胡春嬌，梁雪楓，姜振峰

（東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030）

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor，TF）可特異性識別并與靶基因上游啟動因子區(qū)域特異DNA 序列模體結(jié)合，使其轉(zhuǎn)錄激活或抑制，從而調(diào)控植物生長發(fā)育[1]。YABBY 基因家族屬鋅指蛋白超家族，是一類存在于植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，包含2 個高度保守的結(jié)構(gòu)域，其中一個為位于YABBY 蛋白N端的鋅指結(jié)構(gòu)域，另一個為位于C 端的“螺旋-環(huán)-螺旋”結(jié)構(gòu)域[2]。

雙子葉植物中YABBY 基因的研究較為深入。Bowma 等[2]研究發(fā)現(xiàn)YABBY 基因與植物生長發(fā)育調(diào)控植物形態(tài)建成和器官發(fā)育有相關(guān)。YABBY 基因共有5 個亞族，分別為CRC、FLA/YAB3、INO、YAB2、YAB5[3]。其中CRC 基因在心皮和蜜腺中表達，在蜜腺的生長和成熟中發(fā)揮重要作用[4]；FLA基因與花器官形成及葉發(fā)育有關(guān)[5-6]；INO 基因調(diào)控外胚珠珠被發(fā)育[7]；YAB2、YAB3、YAB5 在植物營養(yǎng)組織中特異表達[8-9]。目前，在擬南芥[10]、水稻[11]、玉米[12]、紫花苜蓿[13]、棉花[14]中分別鑒定出6、8、13、8、23 個該基因家族成員。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)棉花中所有YABBY 基因家族成員均可在花、蕾和莖端組織中表達[14]；YAB7 基因在水稻維管發(fā)育中發(fā)揮重要作用[15]；TaYAB1_5AL 基因在小麥葉原基發(fā)育與葉片近-遠軸端極性的建立密切相關(guān)[16]；PgINO 基因在石榴中參與花器官發(fā)育且對外種皮發(fā)育產(chǎn)生負調(diào)控作用[17]。

大豆為我國主要油料作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位[18]，其生長發(fā)育過程存在復雜的遺傳控制機制。在完成大豆全基因組測序[19]和掌握分析大豆全基因組使用方法[20]后，大豆分子生物學實現(xiàn)了新跨越，眾多基因功能被闡釋。目前，YABBY 基因家族研究多集中在擬南芥、水稻、玉米、紫花苜蓿和棉花[10-14]，在大豆生長發(fā)育過程中的研究尚未見報道。為探究YABBY 基因家族在大豆生長發(fā)育過程中的作用，本研究利用生物信息學手段對大豆YABBY 基因家族理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級及三級結(jié)構(gòu)、保守基序分布、系統(tǒng)進化樹構(gòu)建和大豆植株各組織基因表達模式進行分析，旨在為深入研究大豆YABBY 基因家族功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗中的蛋白序列、基因序列、基因組注釋文件分別來自以下網(wǎng)站：Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）、NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、大豆基因組數(shù)據(jù)庫SoyBase（https://www.soybase.org/）。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆YABBY 基因家族成員鑒定

由于擬南芥LED 基因與大豆YABBY 基因在序列上存在相似性，因此將擬南芥LED 基因作為查詢對象。為獲取大豆基因組中包含的全部YABBY基因，通過Phytozom（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）基因組數(shù)據(jù)庫，根據(jù)擬南芥YABBY 基因氨基酸序列進行系統(tǒng)BLAST 檢索，獲得目的基因在大豆中的同源基因，刪去重復基因，篩選候選基因；通過Smart（http://smart.embl.de/）在線網(wǎng)站進行結(jié)構(gòu)域預測；利用Pfam（http://pfam.janelia.org/）在線網(wǎng)站下載YABBY 結(jié)構(gòu)域文件，再利用HMMER 3.0軟件構(gòu)建YABBY 基因家族隱馬爾可夫模型文件，將2 個文件比對搜索，最后獲得大豆YABBY 基因家族成員。

1.2.2 大豆YABBY 基因家族理化性質(zhì)分析

文中所有基因和蛋白序列來源均為Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）基因組數(shù)據(jù)庫。利用Phytozome 基因組數(shù)據(jù)庫和Expasy（https://www.expasy.org/）在線網(wǎng)站對YABBY 基因家族成員進行理化性質(zhì)分析，得到氨基酸長度、分子質(zhì)量、等電點等信息。

1.2.3 基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預測

在Phytozome 數(shù)據(jù)庫下載得到大豆YABBY基因家族成員的蛋白序列，利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl.page=npsa_sopma.html）在線網(wǎng)站預測大豆YABBY 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL 在線網(wǎng)站構(gòu)建基因編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)模型。

1.2.4 大豆YABBY 基因家族Motif 分析

利用MEME（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）在線網(wǎng)站上傳大豆YABBY 基因家族蛋白序列，對Motif 進行預測[21]。

1.2.5 構(gòu)建大豆YABBY 基因家族系統(tǒng)進化樹

在Phytozome 數(shù)據(jù)庫中下載大豆、擬南芥基因蛋白序列，利用MEGA 11 比對分析基因蛋白序列，再使用MEGA 11 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，同時利用chiplot 在線網(wǎng)站將nwk 格式文件作為基礎對進化樹進行美化。

1.2.6 大豆YABBY 基因家族共線性分析

在大豆基因組數(shù)據(jù)庫SoyBase 和擬南芥數(shù)據(jù)TAIR（https://www.Arabidopsis.org/）中下載大豆和擬南芥全基因組序列和基因結(jié)構(gòu)注釋文件，使用McScan 軟件進行共線性分析預測，利用TBtools v1.09857 軟件繪圖。

1.2.7 大豆YABBY 基因家族表達分析

通過數(shù)據(jù)庫SoyBase（https://www.soybase.org/）下載大豆YABBY 基因家族成員在6 個不同組織中的表達量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用軟件TBtools v1.09857的Heat Map 功能繪制熱圖，以log scale（base=2 和log with=1）為基礎，對數(shù)據(jù)進行歸一化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆YABBY 基因家族成員鑒定

本研究利用擬南芥LED 基因保守結(jié)構(gòu)域及全長蛋白，通過BLAST 對大豆基因組學數(shù)據(jù)庫進行查詢，再利用Smart 網(wǎng)站進一步確認和人工校對，最終獲得17 個大豆YABBY 基因家族成員，分別命名為GmYABBY1～GmYABBY17。

2.2 大豆YABBY 基因家族的蛋白質(zhì)特性分析

由表1 可知，大豆YABBY 基因家族成員的氨基酸數(shù)量為173～264 aa，分子質(zhì)量為18 908.42～29 605.55 Ku。等電點為5.30～9.34，除Glyma.01g029300、Glyma.04g094800、Glyma.06g096500、Glyma.08g285200、Glyma.18g140400 外，其余蛋白等電點均＞7.00，表明大豆YABBY 基因家族蛋白大部分呈堿性。大豆YABBY 基因不穩(wěn)定系數(shù)均＞40，且蛋白疏水性均＜0，表明大豆YABBY基因家族成員蛋白均為穩(wěn)定的親水蛋白。

表1 大豆YABBY 基因家族成員蛋白信息及理化性質(zhì)

2.3 大豆YABBY 基因家族蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)分析

在二級結(jié)構(gòu)預測[22]過程中，YABBY 基因編碼的蛋白質(zhì)α-螺旋均大于0.160 0，其中GmYABBY1、GmYABBY6、 GmYABBY16，GmYABBY3 和GmYABBY10，GmYABBY4 和 GmYABBY7，GmYABBY8 和GmYABBY9 的α-螺旋相近。β-轉(zhuǎn)角中，GmYABBY3 和GmYABBY8，GmYABBY5、GmYABBY6 和 GmYABBY7，GmYABBY12 和GmYABBY15，GmYABBY13 和 GmYABBY14，GmYABBY16 和GmYABBY17 分別相近。β-轉(zhuǎn)角中最大的基因為GmYABBY1，最小的基因為GmYABBY9。無規(guī)則卷曲為0.473 5～0.622 3，其中GmYABBY3 和 GmYABBY4，GmYABBY7 和GmYABBY14 無規(guī)則卷曲度相近。延伸鏈為0.1152～0.2216，其 中 GmYABBY2 和 GmYABBY6，GmYABBY4 和 GmYABBY13，GmYABBY5 和GmYABBY10，GmYABBY7 和 GmYABBY15，GmYABBY9、GmYABBY11 和GmYABBY16 的延伸長度分別相近（見表2）。

由圖1 可知，GmYABBY2 和GmYABBY4，GmYABBY3 和 GmYABBY5 三級結(jié)構(gòu)相似,GmYABBY6、 GmYABBY8、 GmYABBY10 和GmYABBY17 三級結(jié)構(gòu)表現(xiàn)一致，GmYABBY9 和GmYABBY11 三級結(jié)構(gòu)表現(xiàn)相同。結(jié)果表明，部分基因家族成員蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)相同。

圖1 大豆GmYABBY 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測

2.4 大豆YABBY 基因家族保守基序分析

通過MEME 在線工具對大豆YABBY 基因家族的17 個成員蛋白序列中的保守序列進行預測，結(jié)果表明在大豆YABBY 基因家族中共存在5 個保守基序，分別命名為Motif 1～Motif 5。

由圖2 可知，大豆GmYABBY 基因家族成員的保守Motif 數(shù)量為2～4 個，其中Motif 1 與Motif 2出現(xiàn)頻率最高，為17 次；其次為Motif 3，出現(xiàn)頻率為14 次；Motif 5 出現(xiàn)頻率最低，僅為4 次。

GmYABBY1、GmYABBY8、GmYABBY10 和GmYABBY17 保守基序相似，GmYABBY3、GmYABBY5、GmYABBY7 和GmYABBY16 保守基序相似，GmYABBY9、GmYABBY11、GmYABBY13、GmYABBY14 和GmYABBY15 保守基序高度相似，GmYABBY2 和GmYABBY12 高度近似。Motif 1 與Motif 2 通常同時成對出現(xiàn)。根據(jù)大豆YABBY 基因家族進化關(guān)系分析，進化關(guān)系相近的同一亞族成員在保守基序組成上具有較高相似性，表明同一亞族成員在基因功能上也具有較高的相似性。

2.5 大豆YABBY 基因家族系統(tǒng)進化分析

由圖3 可知，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和序列相似性將大豆YABBY 基因家族分為4 個亞族（ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ、ClassⅣ），4 個亞族均包含擬南芥和大豆這2 個物種。其中，ClassⅠ包含5 個大豆基因（GmYABBY1、GmYABBY6、GmYABBY8、GmYABBY10、GmYABBY17）、1 個擬南芥基因（AT1G23420），目標基因GmYABBY6 和GmYABBY8 高度同源；Class Ⅱ包含2 個大豆基因（GmYABBY2、GMYABBY4）、1 個擬南芥基因（AT1G69180），目標基因GmYABBY2 和GmYABBY4 高度同源；Class Ⅲ包含4 個大豆基因（GmYABBY3、GmYABBY5、GmYABBY7、GmYABBY16）、2 個擬南芥基因（AT2G45190、AT4G00180），目標基因 GmYABBY5 和 GmYABBY16，GmYABBY3 和GmYABBY7 均高度同源；ClassⅣ包含6 個大豆基因（GmYABBY9、GmYABBY11、GmYABBY12、 GmYABBY13、 GmYABBY14、GmYABBY15）、2 個擬南芥基因（AT1G08465、AT2G26580），目標基因 GmYABBY11 和GmYABBY14，GmYABBY13 和GmYABBY15 均高度同源。

圖3 大豆、擬南芥YABBY 基因家族系統(tǒng)進化樹

2.6 大豆YABBY 基因家族共線性分析

植物進化階段常通過基因復制的方式達到擴大基因組目的。為探究大豆YABBY 基因家族進化關(guān)系，對大豆YABBY 基因家族進行物種內(nèi)共線性分析。由圖4 可知，在大豆20 條染色體上共發(fā)生14 次復制事件。其中GmYABBY11、GmYABBY12發(fā)生3 次復制事件，GmYABBY1、GmYABBY10、GmYABBY14 和GmYABBY17 發(fā)生2 次復制事件，其余基因各發(fā)生1 次復制事件。結(jié)果表明，大豆YABBY 基因在進化過程中出現(xiàn)了基因分化。

圖4 大豆GmYABBY 基因共線性關(guān)系

2.7 大豆YABBY 基因家族表達模式分析

由圖5 可知，GmYABBY4 和GmYABBY6 在6 個組織中均未表達，表明這2 個基因可能為誘導表達基因。GmYABBY11 除在根和根瘤中不表達，在其他組織中均表達，且表達量較高。GmYABBY3和GmYABBY5 在種子發(fā)育后期表達量較高，表明這2 個基因可能與種子發(fā)育有關(guān)。GmYABBY11 在葉和莢的發(fā)育期表達量較高，表明該基因可能與葉和莢的發(fā)育相關(guān)。17 個大豆GmYABBY 家族基因中大部分成員在花、葉中表達量較高，在根與根瘤中表達量較低甚至不表達，表明GmYABBY基因可能參與花和葉的發(fā)育過程。

圖5 大豆YABBY 家族基因在不同組織中的表達圖譜

3 結(jié)論與討論

YABBY 基因家族是一種影響植物側(cè)生器官發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子[23]，在植物花器官發(fā)育、激素響應、逆境應答等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[24]。本研究利用生物信息學方法在大豆中共鑒定出17 個YABBY 基因家族成員，其氨基酸數(shù)量為173～264 aa，分子質(zhì)量為18 908.42～29 605.55 Ku，等電點最?。℅mYABBY8）為5.30，最大（GmYABBY2 和GmYABBY4）為9.34。通過對其理化性質(zhì)分析可知，大豆YABBY 基因家族成員蛋白大部分呈堿性，表明該家族含有較多的堿性氨基酸，如組氨酸、精氨酸、賴氨酸。大豆YABBY 基因不穩(wěn)定系數(shù)均＞40，且蛋白疏水性均＜0，表明大豆YABBY 基因家族成員蛋白均為穩(wěn)定的親水蛋白。系統(tǒng)進化樹分析表明，本研究中鑒定的17 個大豆YABBY 基因家族成員與擬南芥相同，分為4 個亞族，且每個亞族均包含與擬南芥同源的基因，由此推斷，大豆與擬南芥的YABBY 基因家族成員可能具有相似基因功能。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈這4 種空間結(jié)構(gòu)構(gòu)成。GmYABBY 基因家族的17 個基因的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲形成。GmYABBY6、GmYABBY8、GmYABBY10 和GmYABBY17 的氨基酸序列高度相似，且這4 個基因的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)相似。

物種內(nèi)共線性分析表明，在大豆20 條染色體上共發(fā)生14 次復制事件，表明大豆YABBY 基因在進化過程中出現(xiàn)了基因分化。

李圣龍[25]等從石榴基因組中鑒定得到6 個YABBY 基因，發(fā)現(xiàn)Pg YABBY 基因家族在石榴的生長發(fā)育和生理過程中起重要作用。本研究通過對GmYABBY 家族基因表達模式分析發(fā)現(xiàn)GmYABBY6 和GmYABBY10 基因在葉、花、莢3 個發(fā)育時期及根、根瘤、種子7 個不同發(fā)育時期的6 個組織中均未表達，表明這2 個基因可能為誘導表達基因。GmYABBY 家族基因成員在花、葉中表達量較高，在根與根瘤中表達量較低甚至不表達，表明GmYABBY 基因可能參與花和葉的發(fā)育。GmYABBY3 和GmYABBY5 在種子發(fā)育后期表達量較高，表明這2 個基因可能與種子的發(fā)育相關(guān)。

本研究對大豆YABBY 基因家族進行初步鑒定，并進行了生物信息學分析及組織表達模式研究，初步揭示大豆YABBY 基因可能參與花、葉及種子發(fā)育，為今后深入研究大豆YABBY 基因家族功能提供理論基礎。