王秋 李曉峰 夏勇 熊丹

宮頸癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一，死亡率在女性惡性腫瘤中居第二位［1-2］。85%的宮頸癌死亡發(fā)生在中低等收入人群國(guó)家［3］。目前，宮頸癌的篩查、手術(shù)、放化療等治療方法已經(jīng)取得一定的成效，但是對(duì)晚期和復(fù)發(fā)性宮頸癌的臨床治療效果還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，患者的預(yù)后較差［4］。因此，迫切需要更好的宮頸癌治療靶點(diǎn)和檢測(cè)標(biāo)志物來(lái)提高患者的生存期。

當(dāng)前，在預(yù)防癌癥方面有許多公共數(shù)據(jù)庫(kù)可供研究。重新分析與宮頸癌相關(guān)的基因表達(dá)譜對(duì)于其發(fā)病機(jī)制和分子機(jī)理非常重要。許多研究已探討了宮頸癌的致病基因及預(yù)后［5］，如研究發(fā)現(xiàn)INHBA（TGF-β 超家族的成員之一）在宮頸癌中高度表達(dá)，并與宮頸癌的不良預(yù)后相關(guān)。同時(shí)，INHBA 也與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)［6］。Xue 等［7］研究發(fā)現(xiàn)MCM2可能與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，并進(jìn)一步驗(yàn)證了MCM2的敲除可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。然而，基因之間以各種方式相互作用，腫瘤基因組復(fù)雜多變，現(xiàn)行的研究結(jié)果遠(yuǎn)不足以揭示宮頸癌的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后預(yù)測(cè)。因此，需要從不同角度進(jìn)行研究和分析，本研究擬使用生物信息學(xué)方法通過(guò)多組學(xué)分析尋找宮頸癌的新型預(yù)后生物標(biāo)志物。

本研究確定了GSE9750、GSE46857和GSE52903數(shù)據(jù)庫(kù)中的差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Genes，DEGs），對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO、KEGG 和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)等多種方法分析并得出樞紐基因。進(jìn)一步對(duì)樞紐基因的臨床意義（包括表達(dá)和生存分析）進(jìn)行分析，為進(jìn)一步了解這些樞紐基因在宮頸癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用提供新的方向，同時(shí)加深對(duì)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為宮頸癌的治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料來(lái)源

GEO 1據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）用于下載微陣列數(shù)據(jù)集。分別下載GSE9750、GSE46857 和GSE52903 數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。研究過(guò)程見(jiàn)圖1。AURKA基因免疫組化用的抗體來(lái)源于Abcam（貨號(hào)：ab52973）。

圖1 研究路線圖Figure 1 The study procedure

1.2 基因富集和功能分析

使用在線程序仙桃學(xué)術(shù)（https：//www.xiantao.love/）對(duì)基因功能進(jìn)行注釋（GO 分析）和KEGG 通路進(jìn)行富集分析。

1.3 差異表達(dá)基因（DEGs）的選擇

使 用GEO2R 工 具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）得到DEGs，并設(shè)置|log2fold change|≥1 和P＜0.05 為臨界值。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)和模塊分析

篩選得到上調(diào)和下調(diào)的DEGs，使用String 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org）進(jìn)行分析，設(shè)置臨界值大于0.4。使用Cytoscape v3.9.0 插件從P＜0.01 中選擇PPI 網(wǎng)絡(luò)（https：//cytoscape.org/）的顯著模塊，并由MCODE 插件進(jìn)一步分析。

1.5 生存分析

通過(guò)使用Kaplan-Meier plotter（KM plotter，http：//www.kmplot.com）對(duì)樞紐基因進(jìn)行總生存期和無(wú)復(fù)發(fā)生存期分析。

1.6 宮頸癌樞紐基因表達(dá)的驗(yàn)證

GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)是基于TCGA 創(chuàng)建的數(shù)據(jù)庫(kù)，在該數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行樞紐基因mRNA 表達(dá)驗(yàn)證。樞紐基因基因的蛋白表達(dá)在人類蛋白圖譜（http：//www.proteinatlas.org/）中進(jìn)行驗(yàn)證。

1.7 免疫組化

標(biāo)本經(jīng)10% 中性福爾馬林固定、常規(guī)脫水、浸蠟、石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片，免疫組織化學(xué)染色使用羅氏Bench-Mark ULTRA 全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)進(jìn)行染色，一抗AURKA 試劑購(gòu)自Abcam 公司（ab52973）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 4.2.2 版本軟件（美國(guó)Math-Soft 公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和繪圖。研究連續(xù)變量通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析比較。生存分析采用Kaplan-Meier 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因（DEGs）的篩選和分析

使用火山圖顯示DEGs，紅色點(diǎn)代表上調(diào)的DEGs，藍(lán)色點(diǎn)代表下調(diào)的DEGs。見(jiàn)圖2A～2C。在GSE9750、GSE46857 和GSE52903 中分別鑒定出上調(diào)基因610，747，355 個(gè)，下調(diào)基因1 572，700，502 個(gè)。利用維恩圖共鑒定出30 個(gè)共同上調(diào)的DEGs 和49 個(gè)共同下調(diào)的DEGs。見(jiàn)圖2D～2E。

圖2 不同數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)基因Figure 2 Differentially expressed genes in the different datasets

2.2 GO 和KEGG 富集分析

對(duì)圖2 鑒定出來(lái)的30 個(gè)上調(diào)的DEGs 和49 個(gè)下調(diào)的DEGs 進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。GO 分析：“生物過(guò)程”前三位為“細(xì)胞器裂變”、“細(xì)胞器組織的負(fù)調(diào)控”、“再生”；“細(xì)胞組分”前三位為“含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)”、“核染色體”、“細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物”；“分子功能”前三位為“蛋白質(zhì)C 端結(jié)合”、“整合素結(jié)合”、“細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合”。KEGG 分析DEGs 富集的通路主要為“細(xì)胞周期”、“孕酮介導(dǎo)的卵細(xì)胞成熟”和“鉑耐藥性”。GO 分析和KEGG 分析結(jié)果顯示采用氣泡圖。見(jiàn)圖3A?；虿捎镁W(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖3B。

圖3 差異表達(dá)基因的GO 和KEGG 分析的結(jié)果Figure 3 Results of the GO and KEGG analyses of the differentially expressed genes

2.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及樞紐基因生存分析

構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖4A。從PPI網(wǎng)絡(luò)中識(shí)別出得分最高的前15 個(gè)基因。見(jiàn)圖4B。通過(guò)KM plotter 分析出15 個(gè)樞紐基因在宮頸癌總生存期（OS）和無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS）中的作用，在OS 分析中包含了304 例宮頸癌患者，發(fā)現(xiàn)AURKA基因的高表達(dá)與宮頸癌患者總生存期較短顯著相關(guān)。見(jiàn)圖5A。RFS 分析中包含了174 例宮頸癌患者，發(fā)現(xiàn)AURKA基因的高表達(dá)與宮頸癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期較短顯著相關(guān)。見(jiàn)圖5B。

圖4 差異表達(dá)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)和模塊分析Figure 4 PPI network and module analysis of DEGs

圖5 樞紐基因的OS 及RFS 的相關(guān)性分析Figure 5 The correlation analysis between hub genes and OS or RFS of cervical carcinoma patients

2.4 樞紐基因在宮頸癌中表達(dá)的驗(yàn)證及臨床應(yīng)用價(jià)值分析

AURKA基因在宮頸癌組織中上調(diào)。見(jiàn)圖6A。在不同種族人群中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖6B。但在人類蛋白圖譜中，AURKA基因在宮頸癌組織的蛋白表達(dá)水平顯著高于正常宮頸組織圖。見(jiàn)圖6C。采用受試者工作特征（ROC）曲線來(lái)評(píng)估AURKA基因表達(dá)水平對(duì)區(qū)分宮頸癌組織和正常宮頸組織的預(yù)測(cè)價(jià)值。見(jiàn)圖6D。ROC 曲線下面積（AUC）為0.999。收集10 對(duì)臨床樣本進(jìn)行AURKA基因在宮頸癌及癌旁組織中表達(dá)的免疫組化驗(yàn)證，結(jié)果顯示，AURKA基因在宮頸癌組織中表達(dá)增高。見(jiàn)圖7A～7B。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖7C。不同分化程度癌組織表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖7D-7F。

圖6 AURKA 基因在宮頸癌中表達(dá)的驗(yàn)證Figure 6 Validation of the expression of the AURKA genes in cervical carcinoma

圖7 AURKA 基因在宮頸癌組織中的表達(dá)Figure 7 The expression of the AURKA genes in cervical carcinoma tissues

3 討論

宮頸癌是起源于子宮頸的惡性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)中最廣泛的惡性腫瘤［8-9］。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與多種遺傳和環(huán)境因素相關(guān)［10］。為了識(shí)別潛在的生物標(biāo)志物，仍需要進(jìn)行大量詳細(xì)的研究，包括治療方案、途徑、機(jī)制和預(yù)后。本研究中，分析了來(lái)自三個(gè)GEO 數(shù)據(jù)集（GSE9750、GSE46857 和GSE52903）的差異表達(dá)基因，得到30 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，49 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，對(duì)差異基因進(jìn)行GO 和KEGG 通路研究發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要與“細(xì)胞周期”、“孕酮介導(dǎo)的卵細(xì)胞成熟”和“鉑耐藥性”信號(hào)通路有關(guān)。此外，通過(guò)分子相互作用的分析，進(jìn)一步篩選出前15 個(gè)樞紐基因并進(jìn)行了預(yù)后生存分析，發(fā)現(xiàn)了AURKA基因的高表達(dá)與宮頸癌患者總生存期較短顯著相關(guān)。同樣，RFS 分析發(fā)現(xiàn)AURKA基因的高表達(dá)與宮頸癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期較短相關(guān)。對(duì)AURKA基因的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其在宮頸癌組織中mRNA 和蛋白的表達(dá)均上調(diào)，但無(wú)種族人群差異。最后，通過(guò)ROC 曲線分析進(jìn)一步表明AURKA基因在宮頸癌中具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。

AURKA是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞有絲分裂中起著重要的調(diào)節(jié)作用［11］。AURKA在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，是中心體復(fù)制、成熟和分離的關(guān)鍵［12］。這與本研究GO 和KEGG 分析得到的結(jié)果吻合。研究表明，AURKA在大多數(shù)人類癌癥中升高與肺癌、肝癌和結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)［13-15］。AURKA作為一種致癌基因，影響許多腫瘤的生物學(xué)過(guò)程，如增殖、基因組的不穩(wěn)定性、侵襲和轉(zhuǎn)移［16］。Liu 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，AURKA抑制劑可通過(guò)與AURKA結(jié)合誘導(dǎo)G2/M 期阻滯和線粒體誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)源性凋亡。Shao 等［18］報(bào)道了子宮頸癌患者組織中AURKA的表達(dá)明顯增加。進(jìn)一步研究表明，hsa_circ_0075341 通過(guò)隔離miR-149-5p 和上調(diào)AURKA的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Van Horn 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，CDK1 的激活啟動(dòng)了AURKA所參與的有絲分裂的激活［19］。此外，被激活的AURKA和PLK1 進(jìn)一步在作用于CDK1，促進(jìn)有絲分裂，并參與有絲分裂中的紡錘體形成和中心粒分裂。近期，Wang 等［20］綜合多個(gè)GEO 數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)CDK1 和PRC1 與良好的生存期相關(guān)，而AURKA與較差的生存期相關(guān)。本研究綜合GSE9750、GSE46857 和GSE52903數(shù)據(jù)集分析，發(fā)現(xiàn)AURKA在宮頸癌中表達(dá)顯著增高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AURKA與宮頸癌的總生存期及無(wú)復(fù)發(fā)生存期密切相關(guān)，TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)和臨床樣本進(jìn)一步驗(yàn)證了AURKA在宮頸癌的高表達(dá)，且無(wú)種族人群差異。重要的是ROC 曲線分析亦顯示AURKA在宮頸癌中具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，AURKA可能作為宮頸癌檢測(cè)和靶向治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。