陳 鵬，孔歡歡，桂 煜，孫麗娟

空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院眼科，陜西 西安 710032)

干眼是一種由多因素引起淚膜不穩(wěn)定、眼表結(jié)構(gòu)狀態(tài)異常的慢性疾病。我國5～89歲人群的干眼患病率為13.55%，約1.7億人受到此病困擾，有干眼癥狀的人群大約有3.9億，占人口總數(shù)的31.40%[1]。由此可見，干眼已逐漸成為亟待解決的眼科常見病之一。

覆蓋在角膜表面的3層淚膜結(jié)構(gòu)(脂質(zhì)層、水液層、黏蛋白層)是維持屈光狀態(tài)，濕潤保護(hù)角膜和結(jié)膜上皮，使其避免受到感染、外傷和環(huán)境刺激，維持眼表微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。眼部結(jié)膜、角膜上皮、淚腺、瞼板腺、神經(jīng)以及組織中的炎癥因子和免疫細(xì)胞通過影響淚膜的穩(wěn)定性和完整性，引起炎性細(xì)胞浸潤、組織結(jié)構(gòu)損傷和角膜神經(jīng)異常等病理改變，使眼表微環(huán)境遭到破壞，發(fā)生干眼[2]。

由于干眼的多因素致病特征，本文按照干眼的臨床特征分類，將干眼動(dòng)物模型分為水液缺乏型、蒸發(fā)過強(qiáng)型和混合型三類[3]。水液缺乏型是通過淚腺切除、動(dòng)物先天性淚腺功能障礙、動(dòng)物自身免疫性疾病、神經(jīng)阻滯、全身或者局部應(yīng)用藥物等方式影響淚腺分泌功能建立模型；蒸發(fā)過強(qiáng)型主要通過燒灼瞼板腺口、干燥環(huán)境應(yīng)激、局部應(yīng)用藥物破壞淚膜脂質(zhì)層和黏蛋白層引起淚膜動(dòng)力學(xué)異常誘導(dǎo)干眼體征；實(shí)驗(yàn)中通常在淚液缺乏動(dòng)物的基礎(chǔ)上進(jìn)行干燥環(huán)境應(yīng)激、局部應(yīng)用藥物或去勢手術(shù)等方式建立模型，這種以兩種方式建立的稱為混合型干眼模型。

1 水液缺乏型干眼模型

1.1 淚腺的切除與損毀

不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物淚腺構(gòu)造存在種屬差異，淚腺切除后淚液的分泌量、眼表炎癥的持續(xù)時(shí)間和模型的可逆性均不一致。MECUM等[4]研究發(fā)現(xiàn)雌性小鼠的角膜更容易受到淚腺切除影響。SHINOMIYA等[5]在眶外淚腺切除的小鼠模型基礎(chǔ)上，摘除眶內(nèi)淚腺，使得模型的干眼體征更加明顯。FAKIH等[6]利用切除淚腺建模研究參與干眼相關(guān)疼痛發(fā)展的外周致敏和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，有助于識別減輕眼部疼痛的新分子。

ROCHA等[7]通過8 Gy連續(xù)輻射5 d成功誘導(dǎo)小鼠干眼。與切除小鼠淚腺不同，此類模型在輻照結(jié)束2個(gè)月后，變薄的角膜上皮恢復(fù)，角膜基質(zhì)增厚等炎性體征可逐漸消失。如果在小鼠接受輻照前，將腺病毒載體介導(dǎo)的促紅細(xì)胞生成素基因轉(zhuǎn)移到小鼠唾液腺進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)干眼體征和角膜損傷得到恢復(fù)[7]。完全切除兔的淚腺(主淚腺、第三眼瞼上腺和哈氏腺)，干眼體征穩(wěn)定持續(xù)[8]，而部分切除兔的淚腺并不給予額外干預(yù)，淚液分泌代償性增加，干眼體征和角膜炎癥反應(yīng)在4個(gè)月內(nèi)逐漸好轉(zhuǎn)[9]。這種干眼模型因其可逆性常用于治療藥物的開發(fā)。

1.2 淚腺神經(jīng)功能障礙

淚腺分泌淚液需要正常的神經(jīng)支配、充足的血液循環(huán)和腺體結(jié)構(gòu)與功能完整。神經(jīng)阻滯模型可以通過阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)來抑制淚腺分泌。

有學(xué)者使用射頻探針損毀兔的三叉神經(jīng)節(jié)[10]或經(jīng)顳下巖前入路切除兔單側(cè)眼巖淺大神經(jīng)[11]，阻斷眼表神經(jīng)支配，實(shí)驗(yàn)眼出現(xiàn)結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度減少和角膜上皮糖原水平降低等干眼體征。但此種方法對手術(shù)操作有較高的要求，且低等動(dòng)物神經(jīng)修復(fù)能力大于人類，因此采用這種方法建立模型應(yīng)考慮與人相近的大型哺乳動(dòng)物。除手術(shù)干預(yù)，將肉毒桿菌素(botulinum toxin，BTX)注射到動(dòng)物淚腺部位，可以阻斷神經(jīng)肌肉接頭和膽堿能神經(jīng)連接處乙酰膽堿的釋放。在手術(shù)顯微鏡觀察下，將1.25 mU的BTX-B注射至CBA/J小鼠淚腺持續(xù)3 d，小鼠淚液分泌量減少，有助于研究人類慢性干眼發(fā)病機(jī)制[12]。

抗膽堿藥物是毒蕈堿型乙酰膽堿受體(M受體)的競爭性拮抗劑，通過阻斷乙酰膽堿的作用，抑制副交感神經(jīng)系統(tǒng)，抑制腺體分泌。在6周齡的雌性Lewis大鼠中[13]，皮下植入東莨菪堿滲透泵誘導(dǎo)干眼，可見大鼠淚液分泌量減少，角膜上皮點(diǎn)狀缺損等明顯的干眼體征。AICHER等[14]在雄性SD大鼠皮下注射1 g/L甲基阿托品(1 mg/kg)，2次/d，連續(xù)2 d即可建立模型。該類干眼模型建立快速、簡便，但阿托品、東莨菪堿等抗膽堿藥物有一定毒副作用，對藥物劑量和用藥間隔時(shí)間有嚴(yán)格的要求。目前這種模型已廣泛用于評估人工淚液或眼部外用藥物的安全性。

Neurturin是一種副交感神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)因子，Neurturin-deficient(NRTN-/-)轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為與人干燥性角膜結(jié)膜炎相似的體征[15]。與同年齡的正常小鼠相比，NRTN-/-小鼠的淚液分泌量，淚膜破裂時(shí)間和角膜反射明顯降低，結(jié)膜黏蛋白和杯狀細(xì)胞密度均低于正常小鼠。該模型在研究淚腺自主感覺神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)維持眼表健康方面有一定意義。

1.3 藥物影響淚腺分泌

T細(xì)胞有絲分裂原刀豆蛋白是一種植物血凝素，具有強(qiáng)力的促有絲分裂作用，HONKANEN等[16]將其注射于兔雙側(cè)主淚腺，發(fā)現(xiàn)兔眼淚液分泌減少，眼表炎癥反應(yīng)明顯，淚腺結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重破壞，可建立穩(wěn)定的干眼模型[17]。

ZOUKHRI等[18]在小鼠淚腺中注射IL-1，抑制淚腺分泌功能，使淚液分泌減少、淚腺腺泡上皮細(xì)胞破壞、炎癥反應(yīng)明顯，建立一種可逆的淚液缺乏型干眼動(dòng)物模型。

1.4 自主免疫影響淚腺功能

該類動(dòng)物模型一般通過特定的基因編輯技術(shù)誘導(dǎo)突變，導(dǎo)致自身免疫失衡，外分泌腺中大量炎性細(xì)胞浸潤，使淚腺功能受損，淚液分泌量減少，出現(xiàn)干眼體征，是模擬人類自身免疫性干眼的理想模型，但該類模型同時(shí)伴有其他器官或系統(tǒng)的損傷，造模時(shí)間一般較長(表1)。

表1 自身免疫性疾病相關(guān)的干眼癥模型

NOD小鼠是由MAKINO等[19]開發(fā)的1型糖尿病小鼠模型，16周齡以上的NOD小鼠患自身免疫性胰島素依賴型糖尿病，外分泌腺中炎性細(xì)胞浸潤，淚腺分泌功能受損，淚液減少。12～16周齡NOD小鼠淚腺中，IL-1β、IL-6、IL-7、IL-10、IFN-γ、TNF-α等水平明顯增加，與人類自身免疫性干眼中炎性因子的類別相似[20]。雄性NOD小鼠的自身免疫性淚腺炎發(fā)病率較高，可能與性激素水平有關(guān)。因此NOD小鼠是研究性別相關(guān)的原發(fā)性自主免疫性干眼的理想模型[21]。但伴有1型糖尿病的NOD小鼠需要長期注射胰島素，增加飼養(yǎng)成本，還可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為進(jìn)一步排除糖尿病對造模的影響，ROBINSON等[22]建立了一種NOD小鼠衍生的B10.H2b小鼠模型，僅出現(xiàn)外分泌腺淋巴細(xì)胞浸潤功能障礙而沒有糖尿病癥狀。

MRL/lpr小鼠是一種系統(tǒng)性紅斑狼瘡動(dòng)物模型，與NOD小鼠模型不同，雌性MRL/lpr小鼠的淚腺炎癥嚴(yán)重程度明顯高于雄性小鼠，表現(xiàn)為淚液分泌減少，淚腺中淋巴細(xì)胞浸潤，有抗SSA和抗SSB抗體產(chǎn)生[23]，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，將p38-MAPK抑制劑SB203580注射到淚腺中可改善淚腺分泌功能。證實(shí)p38-MAPK途徑在MRL/lpr小鼠干眼模型中起著重要作用[24]。

RbAp48轉(zhuǎn)基因小鼠中視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白48是控制細(xì)胞生長和凋亡的一種多功能蛋白質(zhì)分子，ISHIMARU等[25]研究發(fā)現(xiàn)RbAp48轉(zhuǎn)基因鼠的淚腺上皮細(xì)胞出現(xiàn)特異性凋亡，影響淚腺分泌功能，敲除RbAp48基因，可抑制淚腺細(xì)胞凋亡。切除小鼠卵巢后，凋亡的淚腺上皮細(xì)胞中RbAp48的表達(dá)量增加，這提示RbAp48在雌激素缺乏介導(dǎo)的干眼中起一定作用。RbAp48轉(zhuǎn)基因小鼠是研究淚腺上皮細(xì)胞凋亡的理想模型，但該模型完全依賴于人工過表達(dá)RbAp48，與人類干眼的自然病程不符。

Aire-/-小鼠，由于常染色體隱形基因Aire基因突變出現(xiàn)腎上腺皮質(zhì)功能不全，甲狀旁腺功能減退、慢性皮膚感染，以及眼部并發(fā)癥。還表現(xiàn)為許多眼部并發(fā)癥[26]。如淚液分泌減少，淚腺大量的淋巴細(xì)胞浸潤及角膜新生血管增加等[27]。Aire-/-小鼠是研究自身免疫性干眼機(jī)制的常用模型。在IL-1受體拮抗劑治療自身免疫性干眼和乳蛋白促進(jìn)淚液分泌療效方面的研究中已廣泛應(yīng)用[28]。

研究人員建立了其他具有干眼癥狀的自主免疫性小鼠模型。Aly/aly小鼠的常染色體隱性基因純合子突變出現(xiàn)淋巴組織發(fā)育不全，淚腺發(fā)生以CD4+T細(xì)胞浸潤為主的慢性炎癥變化[29]。IQI/Jic小鼠與NFS/sld小鼠和其他自主免疫模型相比，需在培育過程中切除小鼠胸腺建立干眼模型，對出生3 d的IQI/Jic小鼠切除胸腺，小鼠在16周出現(xiàn)淚腺病變[30]。NFS/sld小鼠出生3 d后行胸腺切除術(shù)，外分泌腺出現(xiàn)以CD4+T細(xì)胞為主的淋巴細(xì)胞浸潤[31]。

NZB/WF1小鼠和BXSB/MpJ-Yaa小鼠是系統(tǒng)性紅斑狼瘡動(dòng)物模型，疾病累及淚腺，可出現(xiàn)典型的干眼癥狀。雄性BXSB/MpJ-Yaa小鼠因Y染色體上的Y連鎖自身免疫加速突變使得干眼癥狀更為嚴(yán)重[32]。Id3KO小鼠唾液和淚液的分泌明顯減少[33]，是一種細(xì)胞和體液免疫共同參與疾病的模型。PI3KKO小鼠胸腺細(xì)胞發(fā)育不良，出現(xiàn)角膜損傷，淚腺腺泡結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)管直徑變粗，伴有以CD4+T細(xì)胞為主的淋巴細(xì)胞浸潤[34]。Act-1-/-小鼠淚腺中存在嚴(yán)重的B220+細(xì)胞、CD4+T和CD8+T細(xì)胞浸潤，破壞淚腺的分泌功能[35]。CD25KO小鼠淚腺中Th1和Th17因子增加導(dǎo)致淚腺萎縮纖維化[36]。TSP-1KO小鼠淚腺CD4+T細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞凋亡壞死[37]。

這些模型外分泌腺中出現(xiàn)嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞浸潤，唾液和眼淚的分泌量明顯減少，均可作為一種干眼模型來研究人類自身免疫性干眼。

2 蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼動(dòng)物模型

蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼動(dòng)物模型，一般是通過誘導(dǎo)眼表炎癥影響淚膜穩(wěn)定性建立模型。

瞼板腺分泌脂質(zhì)形成了淚膜脂質(zhì)層，可穩(wěn)定淚膜，灼燒封閉兔瞼板腺口，間接破壞淚液脂質(zhì)層可促進(jìn)淚液的蒸發(fā)，淚膜破裂時(shí)間減少，淚液滲透壓增高，結(jié)膜杯狀細(xì)胞和角膜上皮糖原減少，出現(xiàn)典型干眼體征[38]。JIN等[39]認(rèn)為1-25-二羥基-22-氧骨化三醇作為一種臨床上用于治療銀屑病的維生素D3類似物，可緩解瞼板腺萎縮和導(dǎo)管擴(kuò)張，提示維生素D及其類似物在維持眼表健康方面起著重要作用。MIYAKE等[40]將完全弗氏佐劑(滅活的結(jié)核分枝桿菌)分別注射到兔鼻側(cè)、中部和顳側(cè)上眼瞼邊緣，建立瞼板腺功能障礙(meibomian gland dysfunction，MGD)模型，兩周后出現(xiàn)干眼體征。有學(xué)者對大鼠、兔眼局部應(yīng)用高濃度腎上腺素或全身應(yīng)用異維A酸，異維A酸通過PPAR-γ途徑，影響瞼板腺細(xì)胞分化，瞼板腺導(dǎo)管口上皮過度角化、建立MGD模型[41-42]。載脂蛋白C1轉(zhuǎn)基因小鼠[43]和ACAT-1-/-小鼠[44]等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，有不同程度瞼板腺功能異常，引發(fā)眼表慢性炎癥。

使用開瞼器或縫線固定眼瞼或者將小鼠在低濕度氣流持續(xù)暴露，出現(xiàn)淚液分泌量減少和角膜點(diǎn)狀潰瘍，暴露時(shí)間越長，角膜干燥斑越明顯。而將濕度控制恒定，環(huán)境溫度升高時(shí)，小鼠淚膜破裂時(shí)間也會(huì)下降[45]。這在生物學(xué)和形態(tài)學(xué)變化方面與人類干眼相似，且較為容易建立模型。

局部應(yīng)用藥物也可破壞淚膜穩(wěn)定。苯扎氯銨作為滴眼液中常用的防腐劑能夠影響淚膜穩(wěn)定、結(jié)膜杯狀細(xì)胞缺失、結(jié)膜鱗狀化生[46]?？衫酶邼舛缺皆蠕@建立干眼模型。李晶等[47]用高滲鹽水局部滴小鼠眼，可見淚液分泌量減少，角膜上皮基底部細(xì)胞排列紊亂缺失，出現(xiàn)空泡，引起類似干眼的病理損害，為探索淚液高滲透壓導(dǎo)致干眼的機(jī)制提供思路。

有研究認(rèn)為空氣污染指數(shù)的升高會(huì)增加干眼癥的發(fā)病率，LI等[48]用大氣污染物制備的滴眼液誘導(dǎo)建立干眼動(dòng)物模型，將5.0 g/L PM10滴眼液滴小鼠眼，4次/d，持續(xù)14 d，小鼠角膜上皮增厚，伴有細(xì)胞損傷和脫落，角膜表面光滑度降低，角膜上皮微絨毛縮短無序。使用頸部約束器將大鼠暴露于約500 μg/m3城市污染物中[49]，5 h/d，連續(xù)5 d，可誘導(dǎo)大鼠角膜上皮細(xì)胞凋亡，結(jié)膜杯狀細(xì)胞減少，破壞淚膜粘蛋白層。

3 混合型干眼動(dòng)物模型

有學(xué)者將干燥應(yīng)激與藥物干預(yù)結(jié)合建立干眼模型，將小鼠暴露在干燥環(huán)境中，同時(shí)皮下注射東莨菪堿，小鼠淚腺分泌量減少、角膜熒光染色異常、結(jié)膜杯狀細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞凋亡、炎癥因子水平增加，干眼體征穩(wěn)定，而被廣泛應(yīng)用[50]。

LI等[51]將兔淚腺完全切除的基礎(chǔ)上用50 g/mL三氯乙酸燒灼角膜，淚液減少直接損害了結(jié)膜的杯狀細(xì)胞，破壞了淚膜黏蛋白層。造模更迅速，干眼體征更明顯。

維生素是調(diào)節(jié)眼的發(fā)育和眼表正常分化的重要營養(yǎng)物質(zhì)[52]。對兔進(jìn)行維生素A完全缺乏飼料喂養(yǎng)6個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組兔體質(zhì)量較輕，毛發(fā)粗糙，角膜干燥無光澤，可見灰白色潰瘍灶，淚液分泌量減少，成功建立干眼模型。在此模型中NF-κBp65、NOS2過表達(dá)，可能參與干眼的發(fā)生。

SINGH等[53]將雌性Wistar大鼠雙側(cè)卵巢切除，發(fā)現(xiàn)淚液分泌量減少，出現(xiàn)干眼體征。LI等[54]對雌性Wistar大鼠非那雄胺胃灌注4周，淚腺中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、MMP-8、Fas-L和TNF-α等炎性因子升高，淚液分泌量減少，同時(shí)發(fā)生MGD，建立一種由雄激素缺乏誘導(dǎo)的干眼模型。抗雄激素動(dòng)物模型產(chǎn)生明顯的干眼體征，可用于了解絕經(jīng)后和雄激素缺乏干眼的疾病過程。

年齡是干眼的重要危險(xiǎn)因素，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)12月齡以上的C57BL/6小鼠瞼板腺功能異常，淚腺中MMP-9過表達(dá)、炎癥因子增加、CD4+T和CD8+T細(xì)胞浸潤，可作為研究年齡相關(guān)慢性干眼的模型[55]。

4 討論

目前基于多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立的干眼模型類型較多，除常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外，有學(xué)者基于探索人類PAX6突變的斑馬魚角膜模型[56]，提出有將斑馬魚等新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開發(fā)成干眼動(dòng)物模型的可能。實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)根據(jù)干眼的嚴(yán)重程度與病理生理學(xué)機(jī)制的不同正確選擇干眼動(dòng)物模型。一般來說，淚液缺乏型干眼模型多通過阻礙淚腺分泌功能來建立。淚腺切除術(shù)(切除瞬膜和哈德氏腺)、淚腺神經(jīng)阻滯，可引起嚴(yán)重的淚液分泌障礙，但需要高水平的手術(shù)技術(shù)并熟悉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖。局部應(yīng)用化學(xué)藥品，可迅速建立模型，不過這些不能完全模擬自主免疫性干眼。自身免疫性疾病動(dòng)物模型表現(xiàn)為包括淚腺損傷在內(nèi)的多器官炎癥病變，淚腺中有明顯淋巴細(xì)胞浸潤[57]。蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼模型可通過瞼板腺功能障礙實(shí)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)基因鼠，ACAT-1KO小鼠、TRAF6KO小鼠、Barx2KO小鼠，表現(xiàn)為瞼板腺的異常發(fā)育，發(fā)生MGD[58]。也有學(xué)者利用煙草煙霧[59]和大氣污染物等建立干眼模型，用以研究環(huán)境因素對干眼疾病發(fā)展的影響。干眼在女性的患病率高于男性，雄激素對淚腺及瞼板腺分泌功能有調(diào)控作用，將雄性大鼠睪丸摘除[60]，瞼板腺和淚腺上皮細(xì)胞萎縮，淚液分泌量持續(xù)降低，淚膜破裂時(shí)間縮短，角膜熒光異常。

當(dāng)前，干眼動(dòng)物模型的研究進(jìn)展迅速，許多治療藥物開發(fā)正是基于這些干眼動(dòng)物模型得到重要結(jié)果。但是人類干眼發(fā)病涉及復(fù)雜的病理生理機(jī)制和免疫反應(yīng)，沒有哪種干眼動(dòng)物模型可以作為研究的最佳工具，需要我們建立更全面、更精細(xì)的干眼模型來分析干眼發(fā)病機(jī)制，尋找治療的新靶點(diǎn)。