李鴻鈺,楊 豐,李 鈁

(自然資源部第三海洋研究所,福建 廈門 361005)

甲殼動物是一個非常多樣化的類群,多數(shù)生活在海洋中[1-2]。甲殼動物具有開管式循環(huán)系統(tǒng)[3-4],依靠天然免疫(也稱“非特異性免疫”)來抵御病害。血細胞作為甲殼動物的主要免疫細胞,參與了吞噬、包囊、結節(jié)等細胞免疫過程,以及黑化、凝血和抗菌肽產(chǎn)生等體液免疫過程[2, 5-7]。甲殼動物血細胞根據(jù)其形態(tài)學特征通常分為3個類型,即透明細胞(hyaline cell,HCs)、半顆粒細胞(semigranular cell/small granular cell,SGCs)和顆粒細胞(granular cell/large granule cell,GCs);其中,HCs體積最小,核質(zhì)比最大,胞內(nèi)幾乎不含顆粒;GCs體積最大,核質(zhì)比最小,胞內(nèi)充斥著大量顆粒;SGCs的體積大小、核質(zhì)比及胞內(nèi)顆粒的數(shù)量與尺寸都介于HCs和GCs之間。但紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)的循環(huán)血細胞主要為SGCs和GCs,HCs非常少見[8-9]。目前已知的SGCs特異性分子標記有pl-TGase1[10]、KPI[9]、hemolctin[11]、hcPcSPI2[12]、MjVRP[13]、CHF[14];GCs特異性分子標記有pl-TGase2[10]、SOD[9]、MBL[15]、Crustin1[11]、Peroxinectin[16]和MBP[16]。這些已知的特異性分子標記為研究血細胞的功能和分化提供了便利。

血細胞在免疫反應中會被消耗,需要及時補充。因此,活躍的造血能力對甲殼動物的生存至關重要。但與脊椎動物相比,人們對無脊椎動物的造血機制知之甚少。對十足目甲殼動物的研究顯示,其造血組織(hematopoietic tissue,HPT)位于胃的背側,是一層薄片狀的組織,里面包裹著造血干細胞/前體血細胞[2,17-19]。有研究根據(jù)形態(tài)特征將螯蝦HPT中的細胞分為了5種類型,其中1型細胞和2型細胞是增殖細胞,它們可以分化為SGCs和GCs;而3型、4型及5型細胞不具備分裂的能力,其中3型和4型細胞可能是GCs的前體細胞,而5型細胞可能是SGCs的前體細胞[20-21];該研究認為前體細胞在HPT中發(fā)育,隨著被釋放而變得成熟。但上述推論主要是基于細胞的形態(tài)學特征,并沒有直接證據(jù)證明HPT細胞之間及它們與循環(huán)血細胞之間的關系。前期研究利用熒光標記和異體移植技術在螯蝦體內(nèi)追蹤了血細胞的分化過程。結果發(fā)現(xiàn)幾乎所有的血細胞都沿著GCs譜系發(fā)育分化,而SGCs只是代表了血細胞的未成熟階段。前體血細胞在HPT中先經(jīng)過3天左右的增殖和分化,隨后以SGCs的形式被釋放到循環(huán)中并繼續(xù)其分化過程。循環(huán)中的幼稚血細胞最快可在一個月左右發(fā)育為GCs[16]。目前,已有幾種蛋白被證明可能參與甲殼動物造血的調(diào)控。其中較為重要的是Astakine,該細胞因子在甲殼動物中存在兩種亞型,分別是Astakine1和Astakine2。有研究者認為Astakine1具有誘導HPT細胞分化為SGCs的能力;而Astakine2與GCs分化成熟相關[14]。但在上述研究中,研究者主要是根據(jù)原代造血組織細胞的貼壁鋪展和遷移情況來判斷其是否分化,缺乏Astakine誘導細胞分化的直接證據(jù)。因此,究竟哪些因子在血細胞形成過程中起到調(diào)控作用還未可知。研究發(fā)現(xiàn)紅螯螯蝦的肌肉提取液(muscle extract, ME)可誘導體外培養(yǎng)的HPT細胞分化為成熟GCs[22],這一結果說明紅螯螯蝦的肌肉提取液中存在一種可誘導血細胞分化的因子。

為了探究螯蝦體內(nèi)血細胞分化因子的基本性質(zhì),為后期分離鑒定奠定基礎,本研究以原代培養(yǎng)的螯蝦HPT細胞作為測試誘導分化活性的體外模型,分析了該因子在不同動物體內(nèi)的分布,并對其熱穩(wěn)定性、溶解性、帶電性、對蛋白酶的耐受性及分子量大小范圍進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

紅螯螯蝦購自漳州原生態(tài)農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖場,飼養(yǎng)于25 ℃左右的環(huán)境,隔天換水喂食,檢測無螯蝦常見病原白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus, WSSV)和十足目虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1, DIV1)。暫養(yǎng)一月再用于實驗。

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、紅石斑魚(Epinephelusgoreensis)及疣荔枝螺(Reishiaclavigera)均購自廈門市第八菜市場;東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)購自于淘寶。

1.2 肌肉提取液的制備

分別取5 g紅螯螯蝦、中華絨螯蟹、凡納濱對蝦、東亞飛蝗、疣荔枝螺或紅石斑魚的肌肉組織置于50 mL Leibovitz’s-15(L-15)培養(yǎng)基(Gibco公司)中冰浴勻漿;4 ℃,11 172 r/min,離心20 min;取上清液于56 ℃加熱40 min;4 ℃,17 956 r/min,離心20 min;上清液用0.22 μm過濾器過濾除菌后保存在-20 ℃冰箱中。上述提取液將用于不同動物肌肉提取液誘導HPT細胞分化的實驗。

取10 g紅螯螯蝦的肌肉組織置于100 mL超純水中冰浴勻漿;4 ℃,11 172 r/min,離心20 min;取上清液于56 ℃加熱40 min;4 ℃,17 956 r/min,離心20 min;上清液用0.22 μm過濾器過濾除菌后保存在-20 ℃冰箱中,上述提取液用于目標血細胞分化因子的熱穩(wěn)定性、溶解性、帶電性等性質(zhì)的分析。

1.3 紅螯螯蝦HPT細胞原代培養(yǎng)及誘導

按文獻所述方法分離HPT細胞[23-24]:解剖取出HPT,用含雙抗的CPBS(10 mmol/L Na2HPO4、10 mmol/L KH2PO4、0.15 mol/L NaCl、10 μmol/L CaCl2、10 μmol/L MnCl2、2.7 μmol/L KCl、pH 6.8)的溶液清洗5次;將HPT在0.2%的膠原酶溶液(用CPBS配制)中30 ℃消化30 min,期間每10 min輕輕搖晃30次;消化完畢用槍頭輕吹HPT 30次,去掉大塊組織;于室溫2 000 r/min離心2 min,棄上清液;加入L-15培養(yǎng)基1 mL清洗一次;2 000 r/min離心2 min,棄上清后加入L-15重懸,用孔徑為70 μm的細胞濾網(wǎng)過濾去除組織碎片;將游離的細胞以4×105個/孔的密度接種于48孔板中,27 ℃培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)基替換為誘導培養(yǎng)基或者陰性對照培養(yǎng)基。誘導培養(yǎng)基為:L-15+1% FBS + 1%雙抗+不同動物的肌肉提取液(肌肉組織提取液按10%的比例加入培養(yǎng)基)或經(jīng)不同處理過后的螯蝦肌肉提取液;陰性對照培養(yǎng)基:L-15+1% FBS+1%雙抗。每天觀察細胞的狀態(tài),每7天更換一半培養(yǎng)液,分別在誘導后第0天(d)、7 d、14 d及21 d拍照記錄細胞狀態(tài)。每個實驗重復3次,每次3組平行樣。

1.4 GCs和SGCs的純化

利用Percoll(GE Healthcare公司)密度梯度離心法純化SGCs和GCs[25]。首先配制Percoll不連續(xù)密度梯度:以1∶10的比例向Percoll中加入1.5 mol/L NaCl即為100% Percoll;用50%抗凝劑將100% Percoll分別稀釋成70% Percoll和20% Percoll;然后向流式管中依次加入270 μL 100% Percoll、2 mL 70% Percoll和1 mL 20% Percoll得到最終的密度梯度。用預冷的等體積抗凝劑抽取紅螯螯蝦血淋巴;在4 ℃下以1 727 r/min離心5 min收集血細胞,將血細胞以1×107個/mL的濃度重懸于抗凝劑當中。得到的細胞懸液(200 μL)緩慢加在預冷的Percoll密度梯度上,在4 ℃下以1 810 r/min離心30 min來分離細胞。離心之后,SGCs分布在20%和70% Percoll的分界面上,而GCs分布在70%和100% Percoll的分界面上。分別收集每個分界面上的細胞并用6～10倍體積的抗凝溶液稀釋,4 ℃下2 064 r/min離心5 min收獲細胞。通過流式細胞儀與光學顯微鏡檢測純度。

1.5 總RNA的提取和qRT-PCR分析

1.5.1 總RNA的提取

用Eastep?Super總RNA提取試劑盒(上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司)提取RNA。離心收集純化的SGCs和GCs,加入試劑盒中的RNA裂解液進行裂解。體外誘導培養(yǎng)的細胞分別在誘導后第0 d、7 d、21 d取樣,每個時間點取3組平行樣。移除培養(yǎng)基后直接在孔內(nèi)加入RNA裂解液裂解細胞。最后均取8×105個裂解的SGCs、GCs及體外誘導培養(yǎng)的細胞,按試劑盒說明書提取總RNA,并通過DNase處理消除DNA污染。

1.5.2 qRT-PCR分析

以提取的總RNA為模板,使用HiScript?Ⅱ One Step qRT-PCR SYBR Green Kit (Vazyme)對目標基因的轉錄進行定量PCR檢測,引物序列如表1所示。PCR程序為:50 ℃逆轉錄3 min;95 ℃預變性30 s;隨后95 ℃/10 s,60 ℃/30 s擴增40個循環(huán)。反應完成后進行熔解曲線分析。以紅螯螯蝦β-actin作內(nèi)參基因,以誘導后第0 d的表達量為1,根據(jù)2-ΔΔCt分析目標基因的相對表達量,用雙尾檢測進行組間差異的顯著性分析。相對表達量以平均值±標準差表示,n=3。星號“*”表示兩組相比具有顯著性差異(“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01, “***”表示P<0.001)。

表1 qRT-PCR中使用的引物序列Tab. 1 Primer sequences used in qRT-PCR

1.6 血細胞分化因子的熱穩(wěn)定性分析

將用超純水提取的紅螯螯蝦肌肉提取液在100 ℃水浴加熱40 min;4 ℃,19 903 r/min,離心20 min;上清液過濾除菌后,作為添加劑加入培養(yǎng)基用來培養(yǎng)細胞,進行誘導分化活性測定。以未經(jīng)高溫處理的紅螯螯蝦肌肉提取液為陽性對照,僅添加1% FBS的L-15為陰性對照。實驗重復3次,每次3組平行樣。

1.7 血細胞分化因子的溶解性分析

將用超純水提取的紅螯螯蝦肌肉提取液在49 ℃干燥;分別用500 mL甲醇、乙腈、丙酮對其進行萃取,然后過濾萃取液;過濾液在49 ℃蒸干,得到萃取物,用純水溶解后作為添加劑加入培養(yǎng)基進行誘導活性檢測。我們將添加了10%的肌肉提取液的細胞培養(yǎng)基中目標因子的濃度設為1×濃度。假設肌肉提取液中所有具有目標因子均被萃取到相應的有機溶劑中,據(jù)此對萃取物的使用濃度進行換算。將與添加10%的肌肉提取液培養(yǎng)基所對應的萃取物濃度設為1×濃度,設置1×、2×、5×、10×濃度梯度。以未經(jīng)處理的紅螯螯蝦肌肉提取液為陽性對照,僅添加1% FBS的L-15為陰性對照。實驗重復3次,每次3組平行樣。

1.8 血細胞分化因子的帶電性特性分析

取陰離子吸附介質(zhì)Q Sepharose?High Perfor-mance (Pharmacia Biotech) 2 mL于吸附柱中并用純水洗滌3次;取甲醇萃取物溶液10 mL,緩慢加入柱中;將流出液反復加入柱中3次,保留流出液繼續(xù)進行陽離子吸附。

取2 g陽離子吸附介質(zhì)Bio-Rex?70 Resin (Bio-Rad)放入吸附柱中并用純水洗滌3次,將已過陰離子吸附柱的流出液緩慢加入柱中。重復3次,將保留流出液作為添加劑加入培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞以檢測活性。

如“1.7”所述,設置濃度梯度并設置陰性對照與陽性對照。實驗重復3次,每次3組平行樣。

1.9 血細胞分化因子的蛋白酶耐受性分析

羧肽酶A(Carboxypeptidase A, CPA,上海源葉生物科技公司)處理:取0.5 mL 50 mg/mL已過離子交換柱的甲醇萃取液置于1.5 mL離心管中,向內(nèi)加入終濃度為5.7 U/mL CPA溶液,渦旋混勻,50 ℃孵育4 h;再次加入終濃度為11 U/mL CPA溶液,渦旋混勻,50 ℃孵育2 h后100 ℃加熱15 min對CPA滅活;處理液放入-20 ℃保存,作為添加劑加入培養(yǎng)基用于誘導活性檢測。

胰蛋白酶(Trypsin,上海生工生物工程有限公司)處理:取0.5 mL 50 mg/mL已過離子交換柱的甲醇萃取液置于1.5 mL離心管中,向內(nèi)加入終濃度為0.6 mg/mL胰蛋白酶溶液,渦旋混勻,50 ℃孵育4 h;再次加入終濃度為1.2 mg/mL胰蛋白酶溶液,渦旋混勻,50 ℃孵育4 h后100 ℃加熱15 min對胰蛋白酶滅活;處理液放入-20 ℃保存,作為添加劑加入培養(yǎng)基用來培養(yǎng)細胞用于誘導活性檢測。

蛋白酶K(Proteinase K, PK, Amresco)處理方法:取1 mL 50 mg/mL已過離子交換柱的肌肉提取液置于1.5 mL離心管中,向內(nèi)加入終濃度為0.1 mg/mL PK溶液,渦旋混勻,60 ℃孵育3 h;再次加入終濃度為0.2 mg/mL PK溶液渦旋混勻,60 ℃孵育2 h后100 ℃加熱15 min,對PK滅活;處理液放入-20 ℃保存,作為添加劑加入培養(yǎng)基用于誘導活性檢測。

如“1.7”所述,設置濃度梯度并設置陰性對照與陽性對照。實驗重復3次,每次3組平行樣。

1.10 血細胞分化因子分子量范圍的確定

取4 mL 50 mg/mL已過離子交換柱的甲醇萃取液置于10 kDa超濾管(Milipore公司)中,4 ℃,7 498 r/min,離心30 min;將第一次濾出液的體積補足到4 mL,繼續(xù)將其加入3 kDa超濾管(Milipore公司)中,4 ℃,6 526 r/min,離心30 min;將得到的第二次濾出液的體積補足到4 mL,繼續(xù)將其加入1 kDa超濾管(Milipore公司)中,4 ℃,6 526 r/min,離心1 h;最后將得到的所有截流液和濾出液的體積都補足到4 mL后置于-20 ℃保存,后面作為添加劑加入培養(yǎng)基用于誘導活性檢測。

如“1.7”所述,設置濃度梯度并設置陰性對照與陽性對照。實驗重復3次,每次3組平行樣。

2 結果與討論

2.1 血細胞分化因子存在于多種動物的肌肉組織中

為了探究螯蝦肌肉提取液中所含的血細胞分化因子是否也存在于其他動物體內(nèi),我們選擇了節(jié)肢動物門中十足目的紅螯螯蝦、中華絨螯蟹和凡納濱對蝦,節(jié)肢動物門中直翅目的東亞飛蝗,軟體動物門中新腹足目的疣荔枝螺和脊索動物門中鱸形目的紅石斑魚這6種動物,制備肌肉組織提取液,再以10%的比例加入培養(yǎng)基中對HPT細胞進行誘導。

結果(圖1)顯示,紅螯螯蝦肌肉提取液[圖1(b)]、中華絨螯蟹[圖1(c)]、東亞飛蝗[圖1(d)]、紅石斑魚[圖1(e)]、疣荔枝螺[圖1(g)]、凡納濱對蝦[圖1(f)]的肌肉提取液與均能誘導HPT細胞向著GCs分化,但不同動物肌肉提取液誘導分化的能力有差異。如圖1所示,中華絨螯蟹、東亞飛蝗紅螯螯蝦的肌肉提取液的誘導能力較強。在以上3個誘導組中,HPT細胞在誘導后第7 d,細胞形態(tài)由最初的卵圓形變?yōu)樗笮?細胞質(zhì)中出現(xiàn)了一些細小的顆粒;誘導后第14 d,細胞內(nèi)的顆粒數(shù)量增多體積變大,細胞形變程度加大;誘導后第21 d,細胞形態(tài)與GCs類似,呈梭形,細胞質(zhì)內(nèi)充滿體積較大的顆粒。

圖1 紅螯螯蝦HPT細胞在被不同動物肌肉提取液誘導后細胞形態(tài)的改變Fig. 1 Morphology of C. quadricarinatus HPT cells induced by muscle extracts different animals圖片自左至右分別是誘導前、誘導后第7 d、誘導后第14 d及誘導后第21 d的細胞形態(tài);(a)未添加誘導劑培養(yǎng)的細胞;(b)至(g)為添加了不同肌肉提取液(分別為紅螯螯蝦、中華絨螯蟹、東亞飛蝗、紅石斑魚、凡納濱對蝦、疣荔枝螺)誘導培養(yǎng)的細胞,標尺為10 μm。

雖然疣荔枝螺和凡納濱對蝦的肌肉提取液也能誘導HPT細胞向GCs分化,但其誘導能力不及上述3種肌肉提取液。在誘導后的前7天,用疣荔枝螺和凡納濱對蝦的肌肉提取液誘導的HPT細胞的分化速度與用上述3種肌肉提取液誘導的HPT細胞分化速度類似,但在誘導后期分化速度變慢。誘導后第21 d細胞內(nèi)的顆粒并不多。紅石斑魚肌肉提取液的誘導能力最弱,直至誘導后第21 d,細胞中的顆粒仍未充分發(fā)育。陰性對照組細胞在實驗過程中無明顯形態(tài)變化。

上述結果說明目標血細胞分化因子并不僅僅存在于紅螯螯蝦的肌肉組織當中,也存在于以上5種動物的肌肉組織中,是一種普遍存在的物質(zhì)。根據(jù)細胞形態(tài)的改變速度推測這6種動物肌肉提取液誘導能力的強弱為:東亞飛蝗、中華絨螯蟹和紅螯螯蝦>凡納濱對蝦和疣荔枝螺>紅石斑魚。

2.2 血細胞誘導分化過程中標記基因的表達

為了確認細胞分化的情況,我們通過qRT-PCR分析了GCs、SGCs和HPT細胞標記基因在誘導過程中的表達。所用的分子標記有:HPT細胞分子標記(PCNA)[9],SGCs分子標記甲殼動物造血因子(crustacean hematopoietic factor,CHF)[14]、半乳糖特異性凝集素(galactose-specific lectin nattectin-like protein GS-lectin,數(shù)據(jù)未發(fā)表)和GCs特異性分子標記粘附因子(Peroxinectin)[16]、甘露糖結合蛋白(mannose-binding protein, MBP)[16]。實驗中以純化的SGCs和GCs作為對照。

PCNA作為HPT細胞的分子標記,在HPT細胞中的表達遠高于SGCs和GCs。加入不同動物的肌肉提取液誘導后第7 d PCNA的表達量比誘導后第0天上升了2～3倍。隨著誘導時間的增加,PCNA表達量逐漸下降(圖2)。我們推測血細胞分化因子可能對HPT細胞的增殖具有一定的促進作用,因而PCNA表達量在誘導后有所上升;但隨著誘導時間的增加,細胞逐漸走向分化,PCNA的表達量也隨之逐步降低。

圖2 qRT-PCR分析血細胞標記基因在誘導分化過程中的表達Fig. 2 qRT-PCR analysis of hemocyte marker gene expression in the cells induced by muscle extracts(a)紅螯螯蝦肌肉提取液;(b)中華絨螯蟹肌肉提取液;(c)東亞飛蝗肌肉提取液;(d)紅石斑魚肌肉提取液;(e)凡納濱對蝦肌肉提取液;(f)疣荔枝螺肌肉提取液。7 d:誘導后第7 d;21 d:誘導后第21 d。

在添加了紅螯螯蝦、中華絨螯蟹、東亞飛蝗的肌肉提取液的實驗組中,CHF和GS-lectin的表達量基本在誘導后第7 d達到最高值,然后逐漸下降;CHF的表達量比誘導后第0 d分別上升了5倍、12倍和13倍;GS-lectin的表達量較誘導后第0 d分別上升了17倍、13倍和3倍。隨著誘導時間的增長,Peroxinectin和MBP的表達量逐漸增加,到誘導后第21 d達到最高;Peroxinectin的表達量相較于誘導后第0 d分別上升了51倍、28倍和89倍;MBP的表達量相較于誘導后第0 d分別上升了74倍、11倍和216倍[圖2(a)、(b)、(c)]。

在添加了疣荔枝螺肌肉提取液的實驗組中,CHF、GS-lectin、Peroxinectin和MBP的變化趨勢與上述3個實驗組類似;但在誘導后第21 d Peroxinectin和MBP的表達量均不及上述3個實驗組細胞內(nèi)的表達量高[圖2(f)]。

而在添加了紅石斑魚和凡納濱對蝦的肌肉提取液的實驗組中,不論是SGCs的標記基因還是GCs的標記基因的表達時間均延后且表達水平低[圖2(d)、(e)]。

根據(jù)上述結果,我們認為紅螯螯蝦、中華絨螯蟹、東亞飛蝗的肌肉提取液的誘導能力>疣荔枝螺肌肉提取液>凡納濱對蝦和紅石斑魚的肌肉提取液。這一結果與形態(tài)學特征的變化情況基本一致。綜上所述,我們認為血細胞分化因子普遍存在于上述6種動物的肌肉組織中,但含量可能有所不同。

2.3 血細胞分化因子的熱穩(wěn)定性

根據(jù)上述實驗,目標血細胞分化因子在螯蝦肌肉提取液中含量較高,我們以螯蝦肌肉提取液為實驗材料,對目標血細胞分化因子的理化性質(zhì)進行初步的分析。首先我們對目標物質(zhì)進行了熱穩(wěn)定性分析:將紅螯螯蝦肌肉提取液100 ℃加熱40 min后作為添加劑加入培養(yǎng)基進行分化誘導;以56 ℃處理的肌肉勻漿液作為陽性對照[22],以未添加誘導劑的培養(yǎng)基作為陰性對照。結果發(fā)現(xiàn)(圖3),100 ℃加熱并不能使目標血細胞分化因子失活。隨著誘導時間的增長,高溫處理組細胞與陽性對照細胞發(fā)生了類似的變化,細胞形態(tài)由最初的卵圓形逐漸呈現(xiàn)梭形,細胞質(zhì)中逐漸出現(xiàn)顆粒,且顆粒的數(shù)量逐漸增多,尺寸也逐漸增大;陰性細胞幾乎無變化。由此,目標血細胞分化因子是一種耐熱性良好的物質(zhì)。由于高溫處理能使絕大部分蛋白質(zhì)變性,因此我們基本排除了血細胞分化因子是蛋白質(zhì)的可能性。

圖3 紅螯螯蝦肌肉提取液經(jīng)不同處理再誘導HPT細胞后細胞的形態(tài)改變Fig. 3 Morphological changes of HPT cells induced by muscle extract of C. quadricarinatus after different treatments圖片自左至右分別是誘導前、誘導后第7 d、誘導后第14 d及誘導后第21 d的細胞形態(tài);(a)僅添加1% FBS 培養(yǎng)的細胞;(b)添加56 ℃制備的紅螯螯蝦肌肉提取液培養(yǎng)的細胞;(c)至(i)為添加經(jīng)不同處理后得到的提取液培養(yǎng)的細胞,標尺為10 μm。

2.4 血細胞分化因子的溶解性

了解血細胞分化因子在有機溶劑中的溶解情況,有助于后期分離純化該因子時選擇合適的萃取溶劑。我們將制備好的肌肉提取液干燥后分別用甲醇、乙腈和丙酮進行萃取;經(jīng)處理后得到了有機溶劑萃取物的水溶液,并測試其誘導HPT細胞分化的活性。結果發(fā)現(xiàn),添加甲醇萃取物的細胞出現(xiàn)了類似陽性對照組細胞的變化,即到誘導后第21 d時細胞的形態(tài)呈梭形且胞質(zhì)中有許多較大的顆粒[圖3(d),圖片所示為甲醇萃取液培養(yǎng)的HPT細胞,其濃度為5×濃度];且HPT細胞分化的速度會隨著甲醇萃取物濃度升高而加快(表2)。而添加乙腈萃取物、丙酮萃取物的細胞和陰性細胞均未發(fā)生明顯改變(結果未顯示)。這證明了該血細胞分化因子易溶于甲醇,不易溶于乙腈和丙酮。

表2 血細胞分化因子的基本理化性質(zhì)Tab. 2 Physiochemical properties of hemocytes differentiation factor

2.5 血細胞分化因子的帶電性

為了解目標血細胞分化因子的帶電性,我們將肌肉提取液的甲醇萃取物依次經(jīng)陰離子交換柱和陽離子交換柱吸附,收集流出液及兩個離子交換柱的洗脫液,并測試其誘導分化活性。設置濃度梯度,以10%肌肉提取液培養(yǎng)的細胞作為陽性細胞,以未添加誘導劑的培養(yǎng)基作為陰性對照。結果發(fā)現(xiàn)[圖3(e),圖片所示為5×濃度誘導的HPT細胞],添加流出液進行培養(yǎng)的細胞與陽性細胞在誘導培養(yǎng)的過程中細胞形態(tài)發(fā)生類似的變化;它們逐漸向著GCs分化。誘導速度隨濃度上升(表2)。而陰性細胞與添加兩種洗脫液培養(yǎng)的細胞均無明顯變化。這說明了目標血細胞分化因子在水溶液中呈電中性。

2.6 血細胞分化因子對蛋白酶的耐受性

為了確定血細胞分化因子對蛋白酶的耐受性,我們分別用PK、CPA及胰蛋白酶對肌肉提取液進行處理。用蛋白酶處理后的肌肉提取液誘導HPT細胞,以未處理的肌肉提取液培養(yǎng)的細胞作為陽性對照,以未添加誘導劑的培養(yǎng)基作為陰性對照。結果發(fā)現(xiàn)[圖3(f)、(g)、(h)],圖片所示為5×濃度誘導的HPT細胞),添加經(jīng)3種不同蛋白酶處理后的肌肉提取液仍然可以誘導HPT細胞向著GCs分化,即細胞發(fā)生形變且在胞內(nèi)產(chǎn)生了大量顆粒,這一結果與陽性細胞的變化情況一致。誘導速度隨濃度加快(表2)。陰性組細胞未發(fā)生明顯變化。這表明血細胞分化因子可耐受蛋白酶處理。

2.7 血細胞分化因子的分子量

為了確定血細胞分化因子分子量的范圍,我們分別使用大小為10、3、1 kDa的超濾管將肌肉提取液進行分離。分成分子量范圍>10 kDa、>3～10 kDa、1～3 kDa、<1 kDa的4組添加劑用于培養(yǎng)HPT細胞并設置濃度梯度,同時設置陰性對照與陽性對照。結果發(fā)現(xiàn)[圖3(i),圖片所示為添加了經(jīng)1 kDa超濾管離心后得到的濾出液培養(yǎng)的HPT細胞,其濃度為5×濃度],添加分子量<1 kDa培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞出現(xiàn)了與陽性細胞相似的變化;且細胞分化的速度隨著濃度升高而加快(表2)。陰性細胞、添加分子量>10 kDa與分子量>3～10 kDa培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞中幾乎未發(fā)生變化。雖然用添加了分子量1～3 kDa培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞有分化的跡象,但細胞分化速度和程度遠不如前者(結果未顯示)。以上結果表明,目標血細胞分化因子的分子量<1 kDa。

由上述實驗分析獲得的這些基本的理化性質(zhì)(表2),我們可以確定目標血細胞分化因子易溶于甲醇,呈電中性,分子量小于1 kDa,具有良好的熱穩(wěn)定性,且可耐受蛋白酶處理。由此,我們推測目標血細胞分化因子可能并非蛋白質(zhì)或者直鏈小肽,更可能是某種小分子不帶電的物質(zhì)。上述結果為目標血細胞分化因子的分離鑒定提供了參考。根據(jù)上述性質(zhì),在對目標血細胞分化因子的分離純化中,可采用100 ℃加熱或者酶處理法除去肌肉提取液中絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)。然后通過甲醇萃取、陰陽離子交換柱層析和凝膠過濾法進一步純化目標物質(zhì)。

已被報道具有誘導細胞分化的效應因子有外泌體[26]、血小板衍生生長因子BB[27]、肝細胞生長因子[28]與成纖維生長因子[29]等。但這些效應物的實質(zhì)大多為蛋白質(zhì),并不符合血細胞分化因子具有良好的耐熱性且耐受蛋白酶處理這些特質(zhì)。值得注意的是,近些年關于氨基酸代謝的研究越來越多,有研究表明蘇氨酸和蛋氨酸的分解代謝是胚胎干細胞(ESC)生長和分化所必需的[30]。非必需氨基酸會促進人誘導多能干細胞(hiPSCs)向神經(jīng)譜系的分化[31]。氨基酸等小分子物質(zhì)基本符合血細胞分化因子的性質(zhì),有可能是我們尋找的血細胞分化因子。

3 結論

在本研究中,我們通過向體外培養(yǎng)的HPT細胞中添加不同動物的肌肉提取液觀察細胞的分化情況及檢測細胞分化過程中HPT細胞標記基因、SGCs標記基因和GCs標記基因的表達量,發(fā)現(xiàn)血細胞分化因子存在于紅螯螯蝦、中華絨螯蟹、東亞飛蝗、凡納濱對蝦、疣荔枝螺和紅石斑魚的肌肉組織中,但該血細胞分化因子的含量在不同動物體內(nèi)有所差異。進一步我們以螯蝦肌肉提取液為實驗對象,分析了血細胞分化因子的理化特性,結果發(fā)現(xiàn)該血細胞分化因子易溶于甲醇,呈電中性,具有良好的熱穩(wěn)定性,且可耐受蛋白酶處理,分子量小于1 kDa。由此,我們推測血細胞分化因子是一種廣泛存在的小分子類物質(zhì)。我們的研究為將來分離和鑒定該血細胞分化因子奠定了基礎。