陳家樂，何金靈，杜榮起，李丹若，金天明，張東超，通信作者

（1. 天津農(nóng)學院 動物科學與動物醫(yī)學學院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392；2. 天津市農(nóng)業(yè)科學院，天津 300192）

雞大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenicEscherichia coli，APEC）引起的雞大腸桿菌相關疾病的總稱，主要臨床特征為腹膜炎、肝周炎、腸炎、輸卵管炎、氣囊炎、大腸桿菌肉芽腫及敗血癥等。大腸桿菌是感染雞的主要細菌之一[1]，不同年齡、品種的雞均可感染該菌[2]，給我國養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失[3]。

雞大腸桿菌血清型眾多，臨床上主要使用抗生素治療，但抗生素長期不規(guī)范使用導致大腸桿菌的耐藥菌譜逐漸擴大，有效抗菌藥物越來越少[4]，給大腸桿菌病的治療增加了難度。本研究通過對天津地區(qū)某雞場疑似大腸桿菌感染病雞進行細菌分離鑒定、致病性分析和敏感藥物篩選，為雞場對大腸桿菌病的防控管理及科學用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

天津地區(qū)某規(guī)?；怆u養(yǎng)殖場中的一批病雞。

1.1.2 試驗動物

18～20 g 健康的雄性SPF 級昆明小鼠[許可證編號：SCXK（京）2017-0005]，購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.3 主要試劑

革蘭氏染色液、吉姆薩染色液、瑞氏染色液、HE 染色液購自Solarbio 公司；腸桿菌細菌生化編碼鑒定管、抗菌藥物藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、LB 瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基等購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；DNA 相對分子質量標準（DL2501/DL2000）、2×TaqMaster Mix購自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.1.4 主要儀器

高壓滅菌器（LMQ.C-50E）購自山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9162）購自上海?，攲嶒炘O備有限公司；低溫高速離心機（TGL-6）購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；PCR 儀（S1000TM96 Well）購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；游標卡尺（16DN）購自馬爾精密量儀（蘇州）有限公司；病理組織切片制備系統(tǒng)購自徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 臨床癥狀觀察、病理剖檢與病料采集

觀察發(fā)病雞群的臨床癥狀，取病雞進行解剖檢查。用無菌注射器取其心包積液，無菌操作采集肝臟組織。

1.2.2 細菌分離培養(yǎng)

分別使用滅菌接種環(huán)蘸取心包積液、穿刺肝臟后，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。在超凈工作臺中無菌操作挑取單菌落，對單克隆細菌菌體進行革蘭氏染色并鏡檢，將分離菌株命名為TJzdc-2021。分別將分離菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床中，培養(yǎng)14 h。無菌操作將培養(yǎng)的菌液分別劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。

1.2.3 細菌生化鑒定

在超凈工作臺中使用滅菌的接種環(huán)挑取分離的單菌落至1 mL 滅菌生理鹽水中，振蕩懸浮。按照腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管說明書要求，將菌液接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、硫化氫、枸櫞酸鹽、靛基質、MR、V-P 生化鑒定管中，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，并對反應結果進行鑒定[5]。

1.2.4 細菌16S rRNA 鑒定

取1 mL 新鮮的菌液于離心管中，置于4 ℃離心機中12 000 r/min 離心2 min，棄去上清液，取1 mL ddH2O 重懸菌體。再次同上述方法離心、洗滌棄液后，取100 μL ddH2O 重懸洗滌菌體，金屬浴中100 ℃放置10 min，立即冰浴2 min。隨后，置于4 ℃離心機10 000 r/min 離心2 min，收集上清液為DNA 模板，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用參考文獻[6]中16S rRNA 引物，上游F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 體系為：1μL 上游引物16S rRNA-F、1 μL 下游引物16S rRNA-R、10 μL 2×TaqMaster mix、6 μL ddH2O、2 μL DNA 模板；PCR 條件為：94 ℃ 5 min 預變性，94 ℃ 30 s變性，49 ℃ 45 s退火，72 ℃ 1 min延伸，共30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min 延伸。取5 μL PCR 產(chǎn)物，加至10 g/L 瓊脂糖凝膠孔中，使用電泳儀110V 恒壓電泳25 min，再利用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶。將PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.5 分離菌株的系統(tǒng)進化樹構建與分析

將測序得到的16S rRNA 序列在NCBI 中與GenBank 數(shù)據(jù)庫進行序列對比，然后使用MEGA 7.0將分離菌株和同源性較高菌株的16S rRNA 序列進行同源性對比分析，并使用Neighbor- joining 法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.6 藥物敏感性試驗

采用K-B 紙片擴散法進行藥敏試驗。利用微量UV-Vis 分光光度儀檢測菌液濃度，將新鮮的菌液使用培養(yǎng)基稀釋至1×108cfu/mL，在超凈工作臺中使用微量移液器吸取1 mL 菌液均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基上，靜置5 min 晾干。用滅菌的眼科鑷子取藥敏試紙片均勻貼布在晾干的LB 瓊脂培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h 后，觀察并使用游標卡尺測量抑菌圈直徑。每種藥敏片重復三次，計算平均值及標準誤。藥物敏感性判定參照臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）的判定標準[7]。

1.2.7 毒力基因檢測

采用水煮法制備菌株DNA 模板，步驟同1.2.4所述DNA 模板制備的方法。選用參考文獻[8-9]中6 對常見的大腸桿菌毒力基因引物（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 大腸桿菌的毒力基因引物序列及PCR 條件

利用1.2.4 中制備的菌株DNA 作為PCR 模板，參照1.2.4 中PCR 反應體系（引物分別為毒力基因引物，其他成分和體積均相同），設置PCR 條件：94 ℃預變性5 min，{94 ℃變性30 s，退火45 s（退火溫度見表1），72 ℃延伸1 min}共30個循環(huán)，72 ℃總延伸10 min，進行PCR 擴增。PCR 產(chǎn)物進行電泳檢測并測序。

1.2.8 小鼠致病性試驗

將20 只昆明小鼠隨機分為2 組，分別為分離菌株感染組和生理鹽水對照組，每組10 只。參照1.2.4 洗滌菌體方法，利用生理鹽水將新鮮的大腸桿菌分離株菌液濃度稀釋至1×108cfu/mL[10]。分別對分離菌株感染組小鼠腹腔注射菌液0.2 mL/只，生理鹽水對照組小鼠經(jīng)腹腔注射等量滅菌生理鹽水。隨后，觀察小鼠的情況及存活時間并記錄。待小鼠瀕死狀態(tài)剪尾采血，處死后無菌采集肝臟，分別制作抹片，利用瑞氏染色液和吉姆薩染液染色并進行顯微鏡檢查。

1.2.9 病理切片制備與病理組織學觀察

分別對瀕死鼠和對照組健康小鼠進行處死，解剖檢查，并將組織器官浸入10%中性福爾馬林溶液固定。固定48 h 后，按常規(guī)石蠟切片制備及HE 染色技術，經(jīng)修塊、沖水、脫水、透明、包埋、切片、攤片、撈片、烘片、染色、封片等步驟制備成病理組織切片，在顯微鏡下觀察不同組的組織學病理變化并拍照。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀與剖檢病變

發(fā)病肉雞排黃色稀便，精神萎靡，食欲不振。剖檢可見，腹腔和胸腔有大量黃色纖維素性滲出物；心臟包膜渾濁增厚，與心外膜粘連（圖1A），部分心包膜腔內(nèi)有黃色液體；肝臟及腸道表面有黃白色纖維素性滲出物附著，肝臟腫大呈暗紅色，邊緣鈍厚，質地變脆（圖1B）；脾臟腫大（圖1C）；腎臟明顯腫大、突出（圖1D）；十二指腸與空腸腸壁變薄，黏膜有出血點、出血斑，表面有卡他性黏液，淋巴濾泡腫大、出血（圖1E）。

圖1 病理檢查結果

2.2 分離菌株的菌落與菌體的形態(tài)和生長特征

分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基上生長為桃紅色、光滑的菌落（圖2A）；在伊紅美藍培養(yǎng)基上為紫黑色、有金屬光澤的菌落（圖2B）。將菌體革蘭氏染色后在油鏡下觀察，可見菌體呈兩端鈍圓的淡紅色短小桿狀，個別菌體呈球狀或長絲狀（圖2C）。分離菌株的菌落和菌體形態(tài)及生長特征與大腸桿菌相符。

圖2 大腸桿菌分離株的菌落與菌體形態(tài)

2.3 分離菌株生化鑒定

分離菌的生化試驗反應結果顯示：V-P（乙酰甲基甲醇試驗）、硫化氫、枸櫞酸鹽鑒定結果為陰性，靛基質、MR（甲基紅試驗）為陽性，葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇鑒定結果均產(chǎn)酸產(chǎn)氣，與大腸桿菌生化特性一致。

2.4 分離菌株16S rRNA 鑒定

大腸桿菌16S rRNA 特異性引物經(jīng)PCR 擴增后電泳，發(fā)現(xiàn)在1 000～2 000 bp 間有清晰明亮的條帶（圖3），經(jīng)過測序分離菌株16S rRNA 的PCR產(chǎn)物大小為1 437 bp，與預期大小相符。將測序的16S rRNA 序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫對比分析，與E.coli株同源性均在99.99%以上。

圖3 分離菌株16S rRNA 基因序列PCR 擴增結果

2.5 分離菌株16S rRNA 系統(tǒng)進化樹和同源性分析

選取GenBank 數(shù)據(jù)庫中與分離菌株16S rRNA序列同源性較高的20 個菌株的16S rRNA 序列，在MEGA 7.0 上使用Neighbor-joining 法構建系統(tǒng)進化樹。結果顯示：分離菌株與E.coliNBRC 株和E.coliU5/41 株的距離最近，在同一大分支上（圖4A），經(jīng)比對分析，分離菌株與E.coliNBRC株和E.coliU5/41 株的同源性均在99.99%以上（圖4B）。

圖4 分離菌株16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)進化樹和同源性分析結果

2.6 藥物敏感性分析

藥敏試驗結果顯示，分離菌株對氟苯尼考高度敏感，對四環(huán)素、多西環(huán)素中度敏感，對氨芐西林、羧芐西林、哌拉西林、青霉素、米諾環(huán)素、丁胺卡那、慶大霉素均不敏感（表2）。

表2 藥敏試驗結果

2.7 毒力基因檢測結果

對分離菌株進行大腸桿菌的6 種常見毒力基因的PCR 檢測。結果顯示，該菌株可擴增出fimC、hlyF、ompT和iroN4 種毒力基因，目的基因片段大小分別為：497、450、496 和553 bp，經(jīng)測序與預期大小一致，且無堿基增添、缺失和突變；毒力基因irp2和Vat未檢出（圖5）。

圖5 大腸桿菌6 種毒力基因的PCR 擴增結果

2.8 分離菌株對小鼠的致病力分析

小鼠在接種分離菌株后出現(xiàn)精神萎靡、食欲廢絕、被毛蓬亂等臨床癥狀，且在16 h 內(nèi)全部死亡（圖6A）。生理鹽水對照組小鼠無死亡，且未見異常。瑞氏和吉姆薩染色感染分離菌株和注射生理鹽水小鼠的血液和肝臟抹片，結果顯示：腹腔注射分離菌株組小鼠的血液和肝臟抹片中均發(fā)現(xiàn)有細菌（圖6B，箭頭指示），生理鹽水對照組小鼠的血液和肝臟抹片中均未發(fā)現(xiàn)細菌。

2.9 分離菌株感染小鼠的病理組織學分析

感染分離菌株的小鼠組織和臟器出現(xiàn)不同程度的病理變化（圖7）。肝臟組織中有含鐵血黃素；中央靜脈有大量紅細胞和炎性細胞；部分肝細胞核碎裂，甚至消失，部分肝索出現(xiàn)紊亂。心肌纖維間隙增寬，有大量紅細胞滲出，伴有炎性細胞浸潤。腎小囊及腎臟組織間隙有大量紅細胞滲出；部分腎小球崩解消失；近曲小管上皮細胞出現(xiàn)變性、壞死，脫落至管腔，部分近曲小管和遠曲小管管腔中充有大量黏液。肺臟組織部分肺泡皺縮，肺泡中充有不同數(shù)量的紅細胞，間質及肺泡內(nèi)巨噬細胞數(shù)量增多；肺靜脈中中性粒細胞數(shù)量明顯增多。腸道組織黏膜固有層有紅細胞滲出。脾臟紅細胞明顯增多，脾細胞細胞核濃縮、崩解，細胞壞死，脾組織中有大量含鐵血黃素。生理鹽水對照組小鼠臟器和組織未見明顯異常。

3 討論

本研究的分離菌株是從病雞肝臟組織中分離獲得的。通過病雞臨床癥狀觀察和病理剖檢發(fā)現(xiàn)，患病雞只排黃色稀便，出現(xiàn)典型的心包炎和肝周炎癥狀，腸黏膜出血，與雞大腸桿菌病的病變特征一致[11-13]，故懷疑該患病雞為感染致病性大腸桿菌所致。分離菌株培養(yǎng)在MCA 培養(yǎng)基上為桃紅色的光滑圓潤菌落，在EMB 培養(yǎng)基上為有金屬光澤的菌落，革蘭氏染色為革蘭氏陰性短桿菌，生化試驗反應結果為陽性，細菌菌落與菌體形態(tài)特征及生化鑒定結果與E.coli相符。此外，分離菌株16S rRNA 經(jīng)PCR 鑒定、系統(tǒng)進化樹分析及同源性比對，發(fā)現(xiàn)其與埃希氏菌屬的同源性在99.99%以上，為判定分離菌株是大腸桿菌提供了佐證。

通過藥物敏感性篩選發(fā)現(xiàn)，本研究分離的菌株TJzdc-2021 對β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類和氨基糖胺類藥物不敏感，表明該雞源大腸桿菌分離株在臨床上已產(chǎn)生了嚴重的多重耐藥性。其中，APEC 對β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥性可由多種耐藥機制導致，如β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生[14]，青霉素結合蛋白結合位點突變[15]等。該分離菌對β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象與楊晶晶等[16]分離的雞源大腸桿菌耐藥性相似，但不同的是，該分離菌對喹諾酮類藥物也產(chǎn)生了耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，E.coli分離菌株對氟苯尼考高度敏感，可根據(jù)雞場實際情況，用以控制該雞場大腸桿菌?。煌瑫r注意藥物定期更替，減少耐藥菌株產(chǎn)生。

該E.coli分離菌株檢測出了fimC、hlyF、ompT和iroN4 種毒力基因，而分離菌株攜帶的毒力基因hlyF、ompT和iroN與高致病性E.coli顯著相關[17]，提示了該分離菌可能具有較高致病力。此外，動物致病性試驗中，腹腔注射E.coli分離菌株的小鼠在8～16 h 內(nèi)死亡，且在肝臟和血液中均檢測到接種菌，再次證明了該E.coli分離菌株具有致病力且易形成菌血癥。病理組織學觀察表明，感染該E.coli分離菌株對動物心臟、肝臟、肺臟、腸道及脾臟等均可造成損傷，佐證了該分離菌的致病力特性。本研究從毒力基因檢測、動物試驗、病原菌侵襲部位及病理組織學評價等多角度綜合分析E.coli分離菌株的致病性，研究思路及結果可為病原菌的致病性相關研究提供參考。