摘要： 利用固體顆粒（復(fù)合納米顆粒）穩(wěn)定油水界面的特性，制備玉米醇溶蛋白蝦青素納米顆粒（ZeinAST NPs）和玉米醇溶蛋白蝦青素阿拉伯膠復(fù)合納米顆粒（ZeinASTGA NPs），并比較它們的穩(wěn)定性差異。以ZeinASTGA NPs為穩(wěn)定劑，使用含AST的玉米油制備Pickering乳液，研究乳液中AST的穩(wěn)定性、體外釋放率和大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：油相中含有AST的Pickering乳液（PE1）比油相中不含AST的Pickering乳液（PE2）具有更好的熱穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性，且PE1具有較強(qiáng)的自由基清除能力，釋放速率優(yōu)于參比制劑和PE2，AST的釋放符合菲克擴(kuò)散規(guī)律；口服PE1后8 h達(dá)到最大AST血漿質(zhì)量濃度（2.654 μg·mL-1），且相對(duì)生物利用度分別是市售蝦青素微囊粉（ASTMCs）和PE2的1.703，1.481倍。

關(guān)鍵詞： 蝦青素； Pickering乳液； 穩(wěn)定性； 生物利用度

中圖分類號(hào)： R 944.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A"" 文章編號(hào)： 1000-5013（2024）06-0756-10

Preparation and Evaluation of Astaxanthin Composite Nanoparticles Pickering Emulsion

ZHENG Xiumei1， DU Xin1， LIU Peizhong1， YU Wenxi1，WU Zhen2， WANG Liqiang1， HOU Zhiyong1，3

（1. School of Biomedical Sciences， Huaqiao University， Quanzhou 362021， China；

2. School of Pharmaceutical Sciences， Xiamen University， Xiamen 361102， China；

3. 962 Hospital of Liberation Army， Harbin 150080， China）

Abstract： The property of solid particles （composite nanoparticles） to stabilize the oil-water interface was utilized to prepare corn zein-solubilized protein-astaxanthin nanoparticles （Zein-AST NPs） and corn zein-solubilized protein-astaxanthin-arabic gum composite nanoparticles （Zein-AST-GA NPs）， and their stability differences were compared. Using Zein-AST-GA NPs as stabilizer， Pickering emulsion was prepared using corn oil containing AST. The stability， in vitro release rate， and in vivo pharmacokinetics in rats of AST in the emulsion were studied. The experimental results show that the Pickering emulsion containing AST （PE1） in the oil phase has better thermal and storage stability than the Pickering emulsion without AST in the oil phase （PE2）， and PE1 has stronger free radical scavenging ability with a release rate superior to that of the reference formulation and PE2， and the release of AST is in accordance with Fick′s diffusion law. The maximum AST plasma mass concentration （2.654 μg·mL-1） is reached 8 hours after oral administration of PE1， and the relative bioavailability are 1.703 and 1.481 times higher than that of commercially available astaxanthin microcapsule powder （AST-MCs） and PE2， respectively.

Keywords：astaxanthin； Pickering emulsion； stability； bioavailability

蝦青素（astaxanthin，AST）是一種脂溶性營(yíng)養(yǎng)素［1］，雨生紅球藻是天然AST的最佳獲取來(lái)源之一［2］。由于AST化學(xué)結(jié)構(gòu)中的多烯鏈可有效清除細(xì)胞膜磷脂雙分子層之間的自由基，化學(xué)結(jié)構(gòu)中的β紫羅蘭酮環(huán)上的羥基和酮基能吸引自由基未配對(duì)電子或向自由基提供電子，因此，AST具有較強(qiáng)的抗氧化活性、抗炎活性、抗癌活性、抗肥胖和抗糖尿病活性等［36］。由于AST難溶于水，且化學(xué)結(jié)構(gòu)中共軛雙鍵使其在光、氧和熱等條件下易發(fā)生氧化降解，導(dǎo)致AST存在穩(wěn)定性差和口服生物利用度低等缺點(diǎn)。

乳液是保護(hù)生物活性物質(zhì)免受降解的給藥途徑之一，可增強(qiáng)生物活性物質(zhì)的物理、化學(xué)穩(wěn)定性，可提高生物利用度，并實(shí)現(xiàn)靶向遞送和控制釋放［7］。Pickering乳液以固體顆粒為穩(wěn)定劑，固體顆粒吸附在油水界面處，形成密集的界面層，防止聚集現(xiàn)象和奧斯瓦爾德熟化，具有更高的穩(wěn)定性［8］。Pickering乳液界面處顆粒形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可改變脂質(zhì)消化，實(shí)現(xiàn)藥物的緩釋釋放，提高藥物的生物利用度。多糖（如殼聚糖和纖維素等）與蛋白質(zhì)相互作用形成的復(fù)合納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液具有更強(qiáng)的乳化性能和更厚的界面層［9］?；诖耍疚膶?duì)蝦青素復(fù)合納米顆粒Pickering乳液的進(jìn)行制備及評(píng)價(jià) 。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；BSA124S型電子天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）；高效液相色譜儀（遼寧省大連市依利特公司）；78HW1型恒溫磁力攪拌器（江蘇省金壇市環(huán)宇科技儀器廠）；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（湖南省長(zhǎng)沙市湘儀實(shí)驗(yàn)儀器）；RC806D型溶出實(shí)驗(yàn)儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；pH測(cè)定儀（廣東省廣州市授科儀器科技有限公司）；納米粒度及ZETA電位分析儀（美國(guó)布魯克海文儀器公司）；真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興生物技術(shù)有限公司）；JEM1200EX型透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；Nicolet iS10型傅里葉紅外光譜儀（美國(guó)Nicolet儀器公司）；D8 Advance X型射線衍射儀（德國(guó)Bruker Optics儀器公司）；STA449F5型同步熱分析儀（德國(guó)Netzsch儀器公司）；高速剪切機(jī)（美國(guó)布魯克海文儀器公司）；BT9300ST型激光粒度分布儀（遼寧省丹東市百特儀器有限公司）；MCR302型流變儀（上海市安東帕（上海）商貿(mào)有限公司）；光學(xué)顯微鏡（廣東省廣州市明美光電技術(shù)有限公司）；倒置熒光顯微鏡（日本尼康）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

雨生紅球藻油、市售蝦青素微囊粉（安徽省黃山市德寶生物科技有限公司）；玉米油、蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品、玉米醇溶蛋白、阿拉伯膠、磷酸鹽緩沖鹽溶液（上海市阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙醇、二氯甲烷、甲醇（廣東省汕頭市西隴科學(xué)股份有限公司）；丙酮、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、無(wú)水乙醚（上海市國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；尼羅紅、尼羅藍(lán)A（上海市易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；吐溫80、胰蛋白酶、胃蛋白酶、水合氯醛（上海市源葉生物科技有限公司）；尿素、α淀粉酶、脂肪酶、豬膽鹽（上海市易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 玉米醇溶蛋白蝦青素阿拉伯膠復(fù)合納米顆粒的制備

將玉米醇溶蛋白（Zein）溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液中，室溫條件下磁力攪拌使其完全分散，將pH值調(diào)至3.5，得到質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1的Zein溶液。將Zein溶液與AST溶液（pH值為3.5，0.25 mg·mL-1的AST乙醇溶液）等體積均勻混合，混合液快速注入蒸餾水（5倍混合液體積，pH值為3.5）中，充分?jǐn)嚢瑁ㄔ谑覝叵?，轉(zhuǎn)速為800 r·min-1），在40 ℃下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑。用相同pH值的蒸餾水補(bǔ)充至原有體積，離心（5 000 r·min-1，5 min）除去不溶性物質(zhì)，得到玉米醇溶蛋白蝦青素納米顆粒（ZeinAST NPs）分散液。

稱取一定質(zhì)量的阿拉伯膠（Gum Arabic，GA）溶于蒸餾水中，使用磁力攪拌器使溶液完全溶脹，將pH值調(diào)至3.5，形成GA溶液。將GA溶液加入到ZeinAST NPs分散液中，GA和Zein的質(zhì)量比為1.0∶1.5，磁力攪拌2 h（在室溫下，轉(zhuǎn)速為800 r·min-1），離心（5 000 r·min-1，5 min）去除不溶性物質(zhì)，得到ZeinASTGA NPs分散液，最終得到的玉米醇溶蛋白蝦青素阿拉伯膠復(fù)合納米顆粒（ZeinASTGA NPs）分散液中Zein的質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1。ZeinASTGA NPs分散液在-20 ℃下，冷凍12 h后，用真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥24 h，得到ZeinASTGA NPs。

2.2 Pickering乳液的制備

以體積分?jǐn)?shù)為30%的玉米油為油相，向玉米油中加入質(zhì)量濃度為0.03 mg·mL-1的AST，在12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下，將含有AST的玉米油緩慢滴入質(zhì)量濃度為6.25 mg·mL-1的ZeinASTGA NPs分散液中，滴加結(jié)束后，繼續(xù)剪切3 min，得到Pickering乳液。

2.3 傅里葉變換紅外光譜

將2 mg ZeinAST NPs粉末和2 mg ZeinASTGA NPs粉末分別與KBr混合，將混合物研磨成細(xì)粉并壓制成透明薄片，采用傅里葉變換紅外吸收光譜儀進(jìn)行測(cè)量分析。光譜采集的波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描32次。

2.4 X射線衍射

以2°·min-1的掃描速率記錄5°～45°的衍射圖。管電壓為40 kV，管電流為40 mA。

2.5 掃描電子顯微鏡

使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察ZeinAST NPs和ZeinASTGA NPs的微觀形貌，使用毛細(xì)管將新鮮制備的樣品點(diǎn)在錫箔紙上，在室溫條件下自然晾干并噴金鍍膜，使用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡在15 kV的加速電壓下記錄SEM圖像。

2.6 乳液的類型

將Pickering乳液分別滴加到純玉米油或純蒸餾水中，如果乳液液滴能夠在水相中迅速分散并在油相中保持團(tuán)聚，則認(rèn)為它是水包油（O/W）型乳液，反之，則認(rèn)為它為油包水（W/O）型乳液。

2.7 乳液微觀結(jié)構(gòu)特征

將一滴稀釋5倍后的乳液滴加到光學(xué)顯微鏡的載玻片上，用蓋玻片覆蓋后，放置在載物臺(tái)上觀察其形態(tài)。為進(jìn)一步驗(yàn)證ZeinASTGA NPs吸附在油水界面上，使用倒置熒光顯微鏡對(duì)Pickering乳液進(jìn)行觀察。將每個(gè)樣品稀釋5倍，用尼羅紅染色油相和尼羅藍(lán)A對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。

2.8 流變學(xué)特征

采用MCR 302型流變儀研究不同油相體積分?jǐn)?shù)（10%，20%，30%，40%，50%，60%）的Pickering乳液流變行為，鋼制平行板直徑為40 mm，間隙為1 mm。每次測(cè)量取適量Pickering乳液平鋪于平板上，在室溫下進(jìn)行測(cè)量。在剪切速率為0.1～100.0 s-1范圍內(nèi)測(cè)量表觀粘度，繪制剪切速率粘度曲線。在0.1～100.0 Hz范圍內(nèi)進(jìn)行頻率掃描，應(yīng)變?yōu)?%，測(cè)量?jī)?chǔ)能模量和損耗模量與頻率的關(guān)系。

2.9 乳析指數(shù)

采用乳析指數(shù)（IC）評(píng)價(jià)乳液的穩(wěn)定性，測(cè)量并記錄不同穩(wěn)定性條件下每個(gè)乳液的總高度（Ht）和乳化相高度（Hs）。IC的計(jì)算公式為

IC=Hs/Ht×100%。

2.10 乳液的穩(wěn)定性

將Pickering乳液避光貯藏，在4 ℃條件下，分別測(cè)定0，10，30，60，90，120，360 d乳液的乳析指數(shù)，采用光學(xué)顯微鏡觀察乳液的微觀形態(tài)，并計(jì)算乳液中AST保留率。

2.11 乳液中蝦青素的穩(wěn)定性

以ZeinASTGA NPs為穩(wěn)定劑，以含AST的玉米油為油相（油相AST的質(zhì)量濃度為0.03 mg·mL-1），按節(jié)2.2的方法制備Pickering乳液，乳液中AST的質(zhì)量濃度為0.054 3 mg·mL-1，記為PE1，如圖1 （a）所示。

以ZeinASTGA NPs為穩(wěn)定劑，以純玉米油為油相，按節(jié)2.2的方法制備Pickering乳液，乳液中AST的質(zhì)量濃度為0.054 3 mg·mL-1，記為PE2，如圖1（b）所示。

ZeinASTGA NPs，如圖1（c）所示。AST，如圖1（d）所示。

2.12 體外釋放實(shí)驗(yàn)

分別以200 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Tween 80溶液的SGF（模擬胃液），SIF（模擬腸液）為溶出介質(zhì)，將等AST濃度的AST丙酮溶液、市售蝦青素微囊粉（ASTMCs）溶液、PE2和PE1分別裝入處理好的透析袋（相對(duì)分子質(zhì)量為14 000）中，將透析袋分別置于溶出介質(zhì)中，在溫度為（37.0±0.5） ℃，攪拌速度為100 r·min-1的條件下，分別于0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，48.0 h從釋放的溶出介質(zhì)中取2 mL樣品溶液，并加入相同體積的空白溶出介質(zhì)。將取出的2 mL樣品溶液與2 mL的丙酮溶液混合均勻，用0.45 μm的濾膜除去雜質(zhì)，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)479.5 nm處測(cè)量AST吸光度，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的藥物累計(jì)釋放率，藥物累計(jì)釋放率（ηa）為

ηa=ρtV+∑n-1i=1ρiVsm0×100%。

上式中：ρt為取樣時(shí)間點(diǎn)t時(shí)AST的質(zhì)量濃度；ρi為取樣時(shí)間點(diǎn)的前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)i的AST質(zhì)量濃度；V為溶出介質(zhì)的總體積；Vs為取樣的體積；m0為AST總質(zhì)量。

2.13 大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

取24只健康雄性SD（白色封閉群）大鼠，將等質(zhì)量濃度的AST玉米油、市售ASTMCs、PE2和PE1隨機(jī)分為4組（n=6）。AST玉米油組、市售ASTMCs組和PE2組為對(duì)照組，PE1組為實(shí)驗(yàn)組。每組大鼠給藥前禁食12 h，不禁水，分別以劑量為100 mg·kg-1進(jìn)行灌胃。灌胃結(jié)束后分別于0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，48.0 h對(duì)大鼠眼眶取約0.5 mL血，置于用肝素鈉處理過(guò)的EP管中。將血漿樣品進(jìn)行處理后，使用高效液相分析方法進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算AST質(zhì)量濃度。以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，AST質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制血藥質(zhì)量濃度時(shí)間曲線圖。用Data Analysis System（DSA）軟件以非房室模型進(jìn)行分析計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及相對(duì)生物利用度（F）。F的計(jì)算式為

F=AUC（0～∞），TAUC（0～∞），ASTO×100%。

上式中：AUC（0～∞），T為試制劑的藥物質(zhì)量濃度時(shí)間曲線下面積（時(shí)間為0～∞）；AUC（0～∞），ASTO為AST玉米油的藥物質(zhì)量濃度時(shí)間曲線下面積（時(shí)間為0～∞）。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 傅里葉變換紅外光譜

傅里葉變換紅外（FTIR）光譜通常用于研究復(fù)合物中潛在的相互作用，因此，測(cè)定了Zein，GA，AST，Zein NPs，ZeinAST NPs，ZeinASTGA NPs的FTIR光譜（圖2）。圖2中：ν為波數(shù)。由圖2可知如下2點(diǎn)結(jié)論。

1） 在FTIR中，波數(shù)為3 100～3 500 cm-1的吸收峰是由于羥基的O-H拉伸振動(dòng)［10］引起的，在Zein，GA和AST的FTIR光譜中，氫鍵的特征峰波數(shù)分別為3 424.02，3 424.95和3 495.50 cm-1；Zein NPs氫鍵的特征峰波數(shù)為3 416.49 cm-1；在ZeinAST NPs和ZeinASTGA NPs的光譜中，氫鍵的特征峰波數(shù)移動(dòng)至3 427.33 cm-1和3 416.27 cm-1處，表明在Zein，AST和GA之間形成了氫鍵。

2） 蛋白質(zhì)在波數(shù)為1 650～1 700 cm-1處的吸收峰代表酰胺Ⅰ帶，在波數(shù)為1 500～1 550 cm-1處的吸收峰代表酰胺Ⅱ帶［11］，酰胺Ⅰ，Ⅱ帶分別為C＝O的拉伸和C－N的拉伸。在FTIR光譜中，Zein在波數(shù)為1 656.17 cm-1處顯示了一個(gè)酰胺Ⅰ帶，在波數(shù)為1 537.15 cm-1處顯示了一個(gè)酰胺Ⅱ帶；Zein NPs的酰胺Ⅰ帶未發(fā)生移動(dòng)，酰胺Ⅱ帶的特征峰移至波數(shù)為1 535.50 cm-1；AST的FTIR光譜在波數(shù)為1 650.82 cm-1處顯示了C＝O的拉伸振動(dòng)，在波數(shù)為1 551.63 cm-1處顯示六元原子環(huán)C－C的拉伸震動(dòng)，在波數(shù)為976.42 cm-1處顯示C，C共軛中C－H的拉伸振動(dòng)，在波數(shù)為976.42 cm-1處的吸收峰消失了；ZeinAST NPs的酰胺Ⅰ，Ⅱ帶分別移至波數(shù)為1 653.96，1 536.14 cm-1處，表明Zein和AST之間存在靜電相互作用，同時(shí)，Zein和AST都具有疏水性，說(shuō)明Zein和AST之間可能存在疏水相互作用，疏水相互作用也可能是形成ZeinAST NPs的另一種作用力；ZeinASTGA NPs形成后，在波數(shù)為1 656.19，1 540.32 cm-1處顯示出酰胺Ⅰ，Ⅱ帶，表明Zein，AST和GA之間發(fā)生了靜電相互作用，與ZeinAST NPs相比，ZeinASTGA NPs在波數(shù)為1 072.62 cm-1處顯示了一個(gè)特征峰，這是GA的特征峰，表明GA已經(jīng)吸附到Zein表面，表明Zein，AST和GA之間可能存在氫鍵相互作用和疏水相互作用等。

3.2 X射線衍射分析

使用X射線衍射（XRay Diffraction，XRD）法分析Zein，GA，AST，Zein NPs，ZeinAST NPs，ZeinASTGA NPs的光譜，X射線衍射譜圖，如圖3所示。

由圖3可知：Zein在9°和19°顯示出兩個(gè)寬衍射峰，表明蛋白質(zhì)的無(wú)定形性質(zhì)；GA在19°顯示出一個(gè)寬衍射峰，表明天然多糖的無(wú)定形性質(zhì)；AST在11.2°，13.9°，14.4°，16.5°，18.6°，20.8°和25.7°具有尖銳的吸收峰，表明AST的存在形式為高結(jié)晶結(jié)構(gòu)；在ZeinAST NPs和ZeinASTGA NPs的XRD光譜中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)AST的特征衍射峰，表明AST可能通過(guò)與Zein之間的疏水相互作用，以無(wú)定形的形態(tài)分布在納米顆粒中；ZeinASTGA NPs的峰值低于ZeinAST NPs的峰值，表明Zein與GA之間存在分子間的相互作用；與未包埋AST的Zein NPs相比，ZeinAST NPs的衍射峰強(qiáng)度更高，說(shuō)明Zein和AST之間存在分子間的相互作用。

3.3 掃描電子顯微鏡分析

采用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)ZeinAST NPs和ZeinASTGA NPs的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，掃描電鏡圖，如圖4所示。

由圖4可知：ZeinAST NPs呈球形，表面光滑，粒徑約為100 nm，與納米粒度儀測(cè)定的結(jié)果相對(duì)應(yīng)；添加GA后，ZeinASTGA NPs的粒徑變大，并觀察到復(fù)合納米顆粒之間相互連接，表明GA和Zein之間的交聯(lián)可能不止發(fā)生在分子內(nèi)部，還可能發(fā)生在分子間，導(dǎo)致顆粒之間形成團(tuán)塊。

3.4 Pickering乳液類型和微觀結(jié)構(gòu)

Pickering乳液的類型對(duì)比，如圖5所示。由圖5可知：乳液液滴在水相中均勻分散，在油相中保持團(tuán)聚。借助倒置熒光顯微鏡觀察ZeinASTGA NPs穩(wěn)定的Pickering乳液的界面結(jié)構(gòu)。

倒置熒光顯微鏡圖，如圖6所示。由圖6可知：油相被尼羅紅染色呈現(xiàn)綠色；由蛋白質(zhì)組成的ZeinASTGA NPs被尼羅藍(lán)A染色呈現(xiàn)紅色；組合尼羅紅染色的綠色熒光位于球形液滴中間，液滴周?chē)忻黠@的紅色圓圈，表明ZeinASTGA NPs吸附在了油水界面上，進(jìn)一步確認(rèn)復(fù)合納米顆粒和油相中含AST的Pickering乳液為水包油（O/W）型乳液。

3.5 Pickering乳液的流變性能分析

通過(guò)Pickering乳液的流變形可以更好地了解其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，不同油相體積分?jǐn)?shù)的Pickering乳液流變性，如圖7所示。圖7中：μ為表觀粘度；v為剪切速率；φ為體積分?jǐn)?shù)；f為頻率；G′為儲(chǔ)能模量；G″為損耗模量。

由圖7（a）可知：剪切速率從0.1 s-1增加到100.0 s-1，Pickering乳液的表觀粘度逐漸降低，表明Pickering乳液的剪切稀化行為，這是由于乳液內(nèi)部的結(jié)構(gòu)隨剪切速率的增加而破裂，導(dǎo)致粘度降低；乳液的表觀粘度隨油相體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，這可能是由于ZeinASTGA NPs吸收更多的油滴形成了穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［12］。

由圖7（b）可知：頻率為0.1～100.0 Hz的Pickering的G′和G″隨油相體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，Pickering乳液的G′明顯高于G″，表明Pickering乳液形成了彈性凝膠結(jié)構(gòu)，乳液液滴的相對(duì)密度增大，并在較高的油相體積分?jǐn)?shù)下有更高的G′，較高的G′和G″說(shuō)明Pickering乳液中ZeinASTGA NPs形成的界面層更穩(wěn)定，因此，當(dāng)復(fù)合納米顆粒質(zhì)量濃度固定時(shí)，油相體積分?jǐn)?shù)對(duì)Pickering乳液的流變性能有明顯的影響，增多的油相可以通過(guò)在油水界面形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并在一定程度上抵抗高頻振蕩，增強(qiáng)乳液的穩(wěn)定性［13］。

3.6 乳液的穩(wěn)定性

貯藏時(shí)間對(duì)Pickering乳液的影響，如圖8所示。圖8中：t為貯藏時(shí)間。由圖8可知：隨著貯藏時(shí)間的推移，Pickering乳液的IC略微增加，且乳液液滴的微觀形態(tài)仍然保持著均勻的球形形態(tài)，表明ZeinASTGA NPs穩(wěn)定的Pickering乳液對(duì)乳液液滴的聚集有較好的穩(wěn)定性；貯藏360 d后，Pickering乳液的液滴未出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，表明ZeinASTGA NPs在油滴表面形成的致密界面層，提高了乳液的貯藏穩(wěn)定性。

貯藏時(shí)間對(duì)蝦青素保留率（K）的影響，如圖9所示。在4 ℃下，蝦青素貯藏360 d后，PE1的AST保留率為（92.500±0.100）%，高于PE2的（88.700±0.110）%，表明將AST同時(shí)包封在Pickering乳液的復(fù)合納米顆粒和油滴中可有效提高AST的保留率，可能是因?yàn)槲皆谟退缑嫣帍?fù)合納米顆粒中的AST可保護(hù)油滴內(nèi)部的AST，防止過(guò)多的AST氧化分解。

3.7 體外釋放

體外釋放模擬藥物在體內(nèi)的釋放過(guò)程，考察Pickering乳液在攝入后釋放包封物質(zhì)的能力。當(dāng)口服藥物后，在胃腸道的釋放有助于藥物的吸收，根據(jù)2020版《中華人民共和國(guó)藥典》通則，難溶性藥物可加少許表面活性劑，因此，在兩種溶出介質(zhì)中均添加0.5%的吐溫80以滿足“漏槽條件”。體外釋放曲線，如圖10所示。圖10中：Q為釋放率。

在SGF中釋放48 h后，AST丙酮溶液、市售ASTMCs、PE2和PE1的釋放率分別達(dá)到（14.960±0.052）%，（42.960±0.051）%，（56.800±0.095）%和（47.060±0.044）%。在SGF中，PE2的釋放率更高的可能是因?yàn)樵诘蚿H值環(huán)境下，Zein和GA之間的靜電相互作用減少，ZeinASTGA NPs穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致復(fù)合納米顆粒中的AST釋放增加，PE1中復(fù)合納米顆粒中AST質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少，復(fù)合納米顆粒分布在油水界面處形成屏障，導(dǎo)致油滴內(nèi)部的AST溶出緩慢，釋放率較低。

在SIF中釋放48 h后，AST丙酮溶液、市售ASTMCs、PE2和PE1的釋放率分別達(dá)到（32.990±0.015）%，（56.210±0.185）%，（61.780±0.015）%和（77.070±0.257）%，并在前12 h快速釋放，可能是因?yàn)锳ST丙酮溶液長(zhǎng)時(shí)間放置在溶出杯中，導(dǎo)致部分AST氧化降解，釋放率較低。與市售ASTMCs相比，Pickering乳液具有更好的體外釋放率，且PE1釋放率高于PE2。原因可能是在較高的pH值下，ZeinASTGA NPs之間發(fā)生聚集，導(dǎo)致ZeinASTGA NPs與釋放介質(zhì)的接觸面積減小，不利于包封在復(fù)合納米顆粒中AST的釋放，而復(fù)合納米顆粒的聚集增加了油滴與釋放介質(zhì)的接觸面積，增加了油滴中AST的釋放。因此，PE1在SIF中的釋放率最高，并高于PE2在SGF中的釋放率。

通過(guò)DDSolver軟件擬合藥物釋放動(dòng)力學(xué)模型，闡述藥物釋放的機(jī)制及動(dòng)力學(xué)。模擬腸液中、胃液中各模型擬合結(jié)果，如表1，2所示。

由表1可知：PE1在SIF中的釋放曲線與KorsmeyerPeppas擬合效果最好，且藥物釋放動(dòng)力學(xué)指數(shù)范圍為0.126～0.251，表明PE1釋放AST遵循菲克擴(kuò)散規(guī)律。進(jìn)一步說(shuō)明復(fù)合納米顆粒和油相中同時(shí)含有AST的Pickering乳液（PE1）在模擬腸液中可以持續(xù)釋放藥物。

3.8 大鼠藥代動(dòng)力學(xué)研究

大鼠單次口服給藥后血藥質(zhì)量濃度時(shí)間曲線，如圖11所示。圖11中：ρ為質(zhì)量濃度。由圖11可知：AST玉米油和PE1血漿中AST質(zhì)量濃度的達(dá)峰時(shí)間分別為4，8 h，使用Data Analysis System軟件以非房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

非房室模型藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如表3所示。表3中：a表示與AST玉米油相比，顯著水平P＜0.05；b表示與市售ASTMCs相比，顯著水平P＜0.05；c表示與PE2相比，顯著水平P＜0.05。

由表3可知：PE1血漿中的AST達(dá)峰質(zhì)量濃度（ρmax）最高，其平均質(zhì)量濃度為（2.654±0.004） μg·mL-1，分別是AST玉米油、市售ASTMCs和PE2的5.74，2.43，1.49倍；PE1的AUC（0～t）分別是AST玉米油、市售ASTMCs和PE2的5.50，1.70，1.56倍；PE1平均滯留時(shí)間（TMR）和半衰期（t1/2）是AST玉米油的1.17，1.80倍，表明PE1可在體內(nèi)滯留更長(zhǎng)的時(shí)間；血漿中生物活性物質(zhì)的相對(duì)生物利用度可以根據(jù)（AUC（0～∞））反映，PE1的相對(duì)生物利用度分別是市售ASTMCs和PE2的1.703，1.481倍。

PE1具有最高的血藥質(zhì)量濃度和相對(duì)生物利用度的原因可能有以下3點(diǎn)。

1） ZeinASTGA NPs穩(wěn)定的乳液具有較小的尺寸和更大的表面積，加速了AST的溶出。

2） Pickering乳液中的油相使Pickering乳液具有Ⅰ型脂質(zhì)制劑的部分特征［14］ ，口服Pickering乳液后，分散在乳液油相中的AST被充分消化，形成膠體物質(zhì)，該物質(zhì)與內(nèi)源性增溶物質(zhì)相互作用后，產(chǎn)生混合膠束，增強(qiáng)了AST的口服吸收［15］。

3） 口服給藥后，乳劑可以增加向腸道相關(guān)淋巴組織運(yùn)輸AST，促進(jìn)AST的腸道淋巴組織的吸收［16］。以上結(jié)果表明復(fù)合納米顆粒和油相中同時(shí)含有AST的Pickering乳液（PE1）可以提高AST在大鼠血漿中的質(zhì)量濃度和相對(duì)生物利用度。

4 結(jié)論

由于AST在水中的溶解度較低，其化學(xué)結(jié)構(gòu)容易在光、氧、熱等條件下氧化分解，導(dǎo)致穩(wěn)定性和生物利用度低，限制了其應(yīng)用。目前有研究報(bào)道部分新型載體和技術(shù)可以改善AST的穩(wěn)定性和生物利用度，Kim等［17］制備了包封AST的殼聚糖三聚磷酸納米顆粒，研究表明，包封在納米顆粒中的AST可以延長(zhǎng)其在胃腸道中的釋放時(shí)間，增強(qiáng)其抗氧化活性。Bassijeh等［18］將包封AST的微膠囊與游離的AST進(jìn)行比較，在60 ℃下放置12 d后，微膠囊中游離AST的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比AST的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低了30%。然而，仍存在一定的局限性，例如，貯藏穩(wěn)定性差和相對(duì)生物利用度依舊較低。文中Pickering乳液可以提高AST的穩(wěn)定性。與游離AST油溶液和商業(yè)ASTMC相比，復(fù)合納米顆粒和油相中含有AST的Pickering乳液在大鼠中顯示出最佳的體外生物可利用性和相對(duì)生物利用度。綜上所述，在復(fù)合納米顆粒和油相中含有AST的Pickering乳液具有成為負(fù)載AST的有效遞送體系的潛力，為AST的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供參考。

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（責(zé)任編輯： "陳志賢" 英文審校： 劉源崗）

通信作者： 侯志勇（1972-），男，副主任藥師，主要從事創(chuàng)新藥物的研究。E-mail：mpp5358@163.com。

基金項(xiàng)目： 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFE0101700）； 福建省高校產(chǎn)學(xué)合作重大項(xiàng)目（2019Y4007）； 華僑大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目（18013071019）https：//hdxb.hqu.edu.cn/