陽 靜,劉佳英*,王云沛,施宜佳

(1.集美大學水產(chǎn)學院,福建 廈門 361021; 2.福建省海洋漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室,福建 廈門 361021)

瘦枝珊瑚屬(Carijoa)隸屬于珊瑚蟲綱(Anthozoa)、八放珊瑚亞綱(Octocrallia)、軟珊瑚目(Alcyonacea)、根枝珊瑚亞目(Stolonifera)、棒花軟珊瑚科(Clavulariidae)。該屬珊瑚對環(huán)境適應性強,廣泛分布于熱帶及亞熱帶的珊瑚礁區(qū)、紅樹林區(qū),甚至能生活在富含有機物的渾濁水域[1]。作為八放珊瑚的成員之一,同其他八放珊瑚一樣,在維持海洋生態(tài)系統(tǒng)結構完整性和生物多樣性方面具有重要作用[2],該屬物種主要以浮游動物和有機顆粒為食[3]。瘦枝珊瑚屬于1867年建立[4],世界海洋物種名錄(World Register of Marine Species,WoRMS,https://www.marinespecies.org/)于1998年記錄該屬,截止2022年10月5日WoRMS顯示有效物種2種,Carijoaoperculata和Carijoariisei。

2022年戴昌鳳報道中國臺灣附近海域棲息有Carijoariisei,同時發(fā)現(xiàn)該屬一新物種Carijoananwanensis[5]。中國大陸對于該屬物種的研究,僅有楊順良等[6]對于瘦枝珊瑚屬待定種Carijoasp.名錄式報道及未定種生物活性[7-9]的研究,并未有形態(tài)學的描述。在關于瘦枝珊瑚屬物種的地理分布及物種鑒定研究中,1860年Duchassaing等在安的列斯群島附近發(fā)現(xiàn)瘦枝珊瑚屬物種,鑒定為Clavulariarusei,后更正為Carijoariisei,該物種為此屬最早發(fā)現(xiàn)的物種[10]。1866年Verrill對Balanus附近發(fā)現(xiàn)的珊瑚物種進行初步形態(tài)學描述后,鑒定為Carijoarupicola,后經(jīng)學者確認C.rupicola為C.riisei的同種異名[11]。1961年Bayer在西印度地區(qū)發(fā)現(xiàn)一新物種并命名為Telestooperculata,后更正為瘦枝珊瑚屬Carijoaoperculata[12]。

目前對瘦枝珊瑚屬的研究主要由形態(tài)學方法為主,分子系統(tǒng)發(fā)育研究為輔。近年來隨著分子生物學技術的快速發(fā)展,基因片段定序在珊瑚分類研究中得以廣泛應用。Concepcion等通過對C.riisei的個案研究,發(fā)現(xiàn)核標記編碼信號識別顆粒54 kDa亞基(SRP54)核基因在序列上具有較高水平的變異,并對近緣物種生物地理學的研究具有重要意義[13]。1972年C.riisei首次在夏威夷附近海域被發(fā)現(xiàn),同時該海域的C.riisei被認為起源于加勒比海。Concepcion等為確認夏威夷附近海域的C.riisei起源,利用線粒體基因(mtDNA)和核基因(nDNA)基因序列對采集于夏威夷和世界各地的244株C.riisei樣本進行了研究,結果發(fā)現(xiàn)夏威夷C.riisei原產(chǎn)于印度-太平洋[14]。Easton等報道了C.riisei完整的線粒體基因組[15]。而有關該屬另一物種C.operculata分子信息未見有關報道。截止2022年3月14日NCBI查詢到該屬共有90條分子數(shù)據(jù)。

國內外廣泛開展了瘦枝珊瑚屬次級代謝產(chǎn)物及其生物活性的研究,發(fā)現(xiàn)其次級代謝產(chǎn)物對藥物篩選具有啟示作用,從Carijoa屬珊瑚中提取的化合物具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗菌等功效[7-8,16-17]。此外,韓磊對瘦枝珊瑚屬Carijoasp.提取物的化學生態(tài)學作用進行了研究[9]。以上關于瘦枝珊瑚活性物質的研究,多數(shù)基于該屬的待定種,這不利于未來對其活性物質的深入研究以及生產(chǎn)應用。因此,需要對該屬物種進行深入的分類研究。

黃宗國等主編的《廈門灣物種多樣性》一書顯示,廈門灣歷史上記錄有珊瑚蟲綱19科56種,其中八放珊瑚28種[18]。黃暉等在廈門灣鎮(zhèn)海角及浯嶼發(fā)現(xiàn)4科7屬9種八放珊瑚[19]。楊順良等在對福建沿海進行珊瑚資源調查時,累計記錄9科22屬54種八放珊瑚,其中瘦枝珊瑚為待定種[6]。

為了解廈門灣瘦枝珊瑚屬物種及其分布現(xiàn)狀,對從廈門灣采集的25株瘦枝珊瑚屬樣本進行了形態(tài)學和基因片段定序技術的研究,并對該屬珊瑚的空間分布進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 調查方法與樣品采集

2014—2021年在廈門灣內白哈礁、角嶼等10個島嶼附近海域進行潛水調查采樣,具體采樣站位信息見表1。

表1 采樣站位信息Tab. 1 Sampling station and their locations

1.2 樣本處理、觀察與鑒定方法

將珊瑚樣本帶回實驗室,對樣本進行編號、觀察樣本外觀形態(tài)、顏色等,拍照并記錄描述群體特征及測量數(shù)據(jù)。利用解剖鏡(Nikon SMZ1270)對樣本中軸、珊瑚蟲收縮及舒展狀態(tài)進行觀察并拍照。截取5～6 cm左右珊瑚枝條保存于95%乙醇中用于形態(tài)鑒定與分子生物學實驗,剩余樣本放置于-70 ℃超低溫冰箱保存。

利用5%次氯酸鈉溶解分離骨針,骨針用蒸餾水洗凈,并用鼓風干燥器烘干,利用廈門大學國家重點實驗室的掃描電子顯微鏡(SEM,G5 Phenom ProX2017)拍攝珊瑚骨針。

物種鑒定參考Galván-Villa等[20]、Concepcion等[14]發(fā)表的文獻,及《Soft corals and sea fans》[21]、戴昌鳳等出版的《臺灣珊瑚全圖鑒(下):八放珊瑚》[5]以及世界海洋物種名錄。

1.3 DNA的提取、引物合成

利用TIANamp海洋動物組織基因提取試劑盒,按照說明書提取瘦枝珊瑚樣本的基因組DNA。使用的PCR擴增引物為COⅠ:COⅠoct 5′-ATCATAGCATAGACCATACC-3′和COII8068F 5′ -CCATAACAGTAGCAGCATC-3′[22]、ND2:16S-647F 5′-ACACAGCTCGGTTTCTATCTACAA-3′和ND2-1418R 5′-ACATCGGGAGCCCACATA-3′[23]。

1.4 PCR擴增及測序

PCR反應體系總體積為50 μL :DNA聚合酶2×PCR Mix(購自蘭博利德公司) 25 μL;上下游引物各2.5 μL;DNA 模板2 μL;去離子水18 μL。

PCR反應條件:3 min 預變性(94 ℃),30 s 變性(94 ℃) ,30 s 退火,1 min延伸(72 ℃) ,共35 個循環(huán),最后72 ℃延伸7 min(各個引物的退火溫度依據(jù)各引物Tm值,其他程序不變,如COⅠ:50 ℃;ND2:55 ℃)。擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中檢測,選取擴增條帶單一、濃度較高的PCR產(chǎn)物,產(chǎn)物的純化和測序由生工生物工程(上海)股份有限公司進行。用BioEdit軟件對測序所得序列進行編輯、剪切、校正,再將校正好的序列與NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫進行同源性比對,以確保所獲得的序列為目標序列。序列堿基組成分析利用DNAMAN 6.0.3.99軟件。

1.5 系統(tǒng)進化樹的構建

使用本研究所擴增的COⅠ序列3條、ND2序列3條與NCBI基因庫中COⅠ序列16條、ND2序列21條共同構建系統(tǒng)發(fā)育樹,系統(tǒng)發(fā)育進化樹外群的選擇為瘦枝珊瑚屬同科(Clavulariidae)下的不同屬,包括Cervera屬、Clavularia屬、Rhodelinda屬及Telesto屬。首先利用MEGA7.0進行序列比對,基于Kimura 2-parameter(K2P)雙參數(shù)模型,通過鄰位連接法(Neighbor-joining, NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹,置信度來自1 000次非參數(shù)自展(bootstrap)抽樣分析。

2 結果

2.1 形態(tài)學鑒定結果

CarijoaMüller,1867

ClavulariaruseiDuchassaing &Michelotti, 1860:310

CarijoarupicolaMüller, 1867:330-332,Fig.56-57

TelestoafricanaVerrill, 1870:372,Fig.3

模式種:Carijoariisei(Duchassaing &Michelotti, 1860);模式產(chǎn)地:安的列斯群島(Antilles)

研究樣本編號:20210403-XB-3-18

珊瑚體:珊瑚體分枝型,枝條為細長狀,主枝以合軸分枝型衍生次生分枝,酒精浸泡后主枝長度約12 cm,枝干顏色為淡橙色,主枝表面具有縱向的溝槽,分枝中空圓柱形,可彎曲,分枝軸直徑約為1.7 mm。分枝管狀莖由匍匐的基底相連,基底下生有更細小的管狀根系。每個分枝末端都有一個突出水螅體,分枝末端附近水螅體分布相較于其他部位密集。

水螅體:單體型,可以自由收縮,觸手可縮回的部分為羽枝狀,白色。水螅體細管狀,單個伸展的水螅體約3.5 mm長,收縮的水螅體約3.0 mm,通常成對或三個一組分布于分枝側面及頂端(圖1)。

圖1 C. riisei外部形態(tài)、中軸和珊瑚蟲Fig. 1 External morphology, axis and polyps of C. riisei(a)酒精浸泡珊瑚樣本;(b)基底;(c)水螅體伸展;(d)水螅體收縮;(e)中軸;(f)觸手骨針排列;(g)管狀莖。

骨針:多數(shù)為柱形骨針,在柱形骨針外帶有棘突,細長、不規(guī)則。水螅體具有小柱狀骨針,水螅體管壁具有稍彎曲的紡錘形骨針,骨針長約0.08～0.40 mm,分枝骨針為具有多棘突的柱狀骨針,骨針長約0.11～0.35 mm(圖2)。

圖2 C. riisei骨針Fig. 2 Sclerites of C. riiseiA:珊瑚蟲及管壁骨針;B:分枝骨針,比例尺為0.2 mm。

顏色:酒精浸泡后水螅體呈白色或奶白色,枝干為淡橙色,凍干珊瑚樣本為淡綠色。

全球分布:哥倫比亞[24-25]、墨西哥科利馬的曼薩尼約港[20]、波爾圖德加林哈斯[26]、夏威夷[27]、巴西[28]、安達曼和尼科巴群島[29]、印度尼西亞[30]、曼納爾灣[31]、庫奇灣[32]、西大西洋、佛羅里達、加勒比海、丘克、帕勞、菲律賓、澳大利亞、蘇門答臘、馬尼拉、泰國[33]。

2.2 堿基序列組成分析

通過擴增測序得到樣本20160529-BH-3-1、20160826-BH-3-1及20210403-XB-3-18的COⅠ、ND2基因序列各1條。COⅠ基因序列長度為671～698 bp,堿基組成為:T含量36.8%～37.3%; C含量16.2%～16.5%; G含量19.6%～19.7%; A含量26.5%～27.0%。ND2基因序列長度為678～720 bp,堿基組成為:T含量33.2%～34.7%; C含量16.4%～16.7% ; G含量21.3%～22.0% ;A含量27.6%～28.0%。擴增所得的基因堿基序列A、T的含量均高于G、C,具有明顯的AT偏倚。

2.3 基于COⅠ、ND2基因對珊瑚進行系統(tǒng)進化分析

利用MEGA7.0對所得COⅠ、ND2基因序列進行排序并裁剪序列后,通過鄰位連接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3、4)。

圖3 NJ法構建的COⅠ基因片段系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of COⅠ sequences constructed by NJ method

圖4 NJ法構建的ND2基因片段系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of ND2 sequences constructed by NJ method

COⅠ基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖3所示,19個樣本數(shù)據(jù)聚為2個大分支,Carijoa屬、Cervera屬、Clavularia屬為一個大分支,Rhodelindasp.單獨為一個分支。樣本20160529-BH-3-1、20160826-BH-3-1和20210403-XB-3-18與C.riisei聚為一支,與同科下另一屬物種Rhodelindasp. 親緣關系較遠。

ND2基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖4所示,24個樣本數(shù)據(jù)聚為2個大分支,分別為Carijoa屬、Clavularia屬為一支,Telesto屬與Rhodelinda屬為一支。其中樣本20160529-BH-3-1、20160826-BH-3-1和20210403-XB-3-18與C.riisei聚為一支,與Telesto屬和Rhodelinda屬親緣關系較遠。

2.4 廈門灣瘦枝珊瑚C. riisei的空間分布

對2014—2021年潛水調查采集的25株瘦枝珊瑚樣本的站位進行統(tǒng)計分析,結果見表2,其中6個站位有C.riisei分布,分別是小佰嶼、角嶼、白哈礁、上嶼、鼓浪嶼和火燒嶼站位,表明C.riisei在廈門灣內分布較廣。由于本研究的樣本是歷年調查的結果,白哈礁站位與角嶼站位樣本數(shù)量多可能是因為這兩個站位調查的頻次較多,采樣相對全面。另外4個站位未見到瘦枝珊瑚屬分布,可能是該站位確實沒有C.riisei棲息,也可能是這些站位由于采樣頻次少,采樣不全面造成的。

表2 各站位C. riisei物種分布Tab. 2 Distribution of C. riisei species at stations surveyed

3 討論

瘦枝珊瑚屬自建屬以來,屬下物種多次出現(xiàn)變更,例如Carijoaarborea變更為Telestoarborea[34];Carijoamultiflora變更為Telestomultiflora[35]。說明Carijoa屬與Telesto屬下物種外部形態(tài)相似,易發(fā)生鑒定錯誤,因此對屬下物種進行鑒定時最好結合分子生物技術進行。本研究通過對C.riisei樣本的ND2基因片段構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹進行分析,結果顯示,Carijoa屬與Telesto屬物種在系統(tǒng)發(fā)育進化樹未聚為一支,可以將二屬物種區(qū)分開來。

Dhivya等給出的C.riisei關鍵的識別特征為:①八根白色羽狀觸手;②每個高的軸向水螅體都有許多短的側水螅體;③骨針纖細,有分叉,末端不鈍且多刺[29]。樣本20210403-XB-3-18與Dhivya等[29]、戴昌鳳[5]、Verrill[11]及Müller[4]對C.riisei物種的形態(tài)學特征描述吻合,但與Duchassaing等[10]發(fā)現(xiàn)的顏色灰紅色不一致,可能是環(huán)境導致的表型靈活性或是酒精浸泡后導致珊瑚體變色。樣本20210403-XB-3-18單個伸展的水螅體約3.5 mm長,收縮的水螅體約3.0 mm,Verrill測量的水螅體長度為2.53～3.04 mm[11],戴昌鳳測量的水螅體長度為2～5 mm[5],數(shù)據(jù)基本相符。

樣本20210403-XB-3-18珊瑚蟲骨針約0.08～0.40 mm,分枝骨針約0.11～0.35 mm。Verrill未對珊瑚蟲及共肉骨針進行區(qū)分,但測量了較粗壯骨針長度,約達0.252 mm,細長骨針達0.528 mm[11];Yogesh-Kumar等描述骨針為細長桿狀,上有棘刺,長約0.1～0.4 mm[32];戴昌鳳描述了水螅體管壁含細長彎曲的紡錘形骨針,長約0.20～0.35 mm,分枝含多突起的柱形骨針,長約0.15～0.30 mm[5]。樣本20210403-XB-3-18骨針與前人描述基本吻合,因而形態(tài)學鑒定為C.riisei。

在分子生物學方面,線粒體ND2基因是變異較大的基因,適合屬以上階元系統(tǒng)發(fā)育研究[36]。COⅠ基因具有長度適宜、進化速率慢及富含系統(tǒng)發(fā)育信號等特點[37],被廣泛用于屬間、種間或群體水平等系統(tǒng)進化分析[38]。例如Mcfadden等研究表明,COⅠ基因能夠有效區(qū)分Alcyonium屬70%的物種[22]。徐雨在金柳珊瑚科的鑒定中利用mtMutS基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹,表明mtMutS基因系統(tǒng)發(fā)育樹支持Iridogorgiadensispicula為新種的有效性[39]。周洋等在肉芝軟珊瑚屬(Sarcophyton)的鑒定上運用了msh1及COⅠ基因片段,結果表明二者對肉芝軟珊瑚屬的分子鑒定具有一定的輔助作用[40]。Liu等在星柳珊瑚屬(Astrogorgia)下3個物種鑒定分析中,表明COⅠ基因片段系統(tǒng)發(fā)育結果支持形態(tài)學鑒定結果[41]。

本研究利用COⅠ、ND2基因序列構建的系統(tǒng)進化樹表明,樣本20160529-BH-3-1、20160826-BH-3-1及20210403-XB-3-18與數(shù)據(jù)庫中的C.riisei聚為一支,系統(tǒng)發(fā)育結果支持形態(tài)學鑒定結果。GenBank中C.riisei的COⅠ、ND2基因片段數(shù)據(jù)較全,有COⅠ序列 4條、ND2序列 1條、16S-ND2-ND6-ND3序列 30條。由此對該屬進行物種鑒定研究時,可以運用以上基因片段。

4 結論

(1)對2014—2021年在廈門灣采集的25株瘦枝珊瑚屬樣本進行鑒定,結果顯示是瘦枝珊瑚屬物種Carijoariisei。C.riisei是廈門灣首次記錄的瘦枝珊瑚屬物種,也是除了在中國香港和臺灣外,在中國大陸近海海域首次記錄到該種。C.riisei豐富了廈門灣和中國大陸近海海域的珊瑚物種多樣性記錄和地理分布信息,也為全球Carijoa屬珊瑚地理信息研究提供重要數(shù)據(jù)支撐。

(2)C.riisei在廈門灣內空間分布較廣,如廈門灣內的小佰嶼、角嶼、白哈礁、鼓浪嶼、上嶼和火燒嶼的附近海域都有該物種棲息分布。