黃雅琳，李盛瓊，尹 杰，高 露，楊天俊，鄧 兵，陽愛國*，侯 巍*

（ 1. 四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041 ；2. 富順縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 自貢 643200 ； 3. 安州區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，四川 綿陽 622651）

牛結(jié)核病是一種無季節(jié)流行性、慢性、消耗性的人畜共患病，感染宿主類型較廣，約有50多種哺乳動物和25種禽類可感染此病。牛結(jié)核病最易感染奶牛，可通過呼吸道、消化道傳播，妊娠母牛也可經(jīng)過胎盤傳播給胎兒。牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis）、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）和禽型分枝桿菌（Mycobacterium avium）引起，使肺、乳房、淋巴等多個(gè)組織以及器官內(nèi)出現(xiàn)結(jié)節(jié)性肉芽腫和干酪性壞死灶，其中最常見的是肺結(jié)核，以漸進(jìn)性消瘦、干咳和呼吸困難為典型癥狀。目前，牛分枝桿菌等引起的牛結(jié)核病不會在世界范圍內(nèi)造成嚴(yán)重威脅，但感染率仍呈上升趨勢。要控制牛結(jié)核病的傳播與流行，需要加強(qiáng)對牛結(jié)核病診斷技術(shù)的相關(guān)研究。本文簡要概述了牛結(jié)核病的診斷方法，以期為牛結(jié)核病的早期診斷和及時(shí)治療提供參考。

1 牛結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法

1.1 細(xì)菌學(xué)方法

診斷牛結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)方法主要包括涂片鏡檢法、細(xì)菌培養(yǎng)法等。涂片鏡檢法是一種利用顯微鏡進(jìn)行的簡單快速檢測方法，但存在敏感性低、檢出陽性率低、無法區(qū)分死菌和活菌等問題。細(xì)菌培養(yǎng)法是通過分離培養(yǎng)疑似結(jié)核牛代謝物中的細(xì)菌，觀察培養(yǎng)細(xì)菌的形態(tài)，從而判斷是否為結(jié)核桿菌的方法。目前，有研究通過免疫磁分離法（IMS）獲得完整的細(xì)胞，便于后續(xù)的PCR或分枝桿菌生長指示管法（MGIT）培養(yǎng)檢測。Stewart 等[1]對使用IMS 處理和未使用IMS 處理的280 個(gè)牛淋巴結(jié)（206 個(gè)可見病變，74個(gè)無可見病變）分別進(jìn)行牛分枝桿菌檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過IMS 分離、富集后，有70.3%無可見病變淋巴結(jié)檢測為陽性，未處理的淋巴結(jié)僅有2.7%為陽性[1]，進(jìn)一步說明IMS方法處理樣品能夠有效濃縮目標(biāo)物，避免基質(zhì)對檢測過程的干擾，縮短檢測時(shí)間，提高靈敏度，提高臨床樣本中的牛分枝桿菌檢測陽性率。但結(jié)核桿菌對營養(yǎng)需求較苛刻，生長緩慢，并且在初次培養(yǎng)牛型結(jié)核分枝桿菌時(shí)，需在36～37 ℃條件下培養(yǎng)5～8 w才會出現(xiàn)菌落，因此檢出率低。目前，此類方法檢出率低，實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用較少。

1.2 分子生物學(xué)方法

1.2.1 聚合酶反應(yīng)（PCR）方法

PCR是常用的診斷方法之一，此方法可以快速診斷結(jié)核[2]，縮短確診時(shí)間，防止疾病廣泛傳播。Akhtar 等[3]對215頭奶牛的奶樣、鼻腔拭子進(jìn)行牛結(jié)核病的PCR檢測，確定了感染分枝桿菌的類型。Courcoul等[4]對牛結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)方法、組織病理學(xué)方法和PCR等3種檢測方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)PCR 方法特異性好，與組織病理學(xué)方法的敏感性相似，高于細(xì)菌學(xué)方法的敏感性。此外，PCR 檢測結(jié)果與待檢樣品中脫氧核糖核酸（DNA）提取方式也有關(guān)。Cornejo等[5]利用C18-羧丙基甜菜堿處理法提取牛奶中的DNA 后進(jìn)行牛分枝桿菌的PCR 檢測，敏感性為94.1%，高于玻璃微珠法提取方法。但此方法對試驗(yàn)條件要求較高，分枝桿菌間的相互交叉干擾、樣品中細(xì)菌過低過雜等均會造成假性結(jié)果。

1.2.2 熒光定量PCR

熒光定量PCR克服了普通PCR存在的一些不足，可作為檢測牛結(jié)核病的補(bǔ)充診斷方法，結(jié)核病病原菌實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測方法已納入國家標(biāo)準(zhǔn)。Sánchez-Carvajal 等[6]對腸系膜淋巴結(jié)、氣管和咽喉淋巴結(jié)等新鮮組織樣本進(jìn)行DNA 提取后進(jìn)行牛分枝桿菌的實(shí)時(shí)定量PCR 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此方法敏感性和特異性分別為77.1%和99.4%。

1.2.3 巢式PCR

與常規(guī)PCR 相比，巢式PCR 提高了反應(yīng)的特異性、靈敏性和準(zhǔn)確性。Araújo 等[7]運(yùn)用以rv2807 為引物的巢式PCR方法檢測腦組織中的結(jié)核分枝桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AN5株和H37Rv 株的檢測靈敏度在DNA 水平上分別可達(dá)到1.5 pg 和6.1 pg，特異性為100%。Carvalho 等[8]運(yùn)用多重PCR、巢式實(shí)時(shí)PCR方法分別對198頭牛（尸檢為疑似結(jié)核病病變）的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 種方法分別在7%、28%樣本中檢出病原菌，說明巢式實(shí)時(shí)PCR比多重PCR 方法檢測效率更高。Costa 等[9]運(yùn)用以IS6110 為引物的半巢式PCR 方法與細(xì)菌培養(yǎng)法對來自牛、野豬、鹿和狐貍的128個(gè)組織樣本進(jìn)行比較研究，兩種方法檢測結(jié)果的kappa系數(shù)為0.859，半巢式PCR方法檢測敏感性和特異性分別為98.2%和88.7%。

1.2.4 多重PCR

多重PCR可同時(shí)檢出多種病原體，具有較高的特異性和敏感性，可用于結(jié)核分枝桿菌的快速檢測鑒定，由Chambehian在1988年首次提出。Spositto等[10]對牛分枝桿菌的pncA基因（C169G突變）和結(jié)核分枝桿菌的IS6110序列進(jìn)行多重PCR檢測，成功區(qū)分鑒定了牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌。有研究對50 頭牛鼻拭子進(jìn)行DNA 分析，以篩選出的RvD1-Rv2031c 和IS6110 為引物進(jìn)行多重PCR 檢測，可檢測出牛分枝桿菌和其他非牛分枝桿菌[11-12]，這可作為一種有效的、高度特異的宰前輔助方法應(yīng)用于牛結(jié)核的日常監(jiān)測。Chen 等[13]建立了一種結(jié)合多重PCR 和變性高效液相色譜分析的新方法，此方法以分枝桿菌屬特異性16S rRNA 基因序列和結(jié)核分枝桿菌的IS6110、IS1081 為引物進(jìn)行多重PCR檢測，對84株菌株進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果均未觀察到交叉反應(yīng)。此方法可在1 h內(nèi)對提取純化的DNA完成快速檢測，檢測限值為0.8～1.6 pg。豆玲[14]針對炭疽pX01、布魯氏菌BM21 以及結(jié)核菌插入片段IS6110 設(shè)計(jì)3對特異性引物，建立了布病、炭疽、結(jié)核病三重PCR方法，該方法有較好的特異性，并且對炭疽、布魯氏菌以及結(jié)核桿菌的敏感性分別在345、313 以及322 fg/μL 以下。多重PCR 對臨床多種病原體混合感染的快速診斷提供了技術(shù)支撐。

1.2.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（LAMP）

LAMP 具有簡單快速、靈敏度高、不與其他分枝桿菌DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。Guo 等[15]分別對結(jié)核分枝桿菌hspX、gyrB 和IS6110 等3 個(gè)特異性基因進(jìn)行LAMP 檢測，同時(shí)與涂片鏡檢法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法進(jìn)行比較研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 種LAMP 方法的檢測特異性均為100%，其中g(shù)yrB-LAMP 法可于1 h 內(nèi)在濃度為60 CFU/mL的H37Rv懸液中檢出結(jié)核分枝桿菌，靈敏性與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相似，說明LAMP檢測結(jié)核分枝桿菌和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法有相似的靈敏度。LAMP 不需要PCR儀和昂貴的試劑，未來具有廣泛的應(yīng)用前景。

1.3 免疫學(xué)方法

1.3.1 牛型提純結(jié)核菌素（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)

PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是最常用的牛結(jié)核病診斷方法。此方法成本低，便于在基層推廣，但存在操作過程困難、耗時(shí)長、特異性差、重復(fù)性差、結(jié)果判定主觀性較強(qiáng)、無法鑒別免疫動物和感染動物等問題。此方法的敏感性也會因接種部位不同而變化，Casal 等[16]發(fā)現(xiàn)，在頸前區(qū)進(jìn)行試驗(yàn)的陽性結(jié)果概率會更高，后面可多考慮在頸前區(qū)部位進(jìn)行皮試反應(yīng)，使試驗(yàn)敏感性最大化。目前，部分地區(qū)將皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)作為牛結(jié)核病的檢疫依據(jù)[17]，此方法減少了檢疫中的交叉反應(yīng)和假陽性[18]，排除了檢出陽性中包含的非結(jié)核分枝桿菌感染和禽結(jié)核陽性，提高了特異性。

1.3.2 γ-干擾素（IFN-γ）檢測法

IFN-γ檢測法是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的牛結(jié)核病補(bǔ)充檢測方法[19]。該方法直觀性強(qiáng)，重復(fù)性好，易于標(biāo)準(zhǔn)化，可區(qū)分牛分枝桿菌和副結(jié)核或禽分枝桿菌等感染，是已納入國家標(biāo)準(zhǔn)的牛結(jié)核病早期診斷方法。Gan等[20]研究表明，測定血液中γ-干擾素（IFN-γ） mRNA表達(dá)水平可確定牛結(jié)核病的感染情況，并且RT-qPCR 與ELISA 檢測的相關(guān)性較好，準(zhǔn)確性高于PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)。房文斌等[21]運(yùn)用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、IFN-γ檢測法分別對牛型PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽性牛進(jìn)行檢測，陽性吻合率分別為81.27%和88.24%；采用γ-干擾素體外檢測法分別對牛型PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)可疑牛40頭、陰性牛24頭進(jìn)行檢測，檢出陽性率分別為57.5%、20.83%，證明了IFN-γ體外檢測法與比較變態(tài)反應(yīng)相比具有快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、可減少人為因素影響、提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)。Elnaggar 等[22]研究表明，一種ESAT-6、CFP-10 細(xì)胞因子的流式細(xì)胞術(shù)可作為體外檢測IFN-γ 法的替代方法，結(jié)核陽性動物在受到PPDB、ESAT-6/CFP-10 刺激后，體內(nèi)的CD4+T（CD45R 0+CD69+）細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，而未感染無變化[22]。但I(xiàn)FN-γ檢測法仍存在一些不足，如IFN-γ測定臨界值的選定對于結(jié)果影響很大[23]，檢測成本較高，試驗(yàn)材料須在采集后盡快在實(shí)驗(yàn)室中刺激培養(yǎng)，操作專業(yè)性較強(qiáng)等。目前，IFN-γ檢測法主要配合皮內(nèi)變態(tài)試驗(yàn)進(jìn)行牛結(jié)核病平行試驗(yàn)和系列試驗(yàn)[24-25]，應(yīng)用于對皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢出陽性或可疑牛進(jìn)行復(fù)檢。

1.3.3 白細(xì)胞介素-2（IL-2）檢測法

IL-2主要由活化的T淋巴細(xì)胞釋放，可作為細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的指標(biāo)，也可作為傳染性疾病診斷的潛在生物標(biāo)志物。也有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)特異性分枝桿菌抗原CFP-10-ESAT-6 融合蛋白刺激時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測感染牛體內(nèi)CD4+T 細(xì)胞分泌IL-2 明顯多于健康動物[26]。此方法比IFN-γ 檢測、IFN-γ 流式細(xì)胞術(shù)診斷牛結(jié)核病的檢測結(jié)果符合度高。

1.3.4 ELISA抗體檢測方法

動物感染結(jié)核后，病原菌主要引起以細(xì)胞免疫為主的免疫應(yīng)答，體液免疫相對滯后，檢測牛血清抗體的ELISA方法的臨床試驗(yàn)相對較少，但目前也有研究認(rèn)為ELISA等抗體檢測方法可作為輔助方法診斷牛結(jié)核病。Griffa等[27]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ELISA 抗體檢測重復(fù)性高，變異系數(shù)為25%，Pearson 系數(shù)為0.964 8。Cho 等[28]分別以重組MPB70 和SahH（M70S）以及天然20 kda 蛋白（20K）作為抗原建立ELISA 檢測方法，發(fā)現(xiàn)20K-ELISA 的敏感性和特異性分別為94.4%和98.2%，M70S-ELISA 的敏感性和特異性分別為94.4%和97.3%。Joseph 等[29]對123 頭水牛分別通過PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、ELISA、PCR等3種試驗(yàn)方法進(jìn)行牛結(jié)核病檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ELISA 和PCR 方法分別檢出陽性率為8.94%和8.13%，ELISA 與PCR 一致性高（kappa 值為0.856），若與皮試變態(tài)反應(yīng)一起使用，ELISA 和PCR 的敏感性更高，假陰性結(jié)果更少。

1.3.5 熒光偏振檢測方法（FPA）

FPA 是通過熒光偏振儀測量由用熒光素標(biāo)記的膚綴合物發(fā)射光的偏振狀態(tài)以確定抗體是否存在，以確定感染情況。Surujballi 等[30]以熒光素標(biāo)記的MPB70 蛋白作為抗原進(jìn)行FPA檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ROC曲線分析建議的截?cái)帱c(diǎn)，F(xiàn)PA 檢測的敏感性、特異性分別為92.9%、98.3%，并對副結(jié)核分枝桿菌感染動物無交叉反應(yīng)，后續(xù)可作為檢測牛分枝桿菌感染的準(zhǔn)確指標(biāo)。

1.3.6 其他方法

動物體內(nèi)的淋巴細(xì)胞和髓細(xì)胞在不同程度上參與了對結(jié)核菌的免疫反應(yīng)，致敏的外周血淋巴細(xì)胞在特異性抗原刺激下會產(chǎn)生增殖反應(yīng)，因此可以測定淋巴細(xì)胞增殖的程度，判斷淋巴細(xì)胞被特異性抗原致敏的程度以及機(jī)體對牛分枝桿菌的細(xì)胞免疫狀態(tài)。中性粒細(xì)胞也在免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，感染牛結(jié)核病的牛的陽性血清可誘導(dǎo)健康中性粒細(xì)胞核固縮、腫脹、凋亡[31]，而未感染的牛無變化，因此中性粒細(xì)胞檢測可成為確定牛結(jié)核病感染的輔助診斷方法。

此外，有學(xué)者認(rèn)為，分析生物樣本釋放的揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）可以進(jìn)行牛結(jié)核病診斷。Brebu 等[32]分析了來自羅馬尼亞3 個(gè)農(nóng)場的18 頭被診斷患有牛結(jié)核病奶牛和來自同一農(nóng)場的27頭牛結(jié)核陰性奶牛，對呼吸、糞便和皮膚釋放的VOC 樣本進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在通過呼吸釋放出80 種VOCs、糞便釋放出200種VOCs、皮膚釋放出80種VOCs 中，共統(tǒng)計(jì)分析出了3種試探性呼吸VOC生物標(biāo)志物、9種糞便VOC生物標(biāo)志物和3 種試驗(yàn)性皮膚VOC 生物標(biāo)志物。但此種方法仍處于初級研究階段，未來可成為牛結(jié)核病篩查的另一種診斷方法。

2 牛結(jié)核病診斷方法應(yīng)用現(xiàn)狀

在牛結(jié)核病的診斷方法中，細(xì)菌學(xué)方法已不能滿足臨床檢測診斷牛結(jié)核病的需要，不適于基層應(yīng)用，未被廣泛應(yīng)用。分子生物學(xué)方法一般具備較強(qiáng)的敏感性和特異性，但檢測過程需要特定的儀器設(shè)備，檢測技術(shù)要求較強(qiáng)，對操作人員以及實(shí)驗(yàn)室條件提出了一定的要求，此類方法主要在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用。目前，免疫學(xué)方法是牛結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法中應(yīng)用最廣泛的一類方法。大多數(shù)國家也主要采用PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和體外檢測IFN-γ 法聯(lián)合使用進(jìn)行診斷以確定結(jié)核陽性牛。

目前，我國牛結(jié)核病主要以“監(jiān)測、檢疫、撲殺和消毒”相結(jié)合的方式進(jìn)行綜合性防治，分類指導(dǎo)、因場施策、逐步凈化，積極開展場群和區(qū)域凈化工作。在我國現(xiàn)階段的檢測方法中，從價(jià)格、實(shí)用性、準(zhǔn)確性等方面出發(fā)，最優(yōu)選的確診方法主要是先用PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行初篩，再通過IFN-γ 檢測法確診，這兩種方法具有互補(bǔ)關(guān)系，也是減少牛結(jié)核病流行的有效方法。

3 展望

牛結(jié)核病呈現(xiàn)宿主范圍廣、感染基數(shù)大、病程緩慢、發(fā)病數(shù)相對較少的特點(diǎn)，給牛生產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成一定的損失。目前，控制牛結(jié)核病的主要措施是通過定期對牛群進(jìn)行檢疫以根除病牛。

雖然世界各國致力于研究開發(fā)牛結(jié)核病的新型快速診斷技術(shù)，但目前的牛結(jié)核診斷的方法可能只適合疫病進(jìn)展的一個(gè)階段，但不一定適用于其他階段，仍缺乏一種敏感、快速、特異性強(qiáng)、精準(zhǔn)診斷牛結(jié)核病的方法，這對牛結(jié)核病的防控造成了困擾。后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步對牛結(jié)核病診斷方法進(jìn)行研究，以保障畜牧業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全。