殷海成，趙紅月，陳 瑩，馬源青，李岳燕

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001）

大豆含有約40%的蛋白質(zhì)，其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和優(yōu)越的功能特性常被現(xiàn)代食品工業(yè)用來(lái)加工不同類型的食品，現(xiàn)已成為人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾牡鞍讈?lái)源。但大豆蛋白溶解性低、易聚集，導(dǎo)致乳化性、持水性不足等功能缺陷。這些功能特性缺陷是基于其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上蛋白性質(zhì)決定的。因此，需要經(jīng)過加工改變大豆蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以解除這些功能特性缺陷，進(jìn)而獲得優(yōu)質(zhì)的、具有理想功能的大豆蛋白。目前，采用較多的改變大豆蛋白結(jié)構(gòu)與功能的方式方法主要包括理化改性、生物工程改性與酶改性等。例如，熱處理大豆蛋白通過增加亞基聚合程度以阻止IgG與抗原決定簇反應(yīng)降低致敏性，能鈍化如蛋白酶抑制因子、植酸等一些抗?fàn)I養(yǎng)因子[1]。酶解大豆11S 球蛋白發(fā)現(xiàn)其內(nèi)部的氫鍵斷裂，暴露其親水基團(tuán)，使其更易與水分子連接，限制了分子結(jié)構(gòu)的展開，因而提高其熱穩(wěn)定性和質(zhì)構(gòu)特性[2]。

擠壓膨化作為一種現(xiàn)代食品工業(yè)常用的蛋白改性技術(shù)，通過擠壓機(jī)螺桿的推動(dòng)作用，使蛋白在料筒中經(jīng)受高溫、高壓和高剪切力的協(xié)同作用；當(dāng)?shù)鞍妆凰偷匠隽峡跁r(shí)，在溫度與壓力差劇烈變化下使蛋白質(zhì)膨脹而形成疏松的多孔結(jié)構(gòu)。擠壓膨化不但改變了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，而且影響其理化性質(zhì)，同時(shí)達(dá)到提升蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和改善其功能特性的目的，且具備短時(shí)、高效等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。大豆蛋白經(jīng)擠壓膨化處理其營(yíng)養(yǎng)組分、功能特性也發(fā)生不同程度的改變。例如，擠壓膨化的大豆蛋白發(fā)生聚集和解聚行為，使維系其結(jié)構(gòu)的作用力改變、化學(xué)鍵發(fā)生斷裂，進(jìn)而失去天然結(jié)構(gòu)，并影響其持水性、溶解性、起泡性、乳化性、凝膠性、黏彈性等；同時(shí)，造成糖的糊化和降解、脂質(zhì)氧化及形成新的風(fēng)味物質(zhì)等[5-6]。為此，通過解析擠壓膨化大豆蛋白聚集與解聚行為，探討大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象變化及其對(duì)功能特性的影響，以期為擠壓膨化提升大豆蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、改善功能特性提供參考。

1 大豆蛋白的組成結(jié)構(gòu)與功能特性

1.1 大豆蛋白的組成與結(jié)構(gòu)

大豆蛋白主要為貯藏于子葉亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白，稱為大豆貯藏蛋白，約占其總蛋白含量的70%。大豆貯藏蛋白根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的沉降系數(shù)不同將其分為4 種不同類型的組分，即2S（25 kDa）、7S（180 kDa）、11S（350 kDa） 和15S（600 kDa）[7]。2S 組分包括2S 球蛋白、胰蛋白酶抑制劑、細(xì)胞色素c 尿酶素。7S 組分有Gly m Bd 28K、Gly m Bd 30K、凝集素、β - 淀粉酶、脂肪氧化酶和β - 伴大豆球蛋白[8]。11S 組分是大豆蛋白中最大的單體蛋白，即11S 球蛋白。15S 組分為多種蛋白質(zhì)構(gòu)成，約占大豆蛋白的4.6%。其中，7S 和11S 組分組分的組要構(gòu)成是7S 球蛋白和11S 球蛋白，約占70%（7S 球蛋白約為30%和11S 球蛋白約為40%），二者共同決定大豆蛋白的功能特性[9-10]。大豆7S 球蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為150～200 kDa，由堿性7S 球蛋白、β - 伴球蛋白和γ - 伴球蛋白組成。其中，β - 伴球蛋白約占70%，是由α'、α 和β 3 個(gè)亞基組成。大豆11S 球蛋白是由6 個(gè)酸性亞基（A（1～6）） 和6 個(gè)堿性亞基（B（1～6）） 通過非共價(jià)鍵連接而成的六聚體蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量為300～380 kDa[11-12]。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包括一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)，每一低級(jí)結(jié)構(gòu)決定其更高一級(jí)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。一級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)的最基本結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸殘基的排列順序，共價(jià)鍵（即肽鍵） 是一級(jí)結(jié)構(gòu)主要的作用力；二級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象，主要包括α - 螺旋、β - 折疊、β - 轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲，氫鍵是維系二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力；三級(jí)結(jié)構(gòu)是在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤繞和折疊的三維空間排列，次級(jí)鍵和二硫鍵發(fā)揮主要作用；四級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)分子中相同的或者不同的亞基與亞基之間呈現(xiàn)的特定三維空間排布，非共價(jià)鍵（疏水作用、氫鍵、離子鍵） 是維系其四級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力[13-16]。大豆蛋白和其他蛋白一樣，都具備四級(jí)結(jié)構(gòu)。擠壓膨化通過影響大豆蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)影響其功能特性。

1.2 大豆蛋白的功能特性

蛋白質(zhì)功能特性除營(yíng)養(yǎng)特性外，還包括溶解性、起泡性、乳化性、凝膠性、致敏性、黏性、彈性、持水性等。蛋白溶解性常用溶解度表示，即蛋白在水中的分散量，常以分散指數(shù)、氮溶解指數(shù)或水可溶性氮表示。通常二級(jí)結(jié)構(gòu)中α - 螺旋與無(wú)規(guī)則卷曲含量與蛋白溶解度呈正相關(guān)，與β - 折疊含量呈負(fù)相關(guān)[17]。蛋白凝膠性是在受到環(huán)境因素影響時(shí)發(fā)生的變性，使蛋白分子間聚集形成的內(nèi)部可以包水或其他物質(zhì)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象[18]。蛋白凝膠性強(qiáng)弱與蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性、肽鏈的數(shù)量和其巰基含量及其性質(zhì)相關(guān)。肽鏈數(shù)量多、凝膠性強(qiáng)，酸性肽鏈的凝膠性較堿性肽鏈的強(qiáng)。此外，蛋白分子的巰基、二硫鍵及二者交換反應(yīng)對(duì)凝膠性形成具有重要的作用[19]。而起泡性是指蛋白在泡沫形成時(shí)，蛋白從體相遷移到泡沫的表面，通過分子間及分子內(nèi)的相作而形成的一層穩(wěn)定界面膜[20]。乳化性是蛋白的重要功能特性，是指油品和水形成乳狀液的能力，包括乳化活性和乳化穩(wěn)定性2 個(gè)方面。蛋白乳化能力與其疏水性和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性密切相關(guān)[21]。抗原性指抗原蛋白與其所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合的能力。例如，大豆蛋白中7S 球蛋白的溶解性較其他大豆蛋白高，但其分子內(nèi)部的巰基和二硫鍵含量相對(duì)較少，而高活性的疏水性氨基酸含量相對(duì)較多，因此，大豆7S 球蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，但乳化性及乳化穩(wěn)定性相遠(yuǎn)高于大豆球蛋白。大豆11S 球蛋白凝膠性較其他大豆蛋白高，但乳化性差，這歸于其分子內(nèi)部的二硫鍵和疏水作用共同維系的緊密β - 折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)11S 球蛋白分子的堿性亞基含有大量的疏水基團(tuán)使其容易發(fā)生聚集行為。

2 擠壓膨化對(duì)大豆蛋白聚集與解聚行為 結(jié)構(gòu)與功能的影響

2.1 擠壓膨化對(duì)大豆蛋白聚集與解聚行為的影響

蛋白質(zhì)的聚集與解聚行為是蛋白質(zhì)受到加熱、壓力、剪切力等條件影響發(fā)生的聚集與解聚現(xiàn)象，也是蛋白的重要功能特性之一。擠壓膨化大豆蛋白使大豆蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的改變，直接影響其功能特性[22]。主要與蛋白分子在擠壓膨化過程中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)，同時(shí)也與溫度、含水量、喂料速度、轉(zhuǎn)速、原料組分等有直接關(guān)系。擠壓膨化的高溫、高壓和高剪切作用使大豆蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致其變性和發(fā)生聚集與解聚行為。其作用機(jī)制可能是：一方面，大豆蛋白在擠壓膨化處理過程中，維系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的各種作用力會(huì)發(fā)生不同程度的破壞，使蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)及四級(jí)結(jié)構(gòu)改變和蛋白質(zhì)變性，促使其結(jié)構(gòu)得以展開，從而暴露包埋于蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)、并降低親水基團(tuán)[23]；另外，擠壓膨化的高熱作用會(huì)加速蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)，進(jìn)一步增加疏水作用，以至超過親水作用，從而增大蛋白質(zhì)顆粒相互碰撞或有序的“自組裝”反應(yīng)（肽鍵縮合作用、轉(zhuǎn)肽作用和肽段間的物理相互作用等），使大豆蛋白聚集[22]；另一方面，擠壓膨化的高熱和高剪切力作用使大豆蛋白分子進(jìn)一步“展開”并降解或斷裂成小的片段，在高壓和減壓作用下使初形成的小的片段再分解或解聚，生成更小的片段。相對(duì)較小的分子量肽段（分子量小于16 kDa） 會(huì)自發(fā)聚集。例如，在擠壓膨化過程中，剪切力引起大豆蛋白天然結(jié)構(gòu)展開，維系其空間構(gòu)象的二硫鍵數(shù)量增加、巰基數(shù)量減少，促使大豆蛋白形成較大分子量的聚集體[24]。大豆蛋白在擠壓膨化初期階段，蛋白分子各亞基解聚，隨著擠壓溫度升高或擠壓時(shí)間的延長(zhǎng)，解聚的亞基漸漸去折疊（β - 折疊數(shù)量降低），而去折疊的亞基會(huì)迅速聚集成聚集體。此外，大豆蛋白中大豆球蛋白和大豆伴球蛋白之間的相互作用對(duì)其聚集與解聚行為產(chǎn)生影響。例如，大豆球蛋白擠壓膨化時(shí)會(huì)解離出堿性亞基，一方面解離的堿性亞基容易聚集；另一方面堿性亞基與大豆β - 伴球蛋白亞基之間通過強(qiáng)的靜電作用（非共價(jià)鍵作用）或形成二硫鍵發(fā)生聚集形成聚集體。

2.2 擠壓膨化對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性的影響

2.2.1 擠壓膨化對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響

擠壓膨化具有高溫、高壓和高剪切力的協(xié)同作用。蛋白質(zhì)在受到擠壓膨化時(shí)，維系其高級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力變?nèi)?，蛋白的球形結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性結(jié)構(gòu)并失去其三維空間構(gòu)象，使折疊狀態(tài)得以伸展、各分子鏈發(fā)生重組，分子間的各種作用力（如氫鍵、二硫鍵等） 也發(fā)生改變或斷裂，引起蛋白質(zhì)變性、結(jié)構(gòu)與功能特性改變。同樣，大豆蛋白的擠壓膨化其結(jié)構(gòu)也發(fā)生顯著變化。

擠壓膨化大豆蛋白其微觀結(jié)構(gòu)變化表現(xiàn)在分子鏈展開、團(tuán)聚、聚集和交聯(lián)，并伴隨肽鏈的斷裂和降解以及氧化。同時(shí)，微觀結(jié)構(gòu)改變影響蛋白分子的相互作用力，進(jìn)而影響各級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，蛋白變性，分子間重新聚集、交聯(lián)和形成新的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。擠壓膨化大豆蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)不僅受到高溫、高壓和高剪切力協(xié)同作用，而且受含量水、螺桿轉(zhuǎn)速等多種因素的影響[25]。因此，擠壓膨化大豆蛋白肽鍵通常被破壞、蛋白裂解。也有學(xué)者認(rèn)為，擠壓膨化不影響大豆蛋白的水解度和氨基酸組成，說(shuō)明擠壓膨化不破壞大豆蛋白的肽鍵；同時(shí)，也有研究表明擠壓膨化引起的大豆蛋白的聚集與解聚行為中主要是形成了二硫鍵，對(duì)其他共價(jià)鍵的影響較小，蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)不受影響。因此，擠壓膨化對(duì)大豆蛋白肽鍵是否被破壞尚存爭(zhēng)議。大豆蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)受擠壓膨化影響較大，尤其是溫度和剪切力。高溫使大豆蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相互轉(zhuǎn)化，而剪切力和急速降壓則破壞二級(jí)結(jié)構(gòu)。例如，擠壓膨化大豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的α - 螺旋和β - 折疊會(huì)轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定的β - 轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲。二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化離不開蛋白分子間的各種作用力的變化，如二硫鍵增加、疏水作用降低等。擠壓膨化破壞大豆蛋白分子內(nèi)二硫鍵、形成分子間二硫鍵，并引起巰基數(shù)量的增加，使大豆蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)改變[26]。另外，二硫鍵和巰基數(shù)量也受剪切強(qiáng)度的影響。擠壓剪切使大豆蛋白暴露更多的巰基，在O2的作用下，巰基氧化成新的二硫鍵；擠壓剪切也會(huì)切斷大豆蛋白分子間的二硫鍵，從而使二硫鍵的數(shù)量降低，同時(shí)伴隨蛋白分子鏈的降解。大豆蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)在擠壓膨化過程中首先被破壞，并隨著擠壓強(qiáng)度的增大，蛋白發(fā)生聚集、分子量增加，隨著壓力進(jìn)一步加強(qiáng)，破壞其三級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白變性、聚集體解聚，大豆蛋白分子中的亞基也會(huì)降解成小分子亞基，甚至降解成不同分子量的氨基酸殘基。總之，擠壓膨化大豆蛋白的分子空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及維系結(jié)構(gòu)的作用力發(fā)生改變、化學(xué)鍵斷裂、蛋白變性，導(dǎo)致其功能特性改變。

2.2.2 擠壓膨化對(duì)大豆蛋白功能特性的影響

由于擠壓膨化的高熱、高壓和高剪切力的耦合作用，改變甚至破壞了大豆蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，其功能特性發(fā)生改變。溶解性是常用的評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)功能特性的重要指標(biāo)之一，與蛋白的乳化性、起泡性、疏水性等有密切關(guān)系。蛋白質(zhì)溶解性常用分散指數(shù)和氮溶解指數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。擠壓膨化溫度與大豆蛋白溶解性在一定范圍內(nèi)呈負(fù)相關(guān)。這歸于大豆蛋白受到擠壓膨化的高熱效應(yīng)后，使其高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)部疏水基團(tuán)外露，蛋白發(fā)生聚集；蛋白聚集體再經(jīng)疏水作用和二硫鍵的連接使分子量增大，氮溶解指數(shù)下降，溶解性降低。例如，金征宇等人[2]采用濕法擠壓膨化技術(shù)處理全脂大豆，發(fā)現(xiàn)蛋白的分散指數(shù)及氮溶解指數(shù)隨溫度升高而顯著降低。擠壓膨化的喂料速度、含水量、喂料速度等對(duì)大豆蛋白的溶解性也有直接的影響。魏益民等人[9]研究低溫條件下擠壓膨化的脫脂豆粕，得出氮溶解指數(shù)與含水量和喂料速度呈負(fù)相關(guān)，與擠壓溫度正相關(guān)，與螺桿轉(zhuǎn)速無(wú)關(guān)。需要注意的是，擠壓膨化溫度在160 ℃或更高時(shí)，大豆蛋白的溶解性不降反增，是因?yàn)楦邿崾挂淹ㄟ^二硫鍵等化學(xué)鍵聚合的蛋白聚集體發(fā)生解聚，溶解度增加。擠壓膨化大豆蛋白的乳化性會(huì)得到改善。主要是因?yàn)榇蠖沟鞍捉Y(jié)構(gòu)改變、分子鏈展開、暴露出疏水基團(tuán)，提高大豆蛋白在油- 水界面的吸附，從而促進(jìn)乳化液的形成；同時(shí)形成一種保護(hù)層，削弱對(duì)已形成的乳化狀態(tài)的破壞，乳化穩(wěn)定性提高[29]。然而，大豆蛋白在擠壓膨化過程中會(huì)導(dǎo)致二硫鍵數(shù)量增加，蛋白質(zhì)聚集，使大豆蛋白的疏水作用和分子間相互作用力減弱，乳化穩(wěn)定性會(huì)降低[30]。因此，擠壓膨化在提高大豆蛋白的乳化性同時(shí)也會(huì)降低其乳化穩(wěn)定性。此外，擠壓膨化大豆蛋白的二硫鍵和巰基變化對(duì)乳化性的影響值得注意。擠壓膨化一方面增加二硫鍵、降低巰基數(shù)量，使蛋白的乳化性降低；另一方面，擠壓膨化也破壞二硫鍵，經(jīng)還原作用增加巰基含量，乳化性增強(qiáng)。因此，要獲得理想乳化性的大豆蛋白產(chǎn)品，應(yīng)當(dāng)控制好擠壓膨化條件。決定大豆蛋白起泡能力的是其溶解性，同時(shí)擠壓膨化條件變化對(duì)其有直接影響。大豆蛋白受到擠壓膨化的高剪切力和螺桿轉(zhuǎn)速的作用，破壞了大豆蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)和分子內(nèi)的二硫鍵及次級(jí)鍵，并降低了蛋白質(zhì)氣- 液界面表面張力和增強(qiáng)了表面疏水性，使起泡性降低。研究還發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白的起泡能力會(huì)隨擠壓膨化參數(shù)的提高和擠壓膨化時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著改善；同時(shí)，觀察到擠壓膨化能夠提高大豆蛋白的泡沫容量，但降低泡沫穩(wěn)定性[31]。對(duì)比天然大豆蛋白，擠壓膨化使大豆蛋白的疏水性降低，可能是因?yàn)閿D壓膨化大豆蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使大豆蛋白分子部分聚集與解聚，導(dǎo)致疏水基團(tuán)減少，疏水性降低，起泡性得到提高。通常擠壓膨化大豆蛋白的持水性較好，擠壓使大豆蛋白組織化聚集則持水性降低。魏益民等人[9]研究了低溫?cái)D壓膨化脫脂豆粕的持水性，結(jié)果顯示大豆蛋白的持水性與螺桿轉(zhuǎn)速、含水量正相關(guān)，與喂料速度負(fù)相關(guān)。擠壓膨化溫度對(duì)大豆蛋白的持水性的影響受自由水含量臨界值的限制。Zhang J 等人[32]通過擠壓膨化脫脂豆粕觀察到：大豆蛋白最高持水性出現(xiàn)在最低水分含量和最高擠壓膨化溫度，與魏益民的研究結(jié)果不完全相同。

3 結(jié)語(yǔ)

大豆蛋白在經(jīng)歷擠壓膨化的高溫、高壓和高剪切作用和螺桿速度、含水量、喂料速度等多重因素的影響，對(duì)大豆蛋白的形態(tài)結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象產(chǎn)生不同程度的破壞，不但使大豆蛋白的溶解性、乳化性、起泡性及持水性等功能特性得到改善，而且能去除大豆蛋白中的對(duì)熱不耐受的抗?fàn)I養(yǎng)因子，并降低其致敏活性，更有助于大豆蛋白的消化、吸收和安全利用，并賦予其良好的口感和風(fēng)味。因此，擠壓膨化對(duì)于大豆蛋白源的食品開發(fā)具有顯著優(yōu)勢(shì)。

然而，大豆蛋白中包含有一定的脂類、淀粉糖類等物質(zhì)，這些糖脂大分子間的交互作用及其對(duì)蛋白質(zhì)的影響尚不完全清楚。因此，在開發(fā)大豆蛋白特殊配方食品、飲品等背景下，深入研究擠壓膨化大豆蛋白空間構(gòu)象變化及其與糖脂分子間互作的機(jī)制等，對(duì)于改善大豆蛋白功能特性，推動(dòng)大豆蛋白深加工具有重要意義。