細(xì)胞損傷及細(xì)胞壁分離。Yao Xiaolin等[43]的研究顯示，熒光假單胞菌經(jīng)聚甲氧基黃酮處理后細(xì)胞形態(tài)受損，膜被破壞。

小寫字母不同表示同一時(shí)間組間差異顯著（P＜0.05）。圖2、6B同。

代謝能力是多數(shù)微生物產(chǎn)生能量的主要途徑，可以影響細(xì)胞ATP的生成，呼吸系統(tǒng)也被認(rèn)為是抗菌作物的主要靶點(diǎn)之一[44]。呼吸鏈中脫氫酶介導(dǎo)INT發(fā)生還原反應(yīng)并生成紫紅色甲瓚沉淀，影響OD630 nm。因此，OD630 nm越大，說(shuō)明甲瓚生成速率越快，細(xì)胞代謝活力越強(qiáng)[45]。如圖1B所示，培養(yǎng)3 h后，對(duì)照組的OD630 nm為0.60，BITC（1/2 MIC和MIC）處理后，OD630 nm分別降低至0.45和0.41。培養(yǎng)12 h后，對(duì)照組的OD630 nm為0.47，BITC（1/2 MIC和MIC）處理后，OD630 nm分別降低至0.33和0.29。經(jīng)BITC處理12 h后，MIC處理組與對(duì)照組的OD630 nm間均存在顯著差異（P＜0.05），熒光假單胞菌的代謝活力降低38.30%。說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，BITC對(duì)熒光假單胞菌代謝活力的影響越明顯，這可能歸因于BITC的加入干擾了呼吸鏈脫氫酶氧化還原反應(yīng)的發(fā)生，影響甲瓚的生成，從而導(dǎo)致OD630 nm下降[46]。這些結(jié)果說(shuō)明，BITC可以通過(guò)調(diào)節(jié)熒光假單胞菌呼吸代謝能力影響菌體生理活動(dòng)所需能量，造成呼吸代謝紊亂。

細(xì)菌細(xì)胞膜提供的滲透壓屏障是菌體正常運(yùn)轉(zhuǎn)的重要因素，包括能量轉(zhuǎn)換、代謝調(diào)控及信息傳遞等[47]。BITC的疏水性使其進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞膜，引起膜內(nèi)外滲透壓增加，破壞膜完整性，使細(xì)胞內(nèi)容物如蛋白質(zhì)、核酸、ATP等泄露，菌體形態(tài)發(fā)生腫脹或皺縮，從而抑制細(xì)菌的增殖[48]。

2.3 BITC對(duì)侵染熒光假單胞菌牛肉品質(zhì)的影響

2.3.1 BITC對(duì)侵染熒光假單胞菌牛肉菌落總數(shù)的影響

菌落總數(shù)可以直接反映牛肉被微生物侵染的程度，是評(píng)判牛肉新鮮度的重要指標(biāo)。當(dāng)牛肉微生物菌落總數(shù)大于6（lg（CFU/mL））時(shí)，就可以被認(rèn)定為變質(zhì)牛肉[49]。如圖2所示，各組的菌落總數(shù)隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。這可能由于牛肉中游離氨基酸和水溶性蛋白質(zhì)等較為豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)引起微生物的富集生長(zhǎng)[50]。對(duì)照、1/2 MIC和MIC組的初始菌落總數(shù)約為3.8（lg（CFU/mL））。對(duì)照組貯藏第5天的菌落總數(shù)明顯上升，在第6天超過(guò)

6（lg（CFU/mL）），已經(jīng)達(dá)到腐敗標(biāo)準(zhǔn)。1/2 MIC處理組在第0～4天內(nèi)生長(zhǎng)緩慢，可能由于BITC短暫影響熒光假單胞菌的生長(zhǎng)繁殖。第5天后，熒光假單胞菌趨于正常生長(zhǎng)，這歸因于低濃度BITC難以維持長(zhǎng)期、有效的抑制效果，但牛肉仍屬于新鮮肉標(biāo)準(zhǔn)。MIC處理組在第3天的熒光假單胞菌菌落總數(shù)為3.69（lg（CFU/mL）），明顯低于對(duì)照組，這種現(xiàn)象可能與BITC和冷藏溫度共同作用相關(guān)。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落總數(shù)緩慢上升，而1/2 MIC和MIC處理組在1 周之內(nèi)仍符合新鮮牛肉的標(biāo)準(zhǔn)，與對(duì)照組相比，1 周內(nèi)1/2 MIC和MIC處理組的菌落總數(shù)抑制率分別為26.32%和35.73%，說(shuō)明BITC可以通過(guò)抑制牛肉中熒光假單胞菌的生長(zhǎng)延長(zhǎng)牛肉保持新鮮度的時(shí)間。此外，1/2 MIC和MIC處理組在第2天開(kāi)始出現(xiàn)菌落總數(shù)的顯著性差異（P＜0.05），雖然在第7天時(shí)1/2 MIC處理組的菌落總數(shù)仍然保持在安全范圍內(nèi)，但仍有較為明顯的增長(zhǎng)。而MIC處理組的菌落總數(shù)基本不變。

微生物是導(dǎo)致低溫貯藏肉類及水產(chǎn)品腐敗的關(guān)鍵因素，假單胞菌是其中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[51]。潘瑩等[52]研究顯示，荷葉提取物及曲酸單獨(dú)或聯(lián)合作用于牛肉中，均可有效抑制假單胞菌等微生物的生長(zhǎng)繁殖；楊勝平等[53]研究發(fā)現(xiàn)，牛至精油對(duì)三文魚(yú)中的熒光假單胞菌具有較好的抑制能力，貯藏12 d后，牛至精油處理組較對(duì)照組菌落總數(shù)減少1.34（lg（CFU/mL））；Li Zhaolun等[34]研究表明，BITC可有效抑制雞肉中的微生物生長(zhǎng)，降低生鮮雞肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的含量。綜上所述，已有研究均與本研究有類似結(jié)果，BITC可有效抑制腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)肉制品貨架期。

2.3.2 BITC對(duì)侵染熒光假單胞菌牛肉色差的影響

微生物如細(xì)菌、霉菌等在肉類表面或內(nèi)部生長(zhǎng)，其代謝活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生酸性物質(zhì)、酶和其他化合物，這些物質(zhì)可能會(huì)與肉類中的色素相互作用，導(dǎo)致色素的分解或變化，從而影響肉類的顏色[54]。如圖3所示，對(duì)照組的ΔE在貯藏過(guò)程中不斷升高，并在第4天出現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，這是由于牛肉在貯藏過(guò)程中與空氣接觸，熒光假單胞菌可以較好地生長(zhǎng)。牛肉中的肌紅蛋白逐步被氧化成高鐵肌紅蛋白，失去鮮紅的色澤，并伴隨脂質(zhì)氧化，導(dǎo)致L*、a*和b*呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，進(jìn)而促進(jìn)ΔE的增加[55-56]。在1/2 MIC處理組中，前3 d的ΔE趨于穩(wěn)定，在第4天有較為明顯的上升。MIC處理組可以將新鮮牛肉的顏色保持4 d，在第5天時(shí)出現(xiàn)明顯的變化。此外，MIC處理組貯藏第7天ΔE的變化遠(yuǎn)低于對(duì)照組牛肉，與對(duì)照組相比，1 周內(nèi)MIC處理組的牛肉ΔE降低21.52%，原因可能是MIC通過(guò)抑制熒光假單胞菌的生長(zhǎng)降低牛肉TVB-N含量，阻斷其氧化反應(yīng)的發(fā)生，減緩牛肉的顏色變化。

2.3.3 BITC對(duì)侵染熒光假單胞菌牛肉pH值的影響

微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分解肉類中的蛋白質(zhì)、碳水化合物等，釋放出氨、胺等堿性產(chǎn)物，這些堿性產(chǎn)物可能會(huì)提高肉類的pH值[57]。如圖4所示，牛肉貯藏7 d時(shí)1/2 MIC和MIC處理組的pH值明顯低于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，1/2 MIC和MIC處理組可以延緩1.53%和4.53%的牛肉pH值上升。此外，MIC處理組的pH值極為穩(wěn)定，說(shuō)明BITC可以通過(guò)抑制熒光假單胞菌減少牛肉中蛋白質(zhì)和碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解，穩(wěn)定牛肉pH值。

pH值是評(píng)價(jià)肉類品質(zhì)的重要指標(biāo)，冷鮮肉中pH值的變化程度與肌肉蛋白特性有關(guān)，進(jìn)而影響肉類品質(zhì)[58]。在本研究中，pH值處于上升的趨勢(shì)，這可能是由于牛肉中糖原含量下降導(dǎo)致糖酵解速率減緩，以及牛肉中增殖的熒光假單胞菌等微生物和內(nèi)源性蛋白酶降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生堿性氨基酸所致[59]。BITC的加入有效緩解pH值的上升，可能是由于其對(duì)熒光假單胞菌的有效抑制減少了堿性物質(zhì)的產(chǎn)生，保持牛肉品質(zhì)。

2.3.4 BITC對(duì)侵染熒光假單胞菌牛肉TVB-N含量的影響

肉類中的TVB-N主要包括揮發(fā)性堿和氨等。微生物可能對(duì)肉類TVB-N含量產(chǎn)生影響，其影響主要來(lái)自微生物的代謝活動(dòng)和腐敗過(guò)程[60]。如圖5所示，各組牛肉的TVB-N含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，尤其是對(duì)照組與1/2 MIC處理組牛肉，這可能由于上述2 組牛肉適合熒光假單胞菌生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物和酶類物質(zhì)增多，加速了牛肉中氮氧化合物降解，從而使TVB-N含量上升[52]。各處理組初始TVB-N含量約為10 mg/100 g，BITC處理組的TVB-N含量始終低于對(duì)照組，MIC處理組貯藏7 d時(shí)的TVB-N含量相比于對(duì)照組降低54.39%。目前的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定牛肉中TVB-N含量的變質(zhì)閾值為0.2 mg/g[61]，

對(duì)照組第7天的TVB-N含量已經(jīng)接近該閾值，而B(niǎo)ITC處理組仍處于鮮肉標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明BITC處理可有效緩解TVB-N的生成。

2.3.5 BITC對(duì)侵染熒光假單胞菌牛肉電子鼻測(cè)定結(jié)果的影響

如圖6A所示，電子鼻W5S傳感器對(duì)牛肉樣品的響應(yīng)值較其他傳感器更強(qiáng)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，W5S傳感器信號(hào)強(qiáng)度持續(xù)增加，說(shuō)明在貯藏過(guò)程中產(chǎn)生了氮氧化合物。氮氧化合物主要來(lái)源于氨基酸和還原糖之間的美拉德反應(yīng)，其香氣閾值較低，是肉制品中重要的呈味物質(zhì)，并與熒光假單胞菌生長(zhǎng)有一定關(guān)系[62]。如圖6B所示，與貯藏第1天相比，貯藏第7天對(duì)照組W5S傳感器響應(yīng)值上升141.89%，說(shuō)明熒光假單胞菌使牛肉逐漸變質(zhì)，產(chǎn)生大量氮氧化合物。貯藏第7天時(shí)，1/2 MIC和MIC處理組的信號(hào)強(qiáng)度相比于對(duì)照組分別降低1.51%和4.78%，說(shuō)明BITC處理具有延緩牛肉腐敗的作用，降低牛肉中氮氧化物的產(chǎn)生，以達(dá)到保鮮作用。

在肉類風(fēng)味和品質(zhì)評(píng)定方面，電子鼻技術(shù)常用于對(duì)不同肉類揮發(fā)性氣味的檢測(cè)，其主要通過(guò)風(fēng)味識(shí)別、肉質(zhì)評(píng)估、新鮮度識(shí)別和風(fēng)味調(diào)控等方面對(duì)肉類品質(zhì)進(jìn)行調(diào)控[63]。侯寶睿等[64]研究發(fā)現(xiàn)，使用防腐劑包裝的醬牛肉在18 d之內(nèi)依舊可以達(dá)到保鮮的效果。沈秋霞等[39]通過(guò)電子鼻技術(shù)快速判斷不同冷藏時(shí)間三文魚(yú)片揮發(fā)性物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)氮氧化合物可導(dǎo)致真空包裝三文魚(yú)片發(fā)生腐敗變質(zhì)現(xiàn)象。這些研究均與本研究結(jié)果一致，說(shuō)明BITC可有效改善牛肉風(fēng)味，延緩牛肉腐敗變質(zhì)。

2.3.6 BITC對(duì)侵染熒光假單胞菌牛肉感官評(píng)分的影響

如圖7所示，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，各組別的感官評(píng)分均下降，由于熒光假單胞菌代謝過(guò)程中利用氨基酸，釋放氨氣等刺激性氣體，進(jìn)而導(dǎo)致牛肉感官品質(zhì)發(fā)生劣變[65]。BITC處理組評(píng)分始終高于對(duì)照組，且1 周內(nèi)感官評(píng)分較對(duì)照組相比提高10.45%，可能是因?yàn)锽ITC抑制熒光假單胞菌的增殖，降低蛋白質(zhì)分解速率并減弱氨氧化合物的生成[66]。貯藏第4天各處理組牛肉感官評(píng)分下降趨勢(shì)顯著，說(shuō)明牛肉的感官品質(zhì)已經(jīng)發(fā)生改變，BITC處理保證了牛肉的品質(zhì)，達(dá)到延長(zhǎng)牛肉貨架期的作用。

3 結(jié) 論

本研究以BITC為抑制劑，研究其對(duì)熒光假單胞菌的抑菌活性及應(yīng)用于牛肉中的保鮮效果。結(jié)果表明：BITC對(duì)熒光假單胞菌的MIC為0.25 mmol/L，能夠破壞熒光假單胞菌細(xì)胞膜的通透性及代謝活性；此外，在貯藏第7天時(shí)，與對(duì)照組相比，MIC處理組牛肉中的熒光假單胞菌數(shù)量、ΔE、pH值、TVB-N含量、氮氧化合物含量及感官評(píng)分均明顯改善。綜上所述，BITC作為天然抑制劑及可使用的食品添加劑，能夠有效抑制熒光假單胞菌的生長(zhǎng)并延長(zhǎng)冷鮮牛肉貨架期，在肉類的冷藏保鮮中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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