王字卉,李權(quán)倫,散 琴

(湖北省十堰市婦幼保健院檢驗(yàn)科,湖北 十堰 442000)

支氣管哮喘是涉及多種細(xì)胞和炎性因子參與的以氣道慢性炎癥為特征的疾病,這種慢性炎癥與氣道高反應(yīng)性相關(guān)[1-3]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)我國(guó)的兒童哮喘患病率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì),哮喘不僅影響青少年兒童的發(fā)育和身體健康,而且影響兒童的心理健康,因此有效的預(yù)防和早期的診療,對(duì)減少兒童哮喘的發(fā)生具有重要意義[4-5]。研究顯示哮喘的發(fā)生發(fā)展與多個(gè)基因和環(huán)境因素密切相關(guān)[6-8],Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)為單個(gè)的跨膜蛋白,能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子,也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[9-11],作為Toll樣受體家族成員之一的TLR4近年來(lái)受到研究者的廣泛關(guān)注。TLR4能夠識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁中的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),并可調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡,影響體內(nèi)白細(xì)胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)水平[12-13],其與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但TLR4基因多態(tài)性與兒童哮喘及患兒病情預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)尚不明確,本研究旨在探索哮喘兒童外周血IL-4和IFN-γ水平及其與Toll樣受體4基因多態(tài)性的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2019年4月至2022年10月湖北省十堰市婦幼保健院收治的172例急性發(fā)作期哮喘患兒為實(shí)驗(yàn)組,納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡為6～14周歲;②診斷標(biāo)準(zhǔn)按照2020版《兒童支氣管哮喘規(guī)范化診治建議》[14];③無(wú)心肺、肝臟、腎臟等器官的功能障礙;④無(wú)其他自身免疫缺陷癥疾病或者先天性疾病。根據(jù)患兒哮喘的嚴(yán)重程度,將實(shí)驗(yàn)組分為輕度、中度、重度和危重。選擇同期在本院兒童保健科門診體檢的136例兒童作為對(duì)照組,研究對(duì)象均為漢族人群。本研究通過(guò)十堰市婦幼保健院倫理委員會(huì)審查,所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑及材料

IL-4、IFN-γ測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,DNA提取試劑盒購(gòu)自大連寶生生物工程有限公司,低溫離心機(jī)購(gòu)自Thermo Scientific公司,PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司,DYY-6C電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠,引物設(shè)計(jì)及合成購(gòu)自上海生工生物工程公司,凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司,血細(xì)胞分析儀為深圳邁瑞公司,NO分析儀購(gòu)自江蘇無(wú)錫尚沃公司。

1.3 研究方法

1.3.1 標(biāo)本的采集及處理

收集納入患者的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)等一般資料,于患者入院24h內(nèi)采集患者外周血3mL于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-2K)真空抗凝管,混勻,離心(3 000r/min)10min,分離血漿和細(xì)胞,-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 各項(xiàng)臨床指標(biāo)檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血漿中的IL-4、IFN-γ水平,測(cè)定的方法嚴(yán)格按照碧云天公司產(chǎn)品試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,利用血細(xì)胞分析儀測(cè)定外周血嗜酸性粒細(xì)胞百分比(eosinophils,Eos),利用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清總免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE),利用便攜式肺功能儀和NO分析儀,指導(dǎo)受試者進(jìn)行肺功能指標(biāo)一秒率(forced expiratory volume in the first second/forced vital capacity,FEV1/FVC)和呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide,FeNO)測(cè)定,共測(cè)定3次,取最佳值。

1.3.3 TLR4基因多態(tài)性的測(cè)定

按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書操作規(guī)程,快速抽提全血基因組DNA,檢測(cè)樣本吸光度值A(chǔ)260/A280介于1.6～1.8,將提取的樣本DNA于-80℃低溫冰箱保存,采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction,PCR-RELP)技術(shù)對(duì)TLR4基因多態(tài)性的檢測(cè)分析,上下游引物見表1。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5min,95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,循環(huán)30次,之后72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,酶切產(chǎn)物在3.5%的瓊脂糖凝膠上電泳,然后通過(guò)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果,判斷樣本的基因型。

表1 TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile上下游引物

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料比較

實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組在性別、年齡、BMI方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 各組間一般資料比較

2.2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組臨床相關(guān)指標(biāo)比較

實(shí)驗(yàn)組哮喘患兒外周血中IL-4、Eos、IgE、FeNO的水平高于對(duì)照組,而IFN-γ、FEV1/FVC(%)水平低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值介于8.90～29.04之間,P<0.05),見表3。

表3 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組臨床相關(guān)指標(biāo)比較

2.3 TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性遺傳平衡檢驗(yàn)

TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性的預(yù)期基因型頻率處于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),樣本具有群體代表性;實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組TLR4基因多態(tài)性位點(diǎn)Asp299Gly的基因型和等位基因分布相比,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組Thr399Ile單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)TT基因型分布頻率高于對(duì)照組,T等位基因分布頻率高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為10.19、11.50,P<0.05),見表4。TLR4基因Thr399Ile位點(diǎn)PCR-RFLP電泳圖譜(29bp條帶在瓊脂糖凝膠電泳中未能顯示出)見圖1。

注:Lane1、Lane4為CC基因型(406bp);Lane2為CT基因型(406bp、377bp、29bp);Lane3、Lane5為TT基因型(377bp、29bp);29bp條帶在瓊脂糖凝膠電泳中未能顯示出。

表4 各組TLR4基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)及分布頻率的比較 [n(%)]

2.4 TLR4基因Thr399Ile多態(tài)性和哮喘患兒臨床相關(guān)指標(biāo)比較

攜帶Thr399Ile TT基因型哮喘患兒的IL-4和FeNO水平高于CC和CT基因型,IFN-γ的水平低于CC和CT基因型,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為44.95、24.29、8.51,P<0.05);TLR4基因Thr399Ile多態(tài)性與哮喘患兒Eos、IgE的水平、FEV1/FVC(%)無(wú)相關(guān)性(P>0.05),見表5。

表5 TLR4基因Thr399Ile多態(tài)性和兒童哮喘臨床相關(guān)指標(biāo)比較

2.5 TLR4基因Thr399Ile多態(tài)性和患兒哮喘嚴(yán)重程度比較

秩和檢驗(yàn)顯示攜帶Thr399Ile 單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型與哮喘發(fā)病程度不相關(guān),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表6。

表6 TLR4基因Thr399Ile多態(tài)性和患兒哮喘嚴(yán)重程度比較 [n(%)]

2.6 二元Logistic回歸分析TLR4基因Thr399Ile位點(diǎn)的單倍體基因型與兒童哮喘的相關(guān)性

共顯性模型中,TT基因型人群是CC型人群患病風(fēng)險(xiǎn)的2.353倍,其OR值及95%CI為2.353(1.575～4.663),P<0.05;顯性模型中,CT+TT基因型人群是CC型人群患病風(fēng)險(xiǎn)的1.962倍,其OR值及95%CI為1.962(1.228～3.206),P<0.05;隱形模型中,TT基因型人群是CC+CT型人群患病風(fēng)險(xiǎn)1.875倍,其OR值及95%CI為1.875(1.258～3.059),P<0.05,見表7。

表7 二元Logistic回歸分析TLR4基因Thr399Ile位點(diǎn)與兒童哮喘的關(guān)系

3 討論

3.1 兒童哮喘的致病機(jī)理

哮喘是兒童比較常見的疾病之一,主要與遺傳和環(huán)境因素相關(guān),是受多個(gè)基因調(diào)控而引起的免疫功能紊亂的氣道高反應(yīng)炎癥,研究表明哮喘患兒體內(nèi)的細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞水平異常,是Th1/Th2比例失衡導(dǎo)致的2型炎癥[15-16]。TLR是模式識(shí)別受體的一種,TLR具有單個(gè)的跨膜蛋白,可識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),是參與天然免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子。作為Toll樣受體家族成員之一的TLR4近年來(lái)受到研究者的廣泛關(guān)注。有研究表明,TLR4途徑可觸發(fā)NF-κB信號(hào)通路的活化,影響基因表達(dá)的調(diào)控,進(jìn)而影響機(jī)體的炎癥因子和免疫細(xì)胞水平[17-18]。因此,本研究旨在探索哮喘兒童外周血IL-4和IFN-γ水平及其與Toll樣受體4基因多態(tài)性的相關(guān)性,為兒童哮喘的診療提供新的思路。

3.2 哮喘患兒外周血炎癥因子及肺功能水平分析

本研究選取172例哮喘患兒進(jìn)行了分析,研究結(jié)果顯示,哮喘組患兒外周血中IL-4水平升高,IFN-γ水平降低,而IL-4主要由Th2淋巴細(xì)胞釋放,IFN-γ主要由Th1淋巴細(xì)胞釋放,說(shuō)明哮喘患兒是機(jī)體內(nèi)的Th1/Th2比例失衡導(dǎo)致的2型炎癥。此外,哮喘組患兒肺功能指標(biāo)FEV1/FVC(%)顯著低于對(duì)照組,FeNO水平顯著高于對(duì)照組。FeNO是氣道上皮細(xì)胞及炎癥細(xì)胞的一氧化氮合酶催化L-精氨酸產(chǎn)生的,當(dāng)氣道受外界刺激誘發(fā)2型炎癥時(shí),可導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞中一氧化氮合酶表達(dá)增多,從而催化L-精氨酸產(chǎn)生更多的NO;是目前被廣泛認(rèn)可的氣道2型炎癥的分子標(biāo)志物,其不僅能反映氣道炎癥水平,還能預(yù)測(cè)評(píng)估抗炎效果。該檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn),在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用[19]。

3.3 哮喘患兒與TLR4基因多態(tài)性的相關(guān)性分析

通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),TLR4基因Thr399Ile多態(tài)性與哮喘患兒外周血嗜酸性粒細(xì)胞百分比、IgE的水平、FEV1/FVC(%)無(wú)相關(guān)性,但攜帶Thr399Ile TT基因型哮喘患兒的IL-4和FeNO水平高于CC和CT基因型,IFN-γ的水平顯著低于CC和CT基因型。TLR4基因、IL-4、IFN-γ可能是哮喘輕癥進(jìn)展成重癥的關(guān)鍵因子,FeNO水平可預(yù)測(cè)哮喘的嚴(yán)重程度?；蛩綑z測(cè)發(fā)現(xiàn),TLR4基因多態(tài)性位點(diǎn)Asp299Gly的基因型和等位基因分布差異不明顯,Thr399Ile的基因型和等位基因分布存在顯著差異,其中實(shí)驗(yàn)組T等位基因分布頻率顯著高于對(duì)照組。二元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)TLR4基因Thr399Ile位點(diǎn)的基因多態(tài)性與兒童哮喘存在相關(guān)性,TT基因型是兒童哮喘的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但本研究納入樣本量較小,且并未進(jìn)行多因素的分層分析,因此后續(xù)我們還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,同時(shí)進(jìn)一步探索不同因素對(duì)TLR4基因多態(tài)性與兒童哮喘相關(guān)性的影響。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)TLR4基因Thr399Ile位點(diǎn)多態(tài)性與兒童哮喘的發(fā)生具有相關(guān)性,影響哮喘患兒IL-4、IFN-γ、FeNO的表達(dá)水平,但與哮喘患兒的肺功能水平和發(fā)病的嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)。