原增艷等

【摘 要】目的：探討金銀花葉總黃酮的體外抑菌作用。方法：采用管碟法及微量稀釋法，測定不同濃度的總黃酮對(duì)不同病原微生物的抑菌效果及最小抑菌濃度。結(jié)果：金銀花葉總黃酮提取物對(duì)6種菌株均有抑制作用，金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌對(duì)金銀花葉總黃酮最敏感，抑菌圈直徑>15mm，MIC≥1；金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐甲氧西林耐藥菌株對(duì)金銀花葉總黃酮的敏感度無明顯差異。結(jié)論：金銀花葉總黃酮有一定的抑菌作用。

【關(guān)鍵詞】金銀花葉；總黃酮；抑菌作用；最小抑菌濃度

金銀花（Flos Lonicerae）為忍冬科植物，其干燥花蕾或初開的花，具有清熱解毒、抑菌、抗氧化等功效，是常用中藥材之一[1]。但是金銀花的葉片作為副產(chǎn)品，產(chǎn)量很高，一直作為廢棄物被丟棄，沒有得到充分的利用。古代醫(yī)家以人體自身進(jìn)行多次臨床實(shí)踐，得出了“花葉同效”，明朝李時(shí)珍說“忍冬莖葉及花功用皆同”[2]，具有藥效。在金銀花葉中的總黃酮含量是花中的2.78倍[3]，黃酮類化合物有非常廣泛的抗菌作用[4-6]。金銀花葉中總黃酮抗菌作用如何對(duì)金銀花葉的開發(fā)利用至關(guān)重要，因此，本文對(duì)金銀花葉中總黃酮進(jìn)行粗提，初步探討金銀花葉片中的總黃酮的體外抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

金銀花葉：河南封丘，新鄉(xiāng)博凱生物技術(shù)有限公司加工，系5月份第一茬花，將其上葉片取下，晾干，粉碎，過40目篩，備用。

菌株：大腸埃希菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）、肺炎鏈球菌（ATCC49619）、臨床分離MRSA菌株253、254。以上菌種均由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院臨床微生物學(xué)與免疫學(xué)檢教研室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮的提取

稱取金銀花葉粉末30g，按固液比1：10加入75%乙醇，于70℃提取1.5h，抽濾，濾渣再加入300mL75%乙醇，提取1h抽濾，合并兩次提取液，減壓蒸除溶劑；濃縮后提取液加適量水溶解，石油醚脫色，取下層液體；再用乙酸乙酯萃取，每次100mL，萃取至溶劑層無色；合并上層液體，減壓濃縮，濃縮后的提取物即為金銀花葉的總黃酮。

1.2.2 菌懸液的制備

將供試菌株在血平板上活化，以無菌生理鹽水配制菌液，用MHA肉湯調(diào)整菌液濃度至1×105cfu/mL。

1.2.3 抑菌效果的測定

采用管碟法，在無菌條件下，吸取已配制好的菌懸液100μL放入MH培養(yǎng)基上，用無菌棉簽涂抹涂勻，稍干后在每個(gè)平皿內(nèi)等間距的放入3個(gè)無菌鋼管，靜止5min。以無菌生理鹽水為空白對(duì)照，每孔加微孔過濾器滅菌的10mg/mL總黃酮100μL，將平皿蓋好，37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18-24h后，用游標(biāo)卡尺測量清晰抑菌圈直徑（mm），每種提取物平行6次。肺炎鏈球菌需CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。抑菌效果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]：以抑菌圈直徑>20mm為極敏，抑菌圈直徑在15-20mm之間為高敏，抑菌圈直徑在10-14mm之間為中敏，抑菌圈直徑<10mm為低敏，無抑菌圈為耐藥。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測定

采用微量稀釋法，將總黃酮用MH肉湯倍比稀釋成32、16、8、4、2、1、0.5mg/mL6個(gè)梯度濃度，各取100μL依次加入96孔板，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)。每孔加入濃度為1×105cfu/mL的菌懸液，使各孔藥終濃度從依次為16、8、4、2、1、0.5、0.25mg/mL。以不加菌懸液的總黃酮為陰性對(duì)照，37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。所有陰性對(duì)照孔培養(yǎng)基澄清，說明本實(shí)驗(yàn)方法可行?？椎撞壳逦怀霈F(xiàn)菌體沉淀的最低抗菌藥物濃度，即為該菌的最小抑菌濃度（MIC）。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 金銀花葉總黃酮提取物對(duì)不同菌株的抑菌效果比較

結(jié)果見表1，由試驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)總黃酮濃度在10mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌菌株ATCC25923及MRSA254、肺炎鏈球菌抑菌圈直徑大于20mm，抑菌效果極度敏感；MRSA253、銅綠假單胞菌抑菌圈直徑在10-20mm，對(duì)總黃酮高度敏感；大腸埃希菌的抑菌圈直徑在10-15mm，抑菌效果為中度敏感。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株與耐藥菌株對(duì)總黃酮的敏感度無顯著差異。

2.2 金銀花葉總黃酮提取物對(duì)不同菌株的最低抑菌濃度比較

結(jié)果見表2，金銀花葉的總黃酮提取物對(duì)6種的菌株有不同程度的抗菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的抑菌效果要強(qiáng)于大腸埃希菌及銅綠假單胞菌的抑菌活性；總黃酮對(duì)ATCC25923、MRSA254、ATCC49619的抑菌活性最強(qiáng)，MIC達(dá)到0.5mg/mL，對(duì)ATCC25922的抑菌活性最弱。

3 討論

隨著抗生素的濫用，耐藥菌株不斷增加，出現(xiàn)逐年上升的趨勢，中藥抑菌成分較多，可作用于細(xì)菌的不同部位和繁殖的不同階段，使病原微生物不易產(chǎn)生耐藥性，因此，中醫(yī)藥預(yù)防和治療感染性疾病近年來受到越來越多的關(guān)注，從天然植物中提取抗菌成分開發(fā)新型抗菌藥的重要組成部分。研究表明，黃酮具有較好的抑菌效果，很多學(xué)者已經(jīng)從丁香、烏飯樹、白花蛇舌草等植物中提取黃酮，證明其較好的抑菌活性[4-6]。金銀花葉中黃酮含量比常用藥材金銀花中的黃酮含量要高，筆者對(duì)金銀花葉中總黃酮進(jìn)行粗提，針對(duì)4種常見病原菌做了藥敏試驗(yàn)及MIC的測定，由結(jié)果可見，金銀花葉總黃酮對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株都有抑制作用，其中對(duì)肺炎鏈球菌及金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好。針對(duì)目前常見耐藥菌株，本文選用臨床篩選的兩株耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌做抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，金銀花葉總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌耐藥菌株的抑制作用與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比無顯著差異，金銀花葉總黃酮的抑菌作用可能不受耐藥菌株變異位點(diǎn)的影響，還有待于進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1]林段嫦，宋勁詩.金銀花中綠原酸提取工藝探討[J].中成藥，1994，16（7）：16-17.

[2]林國通.中藥學(xué)[M].長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1985，64.

[3]張寧，曹光群.金銀花葉的抑菌活性和抗氧化性研究[J].牙膏工業(yè)，2009，3：29-33.

[4]王宇習(xí).丁香葉總黃酮的提取液工藝及抑菌效果評(píng)價(jià)[D].黑龍江：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[5]張海燕，王立，張暉.烏飯樹樹葉水溶性黃酮的抑菌作用的研究[J].中國食品添加劑，2010（5）：62-67.

[6]王宇翔，張艷，方明，等.白花蛇舌草總黃酮的抗炎和抗菌作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2005，21（3）：348-350.

[7]蔣放軍.湘蕾金銀花提取物體外抑菌及抗氧化作用研究[D].湖南：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[責(zé)任編輯：湯靜]