周曉輝,蔡玥,郭珊珊,吳清華,王淑梅,王娜,張博

(1.滄州市人民醫(yī)院,河北 滄州 061001;2.河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050051;3.滄州市中心醫(yī)院,河北 滄州 061001)

隨著體外循環(huán)技術(shù)的進步、高質(zhì)量心肺復(fù)蘇技術(shù)的普及和血流動力學(xué)支持的日益完善[1-2],越來越多的心臟驟?；颊吆托栊呐K手術(shù)的患者得到了及時的救治,心臟驟?；颊叩乃劳雎蕪?0%下降到50%左右,成人心臟手術(shù)術(shù)后長期存活率也得到了提高[3]。從20世紀50年代開始,亞低溫治療被應(yīng)用于心臟驟停和心臟手術(shù)中[4],但有研究[1]認為低溫會引發(fā)心血管系統(tǒng)的不良效應(yīng),包括心血管收縮導(dǎo)致的心肌灌注不足,增加缺血心肌能量消耗,導(dǎo)致心肌代謝、功能障礙甚至結(jié)構(gòu)破壞等。

心肌細胞收縮力是心肌細胞最有代表性的功能之一,主要反應(yīng)了心肌細胞發(fā)生縮短的內(nèi)在動力[5],因其能夠?qū)?nèi)外源刺激做出反應(yīng),可作為預(yù)測健康和疾病心肌的重要指標。體外急性分離的大鼠心肌細胞的收縮與整體心臟功能具有良好的相關(guān)性,過去的對于心肌力學(xué)的研究往往需要將酶解分離的心肌細胞附著到力學(xué)傳感器上,側(cè)重于測量肌節(jié)長度,這些技術(shù)具有勞動密集型和成本高的缺點。但目前應(yīng)用鈣成像、電生理、細胞力學(xué)、免疫組化等方式在工具藥物的作用下對心肌細胞進行觀察研究及定量分析,尤其是使用可視化動緣探測系統(tǒng)直接測量離體心室肌細胞力學(xué)特性,能夠幫助我們對心臟功能、相關(guān)疾病發(fā)病機理及相關(guān)藥物的作用機制進行更深入的研究[6-8]。但是這類實驗對細胞質(zhì)量要求極高,不僅需要細胞持續(xù)興奮,而且要求細胞的收縮舒張功能極為穩(wěn)定,為了提高心肌細胞質(zhì)量,大量研究[9]對灌流液成分及酸堿度、消化酶等分離細胞的條件進行了改進,但往往忽略溫度對于心肌細胞狀態(tài)的影響。且本課題組以往的實驗也發(fā)現(xiàn)細胞的收縮力隨著季節(jié)交替和溫度變化而變化,對于之后的藥物干預(yù)研究影響很大,無法判斷最終的作用是來自藥物還是溫度變化的影響?；诖?本研究以急性分離大鼠心肌細胞收縮舒張功能為指標,觀察測定逐步升溫和固定恒溫孵育兩種方式對大鼠心肌細胞收縮舒張功能的影響,探討溫度對心臟的影響,為治療性低溫的心臟保護作用提供細胞水平的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

哇巴因(美國Sigma公司),用二甲基亞砜溶液配制成100 mmol/L的母液,貯存于-20 ℃的冰箱中。Src抑制劑PP2(英國Tocris公司)、ROS抑制劑NAC(美國Sigma公司)、MAPK抑制劑PD98059(美國Cyman公司)、PLC抑制劑U73122(美國Cyman公司)和IP3抑制劑Xestospongin C(美國Cyman公司)的配制與保存參見藥品說明書。Collagenase B購于瑞士Roche公司;BSA購于澳大利亞Maverick公司;EGTA購于比利時Acros Organics公司。

1.2 液體配置

無鈣臺氏液:NaCl 140.0 mmol/L,KCl 5.4 mmol/L,MgCl21.0 mmol/L,HEPES 1.0 mmol/L,glucose 10.0 mmol/L(用NaOH調(diào)pH值至7.4);臺氏液:NaCl 140.0 mmol/L,KCl 5.4 mmol/L,MgCl21.0 mmol/L,HEPES 1.0 mmol/L,glucose 10.0 mmol/L,CaCl21.0 mmol/L(用NaOH調(diào)pH值至7.4);KB液:KOH 80.0 mmol/L,KCl 40.0 mmol/L,KH2PO425.0 mmol/L,MgSO43.0 mmol/L,L-Glutamic 50.0 mmol/L,Taurine 20.0 mmol/L,HEPEs 10.0 mmol/L,EGTA 1.0 mmol/L,D-Glucose 10.0 mmol/L(用KOH調(diào)節(jié)至pH 7.2)。消化液:含0.6% Collagenase B、0.6% BSA(Bovine serum albumin)及30 μmol/L Ca2+的無鈣臺氏液30 mL。復(fù)鈣液:復(fù)鈣液a:取無鈣臺式液加入CaCl2至0.1 mmol/L。復(fù)鈣液b:取無鈣臺式液加入CaCl2至0.5 mmol/L。

1.3 實驗動物

選用清潔級成年雄性SD大鼠,180～200 g[河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,許可證號:SYXK(冀)2018-004,動物合格證編號:2001137]。

1.4 單個大鼠心室肌細胞分離

參照文獻[9]采用改進的Langendorff灌流裝置和方法分離大鼠的心室肌細胞,初始細胞成活率大于80%。室溫靜置1 h。實驗前,用復(fù)鈣液a、復(fù)鈣液b和正常臺式液對細胞進行三步不同梯度復(fù)鈣,最終得到狀態(tài)較好的游離桿狀心肌細胞用于實驗研究。

1.5 大鼠心肌細胞收縮功能的測定

采用可視化單細胞動緣探測系統(tǒng),將復(fù)鈣后的心肌細胞放入浴槽內(nèi),用含氧飽和臺式液以2 mL/min的速度恒速灌流5 min。通過浴槽兩側(cè)電極給予電壓15 V、波寬4 ms和頻率1 Hz持續(xù)電刺激,用10×物鏡尋找收縮良好、邊緣清晰的細胞,再用40×物鏡放大細胞,讓細胞在計算機上成像,并實時跟蹤細胞邊緣,記錄大鼠心室肌細胞的收縮/舒張功能。用溫控裝置調(diào)節(jié)灌流液的溫度,逐步升溫分別測定于25、27、29、30、31、33、35、37 ℃時穩(wěn)定收縮5 min以上的細胞收縮舒張功能變化;之后將心肌細胞在25 ℃、30 ℃或35 ℃固定恒溫孵育1 h,測定3個溫度孵育后能夠穩(wěn)定收縮5 min以上的細胞收縮舒張功能變化。以標準化的收縮幅度%(Standardized bl%peak h)%或收縮幅度(bl%peak h)相對變化評價逐步升溫和固定恒溫孵育對大鼠心肌細胞收縮功能的影響。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 逐步升溫對大鼠心肌細胞收縮和舒張功能的影響

在27～37 ℃逐步升溫的過程中,大鼠心肌細胞接受持續(xù)電刺激后穩(wěn)定收縮的比例也會隨著溫度的升高而下降(P<0.05)。27、29、30 ℃組大鼠心肌細胞收縮幅度高于室溫25 ℃組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。31、33、35、37 ℃組大鼠心肌細胞收縮幅度與25 ℃組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),且30 ℃之后隨著溫度繼續(xù)上升,心肌細胞收縮狀態(tài)極不規(guī)律,部分細胞甚至?xí)伩s死亡。提示在25～37 ℃逐步升溫過程中,30 ℃時大鼠心室肌細胞可達最佳收縮。見表1-表2、圖1-圖2。

表1 逐步升溫不同溫度下接受持續(xù)電刺激大鼠心肌細胞穩(wěn)定收縮的細胞百分比

表2 逐步升溫對大鼠心肌細胞收縮和舒張功能的影響

2.2 固定恒溫孵育對大鼠心肌細胞收縮和舒張功能的影響

25 ℃組、30 ℃組、35 ℃組恒溫孵育后的心肌細胞收縮幅度兩兩比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中,30 ℃孵育的心肌細胞收縮幅度最大最穩(wěn)定,是25 ℃時收縮幅度的152%,此溫度孵育的心肌細胞收縮的增加比例較連續(xù)升溫至30 ℃時的增幅更大(142%);35 ℃時心肌細胞收縮幅度最小且部分細胞收縮不規(guī)律,僅為25 ℃時收縮幅度的57%。見表3及圖3。

表3 固定恒溫孵育對大鼠心肌細胞收縮和舒張功能的影響

3 討論

以往的研究[10-14]顯示溫度顯著影響心臟的收縮特性,但結(jié)果報道不一。有研究[10]證明在低溫(25～30 ℃)時,離體乳頭肌收縮的主動張力和收縮、舒張速度最高。Stephnson等[11]的實驗證明,在22 ℃時離體乳頭肌收縮張力及收縮速度最高,因為此溫度下肌絲對鈣的敏感性最高。Kanaya等[12]證實離體心肌的收縮幅度和持續(xù)時間會隨溫度的升高而減小。但也有文獻[13]報道,在30～39 ℃的范圍內(nèi),Wistar大鼠培養(yǎng)的心肌細胞的力學(xué)特性隨溫度升高逐漸升高。在一些臨床試驗[14]中,也顯示不同溫度對于心臟驟?；颊叩慕Y(jié)局及不同指標的影響具有統(tǒng)計學(xué)差異。由于以上研究存在矛盾性,所以本研究采用急性分離的大鼠心肌細胞,觀察不同溫度對心肌細胞收縮功能的影響,從而尋找可用于心肌保護的最佳溫度。

本研究采用IonOptix單細胞動緣檢測系統(tǒng)測定25～37 ℃不同溫度下急性分離的大鼠心肌細胞收縮舒張功能的變化,證實溫度變化能夠影響急性分離的大鼠心肌細胞收縮舒張功能。逐步升溫發(fā)現(xiàn)從27～30 ℃,隨著溫度逐漸升高急性分離的大鼠心肌細胞收縮幅度與25 ℃室溫相比逐漸增大(P<0.05);31～37 ℃時,隨著溫度繼續(xù)上升,心肌細胞會出現(xiàn)不規(guī)律收縮、形態(tài)改變,甚至攣縮死亡,且收縮幅度與25 ℃相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),此現(xiàn)象與Wistar大鼠培養(yǎng)的心肌細胞的力學(xué)特性不同[13]。故的固定恒溫實驗選擇25、30、35 ℃作為心肌細胞的孵育溫度。固定恒溫孵育發(fā)現(xiàn),30 ℃大鼠心肌細胞收縮幅度最大最穩(wěn)定(P<0.05),其次為25 ℃(P<0.05),35 ℃孵育的大鼠心肌細胞收縮幅度最小且不規(guī)律 (P<0.05)。

文獻報道[15-16]鈣離子介導(dǎo)心肌細胞興奮收縮耦聯(lián)是引起心肌細胞收縮舒張的關(guān)鍵,其中,心肌細胞內(nèi)鈣調(diào)控的改變和肌絲對鈣敏感性發(fā)生改變是心肌細胞收縮舒張功能發(fā)生變化的主要因素。心肌細胞內(nèi)的鈣調(diào)控主要與L-型鈣通道、肌漿網(wǎng)Ryanodine受體、鈉鈣交換體和鈣泵有關(guān)。首先,溫度變化可影響心肌細胞胞漿的升鈣因素。文獻報道,降低體溫既可以通過增加L型鈣通道的開放時間[17],使外鈣內(nèi)流增加,胞漿內(nèi)鈣濃度升高;又能增加肌漿網(wǎng)的鈣儲備并能增加Ryanodine受體的開放頻率,使胞漿中的鈣瞬時性增高,顯著增加心肌細胞收縮力[18]。本研究也發(fā)現(xiàn)在30 ℃時測定的心肌細胞收縮力高于35 ℃時,可能與低溫使得心肌細胞的L型鈣通道開放時間延長和Ryanodine受體的開放頻率增加導(dǎo)致的胞漿內(nèi)鈣濃度增加有關(guān)。其次,溫度會影響心肌細胞胞漿的降鈣因素。心肌細胞主要是通過鈉鈣交換體和鈣泵進行排鈣的,而降低體溫可抑制鈉鈣交換體介導(dǎo)的鈣外流和鈣泵排鈣[19],從而使細胞內(nèi)鈣增加,心肌細胞收縮力增強。本研究發(fā)現(xiàn)30 ℃時測定的心肌細胞收縮力明顯高于35 ℃,其原因可能是由于低溫抑制了細胞膜的鈣泵和鈉鈣交換體功能,從而減少了細胞內(nèi)鈣的外排,造成胞漿鈣濃度升高,導(dǎo)致心肌細胞收縮力升高。研究[19-20]也發(fā)現(xiàn),低溫(32 ℃)可以增加肌絲對鈣的敏感性,從而使心肌細胞收縮力增強。至于溫度升高降低心肌收縮力的原因,可能與氧耗增加造成的心肌損傷有關(guān)。溫度升高可以加速心肌細胞耗氧,影響細胞代謝,造成酸性物質(zhì)堆積,進而影響心肌細胞收縮和形態(tài)學(xué)改變。另外,在34～37 ℃時,同時出現(xiàn)的胞內(nèi)ATP耗竭和胞內(nèi)酸化能抑制鈉鈣交換,導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣增多,從而造成細胞內(nèi)鈣超載[21],損傷細胞。這可能是實驗中逐步升溫時高溫階段造成細胞不規(guī)律收縮,甚至攣縮死亡的重要原因。25 ℃孵育心肌細胞的收縮力要小于30 ℃的原因,推測可能與深度低溫可能在細胞和組織水平上破壞心肌的興奮收縮耦聯(lián)[22]、使心肌收縮蛋白對Ca2+的親和力降低[23]、以及低溫可能會引發(fā)心肌細胞Na+-K+-ATP酶和Ca2+ATP酶活性下降、ATP生成減少、細胞內(nèi)Na+蓄積導(dǎo)致細胞水腫、細胞內(nèi)外pH值失衡、無氧酵解增多導(dǎo)致心肌細胞酸中毒、心肌細胞Ca2+超載產(chǎn)生“冷攣縮”增加缺血心肌能量消耗[21]等因素有關(guān)。

治療性低溫分為:輕度低溫33～35 ℃;中度低溫28～32 ℃;深度低溫17～27 ℃;超深度低溫4～16 ℃[24-25]。其中,前兩者又被合并稱為亞低溫[25]。既往研究[24-25]表明,治療性低溫可抑制缺血和缺血再灌注損傷引起的細胞死亡與凋亡,對減少心肌梗死面積、改善再灌注損傷、改善心肌重構(gòu)和維持心臟功能等方面有重要作用。而Chien[26]等通過研究體溫與心肌梗死面積的關(guān)系,指出血液溫度每升高1 ℃,心肌梗死面積會增加10%,證實了心臟溫度是心肌梗死面積的一個獨立預(yù)測因素。Post等[27]和Nishimura等[28]在豬和狗的心臟的研究中發(fā)現(xiàn),低溫降低心率及機體耗氧量,而心輸出量卻并未改變,進一步證實了降低溫度更夠增強心肌收縮力。

綜上,溫度變化影響急性分離的大鼠心室肌細胞的收縮舒張功能,隨著溫度從25 ℃逐漸升高至37 ℃,急性分離大鼠的心室肌細胞收縮幅度出現(xiàn)先增強后減弱的情況。無論逐步升溫,還是固定恒溫孵育,都顯示急性分離大鼠的心室肌細胞在30 ℃左右收縮幅度最大最穩(wěn)定。