奚德鑫，付詩涵，蔡錦順

（ 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000 ）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種接觸性傳染病，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起，俗稱藍(lán)耳病。PRRS是一種可導(dǎo)致母豬生育能力下降以及仔豬的呼吸道發(fā)生病變等一系列惡性結(jié)果的高危傳染病，特征表現(xiàn)是高發(fā)病率和死亡率、高熱、高病毒血癥以及與其他細(xì)菌的合并感染，一旦發(fā)病很難治愈，可對養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重影響。PRRSV的遺傳多樣性非常高，且這種多樣性可能對疫苗的開發(fā)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，開發(fā)更新和普遍有效的PRRSV 疫苗具有挑戰(zhàn)性[1]。目前分離到的PRRSV 分為美洲型和歐洲型兩種，近年來我國研究者在本土分離到的PRRSV絕大多數(shù)為美洲型，只有極少數(shù)的歐洲型[2]。豬的呼吸道是PRRSV的主要入侵部位，豬群的接觸、繁育等是導(dǎo)致PRRS傳播的主要行為，被污染的豬舍、器械和染病的豬等是PRRS 的主要傳染源，此外，仔豬對PRRSV 比成豬更易感。大量研究表明，斷奶仔豬感染PRRS 的概率顯著高于成豬和哺乳期仔豬，因而推測是母乳中的一些成分抑制了PRRSV的繁殖。本課題組經(jīng)過前期大量的資料查詢及總結(jié)，發(fā)現(xiàn)母乳中存在一部分外泌體，外泌體包裹著大量的miRNA，而有些miRNA又會通過某些通路釋放信號，給細(xì)胞一定刺激使其作出反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)或抑制病毒復(fù)制，由此推測可能是母乳中外泌體內(nèi)的miRNA 發(fā)揮了作用抑制了PRRSV 的復(fù)制，但目前仍缺乏相關(guān)研究?；诖?，文章論述了PRRSV的致病機(jī)制及預(yù)防研究進(jìn)展，總結(jié)了外泌體中miRNA 的作用機(jī)制及對PRRSV 的作用，為后續(xù)豬乳外泌體分離檢測以及篩選出相關(guān)miRNA、推進(jìn)后續(xù)PRRS疫苗研發(fā)提供參考。

1 PRRSV致病機(jī)制及預(yù)防研究進(jìn)展

1.1 PRRSV

PRRSV 是一種具有包膜的單鏈陽性RNA 病毒，高度局限于單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞，如豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）。由PRRSV 引起的PRRS 是豬中最嚴(yán)重的傳染病之一，該疾病的特征是母豬繁殖失敗和呼吸系統(tǒng)問題。由于病毒侵入免疫細(xì)胞后會破壞免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫抑制，發(fā)生繼發(fā)性細(xì)菌感染，并干擾其他商業(yè)疫苗對豬圓環(huán)病毒和經(jīng)典豬瘟病毒的免疫保護(hù)作用。而且，在感染PRRSV的豬中還觀察到長期病毒血癥（＞30 d）和抗體依賴性增強(qiáng)現(xiàn)象。PRRSV 通過一系列機(jī)制損害豬肺部的局部免疫反應(yīng)，包括黏膜纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)受損，PAMs的功能和數(shù)量減少，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡以及造成促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子之間的不平衡，可能使病毒在宿主中持續(xù)存在。PRRSV還可降低巨噬細(xì)胞的殺菌活性，導(dǎo)致對繼發(fā)感染的易感性上升[3]。受感染的豬會產(chǎn)生強(qiáng)烈且快速的體液反應(yīng)，但這些初始抗體不能提供保護(hù)，甚至可能通過介導(dǎo)抗體依賴性增強(qiáng)疾病而對機(jī)體有害。相反，中和抗體（NA）的發(fā)育被延遲，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)產(chǎn)生最初是不穩(wěn)定的，如PRRSV 特異性干擾素（IFN-γ）分泌細(xì)胞。盡管如此，有效接種疫苗似乎需要誘導(dǎo)強(qiáng)而快速的NA 和IFN-γ反應(yīng)。PRRSV 可調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，抑制關(guān)鍵細(xì)胞因子，如干擾素-α（IFN-α）；并可能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）。NAC 的發(fā)育似乎因糖蛋白5 中存在靠近主要中和表位的誘餌表位而受到損害。這種調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的能力可能因菌株或分離株而異。

1.2 PRRS的預(yù)防相關(guān)研究進(jìn)展

目前，商業(yè)疫苗（改良活疫苗）是效果良好，但其無法誘導(dǎo)高水平的中和抗體，因此不能提供有效的保護(hù)，防止PRRSV 感染。此外，這些疫苗還存在其他缺陷，如長期病毒血癥、易與田間菌株重組等。因此，為更好地預(yù)防和控制PRRS，還需進(jìn)一步研究PRRSV的致病機(jī)制。以miRNA介導(dǎo)而生產(chǎn)的PRRS 疫苗經(jīng)過大量的研究得到了認(rèn)證，這種新型疫苗將為PRRS的預(yù)防和治療起到關(guān)鍵性作用。

miRNA主要參與調(diào)控基因表達(dá)，使基因沉默。有研究利用miRNA 沉默技術(shù)作為弱化疫苗毒性的一種補(bǔ)充，miRNA 反應(yīng)原件（MREs）摻入病毒核蛋白質(zhì)的開放性讀碼框中，由miRNA介導(dǎo)的基因沉默可弱化病毒活性，產(chǎn)生減毒活疫苗的重配株。經(jīng)過大量試驗(yàn)證明，由miRNA 介導(dǎo)的基因沉默新方法弱化的疫苗比傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的疫苗活性更弱，安全性更高。我國目前仍采用以傳統(tǒng)疫苗為主的病毒防治措施，但由于滅活疫苗不能長期抵御PRRSV的侵襲，因而加快開發(fā)和生產(chǎn)非常迫切，而且生物技術(shù)疫苗和佐劑等研究也是工作的重點(diǎn)[4]。其中活疫苗預(yù)防效果比較好，缺點(diǎn)是缺少交叉保護(hù)能力；滅活苗與其他疫苗相比最為安全，但能力不強(qiáng)，不易起效；亞單位疫苗優(yōu)點(diǎn)是妊娠母豬可注射；DNA疫苗可與活疫苗聯(lián)合注射以加強(qiáng)預(yù)防效果；載體疫苗目前尚未投入市場[5]。綜上所述，現(xiàn)階段我國尚無一種疫苗可以針對性地預(yù)防PRRS，只能通過科學(xué)技術(shù)手段配合疫苗定向使用。RT-PCR檢測技術(shù)和ELISA檢測是目前檢測PRRSV的主要技術(shù)手段，RT-PCR檢測技術(shù)可檢測毒株類型，ELISA檢測技術(shù)則可測出注射疫苗的效果以及宿主體內(nèi)病毒的情況。

林德銳等[6]研究發(fā)現(xiàn)，采用肌肉注射與噴鼻接種的方法，不論是單獨(dú)接種豬瘟活疫苗還是同時(shí)接種豬瘟活疫苗和HP-PRRSV活疫苗，接種后免疫效果無明顯差異。丁尊俄等[7]發(fā)現(xiàn)，弱毒疫苗和滅活疫苗聯(lián)合免疫的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)免疫。劉歡歡等[8]發(fā)現(xiàn)，PRRS弱毒活疫苗除了可以抑制PRRSV，還可以減少產(chǎn)生病毒血癥的數(shù)量和持續(xù)時(shí)間，減輕呼吸系統(tǒng)疾病和繁殖障礙。王俊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的VLPs 疫苗比最大劑量弱毒苗的免疫效果好，且兩者中和抗體的產(chǎn)生量只有細(xì)微差別，因此VLPs 疫苗也是一種既安全又高效的預(yù)防PRRSV的疫苗。蘇瑋瑋等[10]發(fā)現(xiàn)，微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)在HP-PRRSV活疫苗工業(yè)化生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量控制方面具有顯著的優(yōu)勢。劉曉東等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高致病性PRRSV弱毒疫苗非常安全，對母豬進(jìn)行普免后不會引發(fā)不良反應(yīng)，并且適用于所有豬群。張洪亮等[12]發(fā)現(xiàn)，高致病性PRRSV 活疫苗對類NADC30 PRRSV可提供一定的交叉保護(hù)。李少麗等[13]研究發(fā)現(xiàn)，PRRS 滅活疫苗的加強(qiáng)免疫，尤其與同源性更高的PRRS 二價(jià)滅活疫苗聯(lián)合免疫，可加速試驗(yàn)豬體內(nèi)排毒、提高豬的日增重。但需要注意，在對患病豬進(jìn)行第一次PRRS 疫苗接種時(shí)應(yīng)做好安全試驗(yàn)工作，避免出現(xiàn)不良反應(yīng)[14]。

控制和根除PRRS是一個(gè)世界性問題。解決病毒的發(fā)病機(jī)制和病毒-宿主相互作用的機(jī)制至關(guān)重要，是預(yù)防和控制病毒的關(guān)鍵前提和基礎(chǔ)。由于PRRSV感染導(dǎo)致豬的免疫抑制，因此很難開發(fā)出理想的疫苗產(chǎn)生高水平的中和抗體。利用CRISPR/Cas9技術(shù)育種抗病豬、開發(fā)抗病毒分子可能是PRRS 防治的重要方向[15]。Xu 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV-ADE 感染顯著增加了線粒體呼吸鏈復(fù)合物的表達(dá)，并干擾了先天免疫信號、抗病毒蛋白、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和核糖體的功能，這些發(fā)現(xiàn)為闡明PRRSV-ADE感染的機(jī)制、篩選治療ADE 感染的新靶點(diǎn)以及開發(fā)新型PRRSV疫苗提供了新方向。PRRSV減毒疫苗株作為一種單鏈RNA 病毒，可在豬體內(nèi)表達(dá)外源蛋白并誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。Li等[17]研究建立了mAb，可以作為評估重組病毒中p17表達(dá)水平的有用工具。此外，間接ELISA方法在特異性和有效檢測重組病毒體內(nèi)抗體水平方面具有巨大潛力，對未來PRRSV的疫苗研究具有重要意義。

2 外泌體中miRNA的作用機(jī)制及對PRRSV的作用

2.1 miRNA對病毒的作用機(jī)制

在經(jīng)過查閱大量相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，miRNA 是高度保守、長度很短的非編碼單鏈核苷酸，miRNA在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起到重要作用，還可以調(diào)節(jié)病毒與宿主間的相互作用。病毒在侵入細(xì)胞后，miRNA能夠通過兩種方式與病毒發(fā)生相互作用，其一是調(diào)控miRNA 的表達(dá)控制病毒的增殖；另一種相互作用方式是宿主miRNA 與病毒的RNA 結(jié)合，以促進(jìn)或抑制病毒在體內(nèi)的復(fù)制、翻譯等行為，從而改變病毒的致病機(jī)制，即通過阻礙病毒mRNA的翻譯以抑制病毒的復(fù)制或通過提高病毒mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)病毒的復(fù)制[18]。通過miRNA 能夠靶向病毒的RNA，達(dá)到抑制病毒復(fù)制的特性，現(xiàn)已成為一種新的抗病毒的防御機(jī)制。miRNAs 是基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，對抗菌反應(yīng)具有積極作用，同時(shí)，由病原體相關(guān)分子模式參與的宿主病原體識別受體也在激活針對微生物感染的先天免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，微生物調(diào)節(jié)的miRNA和重要的PRRS信號通路之間的相互作用影響宿主對微生物病原體的免疫反應(yīng)[19]。而miRNA的運(yùn)輸則是依靠外泌體完成。

外泌體是一種具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡，是常見的膜結(jié)合納米囊，由細(xì)胞的胞吐作用形成并釋放到細(xì)胞間隙中，囊內(nèi)包裹各種核酸和蛋白質(zhì)等成分，可被靶細(xì)胞攝取以達(dá)到傳遞信號的作用等，還能夠作為生物標(biāo)志物、疫苗和藥物載體，并對其進(jìn)行合理的修飾以進(jìn)行治療干預(yù)[20]。豬乳外泌體中含有非常多的與免疫相關(guān)的miRNAs，而且外泌體具有很強(qiáng)的抵抗力。有研究對飼喂初乳的幼豬進(jìn)行體內(nèi)血清檢測，發(fā)現(xiàn)其miRNA 的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于飼喂常乳的幼豬，表明這些miRNA可通過外泌體進(jìn)入幼畜機(jī)體內(nèi)；并且初乳中的miRNA 數(shù)量高于常乳，推測動物的母乳可影響幼崽的免疫系統(tǒng)發(fā)育，將miRNA傳遞給新生動物，并發(fā)揮其生物學(xué)作用。這些免疫相關(guān)的miRNA均會功能性地靶向編碼細(xì)胞活素和其他免疫調(diào)節(jié)蛋白，以及免疫反應(yīng)信號通路上的其他組分等特異性轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而行使其免疫調(diào)控功能[21]。

2.2 外泌體中miRNA的作用以及對PRRSV的影響

已有許多研究以miRNA 為基礎(chǔ)對病毒進(jìn)行干擾、抵抗等，開展了達(dá)到防御病毒等目的的試驗(yàn)。郭雪坤[22]發(fā)現(xiàn)，有25 種可能抑制PRRSV 復(fù)制的候選miRNA，其中miR-181 的功能得到了具體驗(yàn)證。Zheng 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，感染PRRSV 時(shí)，豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）中miR-10a的表達(dá)水平升高，并通過下調(diào)宿主分子信號識別顆粒14（SRP14）蛋白的表達(dá)而進(jìn)一步抑制病毒的復(fù)制，發(fā)現(xiàn)了一種新的抗PRRSV 感染的IRF8-miR-10a-SRP14 調(diào)控途徑。Shi 等[24]發(fā)現(xiàn)，PRRSV-2 可能劫持宿主miR-541-3p以抑制宿主先天免疫應(yīng)答，miR-541-3p 能夠通過靶向干擾素調(diào)節(jié)因子7（IRF7）負(fù)調(diào)控Ⅰ型干擾素的轉(zhuǎn)錄，PRRSV-2 感染上調(diào)了miR-541-3p 的表達(dá)，從而促進(jìn)miR-541-3p 在MARC-145 細(xì)胞中的復(fù)制，進(jìn)而促進(jìn)自身復(fù)制。還有研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV 誘導(dǎo)的miR-218 下調(diào)有助于抑制Ⅰ型干擾素反應(yīng)，并可能為治療PRRSV 和其他病毒感染提供新的治療靶點(diǎn)[25]。張小霞等[26]研究找到了豬感染PRRSV時(shí)潛在的候選lncRNA和靶基因。

有研究者對感染PRRSV豬的血清外泌體進(jìn)行了鑒定和生物信息學(xué)分析，獲得了多種PRRSV 相關(guān)途徑和差異表達(dá)的miRNA，在PRRSV誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答、侵襲和外泌體攝取中起到潛在作用。此外，由于單個(gè)miRNA 可以靶向多個(gè)基因，并且單個(gè)基因也受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，因此有許多miRNA在上述途徑中執(zhí)行多種功能。一些miRNA已被驗(yàn)證可以通過作用于關(guān)鍵受體或直接靶向病毒基因組調(diào)節(jié)PRRSV 感染[27]。miR-122 的過表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)調(diào)控SOCS3蛋白的表達(dá)水平，導(dǎo)致IFN信號增強(qiáng)并減少病毒復(fù)制[28]。

研究表明，PRRSV感染通過延遲中和抗體的形成和細(xì)胞因子表達(dá)的失調(diào)影響先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的研究提高了對異?；虮磉_(dá)調(diào)控潛在機(jī)制的理解。在PRRSV 感染的情況下，TFs 介導(dǎo)PRRSV 的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白，用于調(diào)節(jié)炎癥基因表達(dá)、免疫細(xì)胞、非編碼RNA和其他相關(guān)宿主因子以及逃避宿主免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)病毒復(fù)制。TF還有助于清除未被宿主免疫系統(tǒng)消除的病毒并抑制病毒入侵。靶向特定TFs的小分子藥物的使用廣泛用于各種人類疾病的治療；因此，由于其在許多生物過程中的重要性及其在PRRSV感染期間的異?；钚?，TFs應(yīng)被視為未來的治療靶點(diǎn)[29]。

有研究發(fā)現(xiàn)，仔豬中斷奶仔豬感染PRRS 的概率顯著高于成豬和哺乳期仔豬，因此推測是母乳中的一些成分抑制了PRRSV 的繁殖，如母乳中外泌體中的miRNA 發(fā)揮了作用。此前，本課題組進(jìn)行了提取豬乳中外泌體的試驗(yàn)，并將提取的外泌體對感染PRRSV的MARC-145細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度測定，結(jié)果表明，豬乳外泌體中miRNA 可抑制PRRSV復(fù)制[30]。

盡管在過去三十年中對PRRS的研究取得了巨大的進(jìn)展，但對PRRSV 發(fā)病機(jī)制的分子和細(xì)胞機(jī)制的理解仍然有限，一些研究數(shù)據(jù)往往相互矛盾，難以解釋。如最近有大量信息可用于miRNA，一些miRNA 促進(jìn)PRRSV 復(fù)制，而另一些則抑制病毒復(fù)制，但其對PRRSV 的致病作用還需進(jìn)一步研究。PRRS 研究還面臨著一些挑戰(zhàn)和困難，首先，豬缺乏合適的免疫生化試劑和工具，并且豬的許多蛋白質(zhì)的細(xì)胞功能沒有得到適當(dāng)?shù)谋碚?。其次，PRRSV缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動物模型。第三，PRRSV的應(yīng)變變化似乎對宿主反應(yīng)影響很大。即使在相同的亞型中，不同的PRRSV菌株也可以表現(xiàn)出高序列變異，并顯示出不同的表型。

疫苗研發(fā)方面也沒有利用豬乳外泌體中的miRNA，相關(guān)研究人員尚未使用外泌體中miRNA制備PRRS疫苗，只是研發(fā)了一些傳統(tǒng)疫苗但是效果微弱，利用miRNA 沉默技術(shù)作為弱化疫苗毒性的一種補(bǔ)充，是現(xiàn)階段疫苗研發(fā)的方向和重點(diǎn)，由miRNA 介導(dǎo)的基因沉默可以弱化病毒活性，產(chǎn)生減毒活疫苗的重配株。大量試驗(yàn)證明，由miRNA介導(dǎo)的基因沉默新方法弱化的疫苗比傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的疫苗活性更弱，安全性更高。

3 展望

目前，對于miRNA 在抵御病毒方面的研究仍然是一項(xiàng)難題，miRNA 不好把握且數(shù)量較少，尤其是豬乳外泌體中存在的miRNA更甚，但該研究方向的前景很廣，一旦突破將會為PRRS的治療及預(yù)防起到幫助，也會為miRNA防御病毒提供參考。更好地了解PRRSV結(jié)合反向遺傳學(xué)對宿主反應(yīng)的調(diào)節(jié)可加快研發(fā)新一代以miRNA 為主導(dǎo)的PRRS 疫苗。這種分子方法將填補(bǔ)知識空白，并引導(dǎo)更加精細(xì)地了解PRRSV 的發(fā)病機(jī)制。隨著科技進(jìn)步，新型的PRRS疫苗必將在臨床中得到廣泛的應(yīng)用。