余苗杰 徐忠鮮 蔣雪梅 王春花 趙嬋娟 戚文華* 竭航

（1 重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404100）（2 西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南充 637009）（3 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410125）（4 重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶 404155）（5 重慶市藥物種植研究所，重慶 408435）

林麝 (Moschus berezovskii) 是一種藥用經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其雄麝分泌的麝香是傳統(tǒng)中藥的重要成分，也是香水的定香劑，具有極高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，市場(chǎng)價(jià)格是黃金價(jià)格的3 倍以上。曾經(jīng)在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下，非法捕獵野生麝資源獲取麝香的情況時(shí)有發(fā)生，加上麝科動(dòng)物生存環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致野生種群數(shù)量驟減，已經(jīng)面臨極危處境，必須采取有效的保護(hù)和管理措施 (姜海瑞和徐宏發(fā)，2007)。麝類動(dòng)物已經(jīng)列入世界自然保護(hù)聯(lián)盟的瀕危物種紅色目錄中，在《中國(guó)生物多樣性紅色名錄》 中被列為極危等級(jí) (蔣志剛，2020)。中國(guó)是麝類動(dòng)物的主要分布區(qū)，為了保護(hù)這一珍貴的動(dòng)物資源，我國(guó)將所有麝類動(dòng)物均列為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物 (國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄，2021)。由于麝種群數(shù)量顯著下降，導(dǎo)致麝香的產(chǎn)量急劇下降。為了緩解麝香的供求矛盾，保護(hù)野生麝類資源，1958 年我國(guó)開(kāi)始人工養(yǎng)麝 (周繼武等，2000)。由于人工養(yǎng)麝技術(shù)不成熟、馴養(yǎng)環(huán)境不規(guī)范和發(fā)病率高等因素，導(dǎo)致圈養(yǎng)麝種群數(shù)量增長(zhǎng)緩慢 (呂向輝等，2009; Qiet al.,2011)。

microRNA (miRNA) 是一類長(zhǎng)18 ～ 25 nt 的非編碼RNA 分子，廣泛分布于動(dòng)植物的細(xì)胞，具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性 (Aduret al.,2017；紀(jì)會(huì)等，2019)。研究表明，miRNA 通過(guò)其序列與目標(biāo)mRNA 互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，從而使目標(biāo)mRNA 降解或抑制其翻譯，最終在轉(zhuǎn)錄后水平抑制目標(biāo)基因的表達(dá) (Kato and Slack, 2008)。目前，已經(jīng)在哺乳動(dòng)物發(fā)現(xiàn)1 000 余種保守的miRNAs(Mendell and Olson, 2012)，其與靶基因之間有一對(duì)多和多對(duì)一的互作關(guān)系 (Shinet al., 2010)。miRNA在動(dòng)植物的生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，已證實(shí)miRNA 不僅與消化系統(tǒng)疾病 (程海霞等，2017)、胰腺癌 (Xuet al., 2018) 和乳腺癌 (Maetal., 2007) 等多種疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，還參與到神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育 (Katarovaet al., 1998)、脂肪形成 (Guoet al., 2017)、卵巢發(fā)育 (Zhanget al.,2016) 等多種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。有些miRNA 保守性低，表達(dá)水平也較低，目前這類miRNA 的生物學(xué)功能尚未清楚 (Mendell and Olson, 2012)。

生物組織或器官共表達(dá)的miRNAs 通常在維持細(xì)胞組織的基礎(chǔ)生命活動(dòng)方面發(fā)揮重要作用，研究不同器官組織共表達(dá)的miRNAs 具有重要意義。心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織是林麝生理過(guò)程的重要器官或組織，我們使用RNA-seq 技術(shù)在Hi-seq 2500 測(cè)序平臺(tái)上對(duì)林麝的這6 種組織進(jìn)行small RNA 高通量測(cè)序。基于林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織miRNAs的表達(dá)譜，本研究進(jìn)一步分析林麝這6種組織miRNAs 的表達(dá)水平，尋找不同組織共表達(dá)的miRNA 和特異表達(dá)miRNA，探索特異表達(dá)miRNA 與其靶基因的相互作用，并且通過(guò)RT-qPCR 驗(yàn)證目標(biāo)特異表達(dá)miRNA 在林麝血液組織中的表達(dá)。通過(guò)對(duì)林麝的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織miRNAs 表達(dá)譜的研究，為進(jìn)一步探索林麝不同組織miRNAs 與其靶基因的調(diào)控作用提供科學(xué)依據(jù)和新思路。

1 研究方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為重慶市藥物種植研究所林麝繁育基地1 只自然死亡的雄性林麝，快速采集其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織，分別進(jìn)行分裝和標(biāo)記。將樣品送往實(shí)驗(yàn)室先置于4 ℃下冷藏，然后置于-80 ℃左右的干冰中保存，并快遞郵寄到測(cè)序公司。所有樣品采集符合動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理原則，符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)規(guī)定。

1.2 文庫(kù)的制備與測(cè)序

使用RNAiso 試劑從樣品組織中提取總RNA，并進(jìn)行分離，然后再用Qubit 3.0 熒光儀測(cè)定RNA的純度 (吸光度比，260/280) 和產(chǎn)率，使用Agilent Bioanalyzer 測(cè)定RNA 完整性數(shù) (RIN)，所有樣品的RNA 完整性數(shù)大于8.5，總RNA 樣本保存于-80 ℃下備用。RNA 樣本進(jìn)行純化后，采用Hiseq 2500 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序 (RNA-seq)，測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) (PRJNA541415)。

1.3 質(zhì)量控制

為保證信息分析的質(zhì)量，測(cè)序完成后首先處理原始數(shù)據(jù) (raw reads)，將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去接頭、去污染和去除低質(zhì)量的相關(guān)處理后，再對(duì)其進(jìn)行徹底過(guò)濾，過(guò)濾掉17 bp以下及35 bp以上的reads，得到純凈的干凈序列 (clean reads)，然后對(duì)這6 個(gè)樣本的干凈序列進(jìn)行篩選，并對(duì)所獲得的small RNA (sRNA) 長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。本研究中選取17 ～35 bp 的reads，后續(xù)分析可以直接使用這些高質(zhì)量的reads。

1.4 已知miRNA的鑒定

使用Bowtie 軟件 (Langmeadet al., 2009) 將測(cè)序所得的林麝sRNA 的clean reads 定位到林麝基因組；將比對(duì)到林麝基因組上的sRNA 與miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)中己知?jiǎng)游飉iRNA 前體序列進(jìn)行比對(duì)，識(shí)別和鑒定各樣本已知的miRNA。

1.5 miRNA表達(dá)水平

首先對(duì)林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織miRNAs 的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用RPM(Reads of exon model per Million mapped reads) 進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理 (Jieet al., 2019)。RPM = Exon Mapped Reads × 106/Total Mapped Reads，指每100 萬(wàn)個(gè)匹配上的片段中外顯子的片段數(shù)，用RPM 標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)可直接用于比較不同組織樣本中miRNA 的表達(dá)水平，也可直接用于miRNA差異表達(dá)分析。為明確不同miRNAs 在林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織中的表達(dá)特征，本研究選取表達(dá)豐度RPM ≥ 0.01 的miRNAs進(jìn)行分析。為了比較林麝不同組織miRNAs 的表達(dá)水平，根據(jù)miRNA 的表達(dá)量RPM 值將miRNA表達(dá)水平分為以下5 類：(1) 超低表達(dá)的miRNA(0 ＜ RPM ＜ 1)；(2) 低度表達(dá)的miRNA (1 ≤RPM ＜ 10)；(3) 中度表達(dá)的miRNA (10 ≤ RPM ＜100)；(4) 高表達(dá)的miRNA (100 ≤ RPM ＜ 600)；(5) 超高表達(dá)的miRNA (RPM ≥ 600)。特異miRNA是指某種miRNA 僅在某一器官或組織中表達(dá)(RPM ≥ 0.01)，而在其他器官或組織中不表達(dá)(RPM ＜ 0.01)。

1.6 miRNA靶基因互作分析

miRNA 互作是指為完成特定生物功能，多個(gè)miRNAs以協(xié)同和配合的方式靶向下游的基因。其可以特異性結(jié)合靶基因3′UTR 來(lái)抑制轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)。24 521 條已被miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的miRNAs 為本研究的基礎(chǔ)。我們利用10 個(gè)miRWALK (http://www. umm. uni heidelberg. de/apps/zmf/mirwalk) 的數(shù)據(jù)庫(kù)：PITA、RNAhybrid、PICTAR4、 DIANA-mT、 PICTAR5、 TargetScan、miRDB、miRanda、miRWalk與RNA22，然后使用生物信息學(xué)軟件Starbase (http://starbase.sysu.edu.cn/) 預(yù)測(cè)分析不同組織中miRNAs 的靶向基因，用在線工具string 分析得到靶向基因互作網(wǎng)絡(luò)后，再用Cytoscape3.7.2 (www. cytoscape. org) 把miRNAs 所預(yù)測(cè)到的靶基因互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用T-test 檢驗(yàn)不同器官組織miRNAs 表達(dá)豐度是否存在差異，顯著水平設(shè)置為P＜ 0.05。相關(guān)數(shù)據(jù)處理、分析用SPSS 18.0軟件進(jìn)行。

1.8 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證

在林麝肝臟miRNA 表達(dá)譜中隨機(jī)選取9 個(gè)miRNAs，以U6 snRNA 作為內(nèi)參基因，采用Taq-Man miRNA Assays 定量試劑盒，檢測(cè)候選miRNAs 在化膿病和健康林麝肝臟中的表達(dá)量，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算 (Deoet al., 2011)。候選miRNAs和內(nèi)參基因引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 miRNAs定量PCR的引物序列Table 1 Primer sequences of miRNAs for RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 林麝不同器官和組織miRNAs表達(dá)量分析

研究結(jié)果顯示，在林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織中，大多數(shù)miRNAs的表達(dá)屬于超低表達(dá)水平 (0 ＜ RPM ＜ 1) 和低度表達(dá)水平(1 ≤ RPM ＜ 10)，miRNA 的超低表達(dá)水平分別占36.36%、35.48%、32.34%、41.63%、37.37%和37.08%，miRNA 的低度表達(dá)水平分別占25.10%、27.26%、27.94%、23.92%、24.30%和25.70%。林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織有17.40% ～ 20.27%的miRNAs屬于中度表達(dá)水平(10 ≤ RPM ＜ 100)，分別占19.87%、19.74%、19.91%、17.40%、19.97%和20.27%；林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織中高表達(dá)水平和超高表達(dá)水平的miRNAs比例較接近 (圖1)。

圖1 林麝不同器官和組織miRNA表達(dá)水平Fig. 1 Expression levels of all miRNA in different organs and tissues of forest musk deer

2.2 林麝不同器官和組織共表達(dá)miRNAs分析

生物組織或器官共表達(dá)的miRNAs通常在維持組織細(xì)胞的基礎(chǔ)生命活動(dòng)方面發(fā)揮重要作用，因此，研究不同器官和組織共表達(dá)的miRNAs具有重要意義。林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織中共表達(dá)的miRNAs 有1 650 個(gè) (表達(dá)豐度 ≥ 0.01)，選取這6 種器官和組織中表達(dá)豐度最高的前20 個(gè)miRNAs 進(jìn)行比較分析，這些共表達(dá)miRNAs的表達(dá)水平存在顯著性差異 (P＜ 0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)，林麝心臟中miR-451a 的表達(dá)水平較高，肝臟、脾臟、肺臟、腎臟中miR-21 的表達(dá)水平較高，肌肉組織中miR-99b的表達(dá)水平較高；而miR-127、miR-30f、miR-30f、miR-22、miR-451a和miR-30f在各器官和組織中的表達(dá)水平較低 (圖2)。

圖2 林麝不同器官和組織共表達(dá)miRNA及其表達(dá)水平. A、B、C、D、E和F分別表示心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織Fig. 2 co-expressed miRNA and their expression level in different organs and tissues of forest musk deer. A, B, C, D, E and F represents heart, liver, spleen, lung, kidney, and muscle tissue, respectively

在林麝6 種器官和組織的miRNAs 共表達(dá)譜中，miR-451a 在林麝心臟中表達(dá)量最高，其次是miR-27b-3p、 miR-100-5p、 miR-26c 和miR-125c(圖2A)，表達(dá)量最低的是miR-7b。miR-143-3p 在林麝肝臟中表達(dá)量最高，其次是miR-122-5p、miR-21和miR-21-5p，表達(dá)量最低的是miR-3065-5p(圖2B)。林麝脾臟中，miR-143-3p 表達(dá)量最高，其次是miR-146a-5p、miR-10c-5p、miR-10b-5p，表達(dá)量最低的是miR-124b-3p (圖2C)。林麝肺臟中，miR-21-5p 表達(dá)量最高，其次是miR-21、miR-99b 和miR-30a-5p，表達(dá)量最低的是miR-124b-3p(圖2D)。林麝腎臟中，miR-10c-5p 表達(dá)量最高，其次是miR-10b-5p、miR-143-3p 和miR-30a-5p，表達(dá)量最低的是miR-7b (圖2E)。林麝肌肉組織中，miR-99b 表達(dá)量最高，其次是miR-99a-5p 和miR-99a，miR-124b-3p 表達(dá)量最低 (圖2F)。由此可知，在林麝6種器官和組織中有大量共表達(dá)的miRNAs，但是，共表達(dá)的同種miRNAs在不同器官和組織中的表達(dá)水平存在顯著差異 (P＜ 0.05)。

2.3 林麝不同器官和組織中特異表達(dá)miRNAs分析

林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織中特異表達(dá)的miRNAs數(shù)量分別為86個(gè)、54個(gè)、44 個(gè)、68 個(gè)、83 個(gè)和50 個(gè)，存在顯著差異 (P＜0.01)。分別選取6 種器官和組織中表達(dá)豐度最高的前20 個(gè)miRNAs 進(jìn)行比較分析 (圖3)。林麝心臟特異表達(dá)miRNAs 中，表達(dá)豐度最高的是miR-208a-3p，含量高達(dá)65.20%，其次是miR-133a-3p、miR-3546，最低的是miR-338a-3-5p (圖3A)。林麝肝臟特異表達(dá)miRNAs 中，表達(dá)豐度最高的是miR-122-3p (圖3A)，含量高達(dá)57.79%，其次是miR-432-3p、miR-433-5p，最低的是miR-375 (圖3B)。林麝脾臟特異表達(dá)miRNAs 中，表達(dá)豐度最高的是miR-142-5p，含量為20.35%以上，其次是miR-451、miR-1244，最低的是miR-219 (圖3C)。林麝肺臟特異表達(dá)miRNAs中，表達(dá)豐度最高的是miR-956-3p，含量為21.78%，其次是miR-34-5p、miR-281-3p，最低的是miR-18b-5p (圖3D)。林麝腎臟特異表達(dá)miRNAs 中，表達(dá)豐度最高的是miR-450b-3p，含量為12.47%，其次是miR-6516-5p、miR-668-3p，最低的是miR-210 (圖3E)。林麝肌肉組織特異表達(dá)miRNAs中，表達(dá)豐度最高的是miR-205-3p，含量為12.47%，其次是miR-183-3p、miR-3195，最低的是miR-124 (圖3F)。由此可知，林麝6種器官和組織中均有特異性表達(dá)的miRNAs，但心臟中部分特異表達(dá)miRNA 的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他5種器官和組織。

圖3 林麝不同器官和組織特異miRNA及其表達(dá)水平. A、B、C、D、E和F分別表示心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織Fig. 3 Specific miRNA of different organs and tissues and their expression levels in the forest musk deer. A, B, C, D, E and F represents heart, liver, spleen, lung, kidney, and muscle tissue, respectively

2.4 林麝肝臟特異表達(dá)miRNAs靶基因功能分析

林麝肝臟中有54 個(gè)特異表達(dá)的miRNAs 作用于14 937 個(gè)靶基因，通過(guò)GO 富集分析發(fā)現(xiàn)這些特異表達(dá)miRNAs的靶基因主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體，主要參與DNA 轉(zhuǎn)錄與結(jié)合 (GO:0000977-GO: 0001228)、肌動(dòng)蛋白絲過(guò)程的調(diào)控(GO: 0032970)、蛋白激酶活性 (GO: 0004672)、細(xì)胞黏著力 (GO: 0098609)、多細(xì)胞生物發(fā)育的調(diào)節(jié)(GO: 2000026)、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性 (GO: 0016773) 等功能 (P＜ 0.01；圖4A)。為了進(jìn)一步探討林麝肝臟中特異表達(dá)miRNAs靶基因的功能，對(duì)其靶基因進(jìn)行了KEGG 分析，顯著富集的KEGG 通路主要涉及Wnt 信號(hào)通路 (ko04310)、cAMP 信號(hào)通路(ko04024)、ECM 受體相互作用 (ko04512)、Notch信號(hào)途徑 (ko04330)、AMPK 信號(hào)通路 (ko04152)、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路 (ko04662)、內(nèi)分泌和代謝疾病 (ko09167)、生物晝夜節(jié)律 (ko04710)、細(xì)胞外基質(zhì)與受體相互作用信號(hào)通路 (ko04512)、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路 (ko04920)、 肥厚型心肌病(ko05410)、基底細(xì)胞癌 (ko05217)、病毒性心肌炎(ko05416)、膽汁 (ko04976) 與腎素 (ko04924) 的分泌等 (P＜ 0.01；圖4B)。

圖4 林麝肝臟特異表達(dá)miRNA靶基因GO和KEGG分析Fig. 4 GO and KEGG analysis of specific miRNA-target genes in the liver of forest musk deer

2.5 miRNA表達(dá)驗(yàn)證

為驗(yàn)證高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，從林麝肝臟miRNA表達(dá)譜中隨機(jī)抽取9 個(gè)miRNAs 進(jìn)行RT-qPCR 驗(yàn)證。以U6 snRNA 作為內(nèi)參，分別對(duì)肝臟化膿病和健康林麝的靜脈血miR-433、miR-30a-5p、miR-365-5p、 miR-339a、 miR-155、 miR-17-5p、 miR-25、let-7a-5p、let-7g、miR-10b 進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，其miRNA表達(dá)量與miRNA測(cè)序結(jié)果基本一致 (圖5)。

圖5 miRNAs 在健康和化膿病林麝肝臟中的定量表達(dá)和測(cè)序表達(dá)分析Fig. 5 Comparison of quantitative expression and sequencing of miRNAs in liver of health and abscess forest musk deer

3 討論

近年來(lái)，關(guān)于miRNAs 的研究取得了大量成果，在動(dòng)物基因組中有20% ～ 30%的基因受到miRNA 的調(diào)控 (Starket al., 2005)，miRNA 不僅參與到多個(gè)生理過(guò)程中，而且在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，并且miRNA 可作為疾病診斷及治療的分子標(biāo)記物 (Lee and Dutta, 2009;Li and Kowdley, 2012; Shiet al., 2019)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 參與機(jī)體免疫過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)中，與自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān) (Lawrie, 2007)。miRNAs 特異性地結(jié)合到下游靶基因3′端非翻譯區(qū)(3′UTR) 發(fā)揮翻譯抑制作用或引發(fā)mRNA 降解，從而靶向負(fù)調(diào)控下游靶基因 (Hede, 2005)。通過(guò)高通量測(cè)序法比較唐氏綜合癥胎兒和健康者miRNAs表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有149 個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中miR-1、 miR-320b、 miR-196b、 miR-4732-5p 和miR-486-5p 與免疫基因的調(diào)控作用密切相關(guān)，參與造血或淋巴器官的發(fā)育、胸腺發(fā)育和T/B細(xì)胞分化活動(dòng)。同時(shí)證實(shí)大量差異表達(dá)miRNAs通過(guò)調(diào)控靶基因mRNA 的表達(dá)，從而影響免疫調(diào)節(jié)通路，進(jìn)而引起T/B 細(xì)胞系統(tǒng)紊亂 (Xuet al., 2013a,2013b)。miRNA-143 在綿羊體內(nèi)各個(gè)組織中都有表達(dá)，在綿羊胚胎發(fā)育和器官形成中具有重要的調(diào)控作用 (Gonget al., 2020)，miRNA-143 也曾被報(bào)道參與癌癥發(fā)生的過(guò)程，與胃癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥的發(fā)生有密切關(guān)系，并能發(fā)揮腫瘤抑制作用 (Wenet al., 2020)。在藏黃牛和宣漢黃牛心臟組織的研究中，發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)的miRNAs，這些miRNAs參與心肌細(xì)胞增殖及能量代謝等生理過(guò)程 (Chenet al., 2020)。由此推測(cè)，組織或器官特異表達(dá)或差異表達(dá)miRNAs 發(fā)揮重要生物學(xué)功能。

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織進(jìn)行small RNA測(cè)序，構(gòu)建了其miRNAs 表達(dá)譜，篩選出1 650 個(gè)共表達(dá)的miRNAs，其中l(wèi)et-7a、let-7b、let-7c、let-7d、 miR-127、 miR-186、 miR-21、 miR-22、miR-23b、 miR-26a、 miR-26c、 miR-27b、 miR-29a、miR-30f、miR-3596、miR-451a、miR-99b 可能與林麝的生理過(guò)程、疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。據(jù)研究表明，let-7 家族負(fù)調(diào)控抑癌基因，當(dāng)let-7家族過(guò)度低表達(dá)可抑制多種腫瘤的發(fā)展 (Boyerinaset al., 2010)。表達(dá)下調(diào)的miR-26a 通過(guò)誘導(dǎo)MYC促使淋巴瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的進(jìn)展 (Kotaet al., 2009)。在本研究中，let-7a、let-7c、let-7d、let-7e 在健康林麝的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織中的表達(dá)量普遍較低，miR-126 在林麝心臟、肝臟和脾臟中表達(dá)水平較高，這可能與miR-126 通過(guò)負(fù)向調(diào)控PI3K 通路抑制癌細(xì)胞的增殖有關(guān) (Zhanget al., 2008)。值得注意的是，在林麝6 種器官和組織特異表達(dá)的miRNAs 中，心臟中有部分特異表達(dá)miRNAs 的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他5 種器官和組織，這些特異表達(dá)miRNA 靶基因主要定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體，主要功能與蛋白泛素化修飾、DNA 結(jié)合、ATP 結(jié)合、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號(hào)傳遞等有關(guān)；KEGG通路分析表明顯著富集的功能通路主要為泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑、核苷酸切除修復(fù)、p53 信號(hào)通路、脂肪酸代謝等；這暗示了林麝心血管系統(tǒng)的生理功能與特異表達(dá)miRNA的調(diào)控作用密切相關(guān)。有研究表明，高度保守的miR-133 和miR-1 參與肌肉形成、心臟發(fā)育和心肌發(fā)生；miR-499 的表達(dá)可能與胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化密切相關(guān)；在壓力應(yīng)激和甲狀腺功能減退時(shí)，miR-208 可特異性活化b 型肌球蛋白重鏈基因 (Myosin heavy chain, MHC) 的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)心肌增殖和心臟的生理功能 (孫吉和陳小平，2011)；鑒于此，我們推測(cè)林麝心血管系統(tǒng)中特異表達(dá)miRNA 的改變與多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。在心衰患者與健康者研究中，患者血液中miR-423-5p的表達(dá)上調(diào)3倍以上，證實(shí)這個(gè)miRNA 可作為心臟功能衰竭的特異標(biāo)志物 (Tijsenet al., 2010)。另外，在冠心病患者血液中發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNA 的異常表達(dá) (Tijsenet al., 2010; Fichtlschereret al., 2010)。因此，研究血液中特異miRNA 表達(dá)水平的變化，對(duì)心血管疾病的診斷和預(yù)后有重要參考價(jià)值，這也表明了生物不同器官或組織特異表達(dá)的miRNA 可能在特定器官或組織中發(fā)揮特定的功能。

研究表明，miRNA 通過(guò)負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)參與生物體疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程 (Koralovet al.,2008)。林麝肝臟特異表達(dá)miRNA 靶基因富集到Wnt 信號(hào)通路 (ko04310)、 cAMP 信號(hào)通路(ko04024)、ECM 受體相互作用 (ko04512)、Notch信號(hào)途徑 (ko04330)、AMPK 信號(hào)通路 (ko04152)、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路 (ko04662)、內(nèi)分泌和代謝疾病 (ko09167)、肥厚型心肌病 (ko05410)、基底細(xì)胞癌 (ko05217)、病毒性心肌炎 (ko05416) 等信號(hào)通路，這些通路均與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-433-5p 靶向MAP2K7、MAP3K4、FGFR3、SRF、HSPB1等基因調(diào)控MAPK 信號(hào)通路，而miR-433-5p 靶向SERPⅠNE1、SLC27A1、COL1A1、FZD8、PLCG1又調(diào)控內(nèi)分泌和代謝疾病。let-7-5p靶向FZD5、TCF7L2、PLCB1、LRP5調(diào)控Wnt 信號(hào)通路，而let-7-5p 靶向DTX3、HDAC1、NCOR2、MAML3調(diào)控Notch 信號(hào)通路。 let-7-5p 靶向TCF7L2、FZD5和miR-125a 靶向DV11、miR-127-5p 靶向GLⅠ3、CTNNB1調(diào)控基底細(xì)胞癌的發(fā)生。這些特異表達(dá)的miRNAs可能是決定器官或組織不同表征和功能的重要因素之一。由此推測(cè)，林麝肝臟特異表達(dá)的miRNAs可能參與疾病的發(fā)生和發(fā)展的調(diào)控。