劉建慧，張永明，，3*，趙雪城，張凱凱

（ 1. 內(nèi)蒙古師范大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000 ； 2. 內(nèi)蒙古大溪生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000 ； 3. 內(nèi)蒙古為旭生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000 ）

牛病毒性腹瀉?。˙VD）是一種威脅牛場安全且常見的傳染疾病，可感染各年齡段牛的呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，并造成一定程度損傷的一種免疫抑制疾病[1]。BVD 又名牛病毒性腹瀉-黏膜?。˙VD-MD），病原為黃病毒科瘟病毒屬的牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）[2]。BVDV屬于單股正鏈RNA病毒，基因組全長約12.3～12.5 kb，由一個開放閱讀框（ORF）和5'-UTR及3'-UTR組成[3]。BVD在世界各個地方流行，呈全球化分布，春、冬兩季發(fā)病率較高[4]。BVD最早發(fā)生于美國，典型癥狀是腹瀉，其他癥狀包括高熱、萎靡不振、厭食、流鼻涕和唾液增多，也會影響母牛繁殖等。BVDV最常見于牛群中，其中以犢牛最易感[5]，可感染豬[6]、駱駝及其他反芻動物[7]，也會感染鹿、袋鼠等動物。BVDV的主要傳染源是病畜和帶毒動物，其中最具感染性和特殊性的是終生帶毒且散播病毒的牛[8]，即持續(xù)感染牛（PI牛）。

我國于1980 年首次發(fā)現(xiàn)BVDV 的蹤跡，隨后于1983年首次分離并且鑒定到毒株[9]，之后在不同省份均有檢出，進(jìn)而表明其呈現(xiàn)一種全國性流行的趨勢。本研究針對內(nèi)蒙古部分地區(qū)的牛場感染BVDV 的情況進(jìn)行了調(diào)查和分析，以期為牛場預(yù)防和管理提供參考，填補(bǔ)內(nèi)蒙古各地區(qū)BVD 的流行病學(xué)數(shù)據(jù)空白，也對該病的預(yù)防與治療提出綜合性建議。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

在2021 年1 月至2022 年8 月，對內(nèi)蒙古自治區(qū)的6 個荷蘭斯坦牛牛場采取隨機(jī)抽樣方法收集試驗所需的2 400份血清樣品（其中鄂爾多斯、巴彥淖爾、呼和浩特、烏蘭察布、通遼、包頭牛場各400頭），血清需在-20 ℃的冷庫中存放。試驗牛體重在420～490 kg之間，飼料以優(yōu)質(zhì)干草和各種蛋白質(zhì)精料為主。

1.1.2 試劑與儀器

動物植物病毒DNA/RNA 快速提取試劑盒（西安天隆科技有限公司）、BVD-MD 抗體檢測試劑盒cELISA（美國KERNEL 公司）、qRT-PCR 試劑盒TransScript ⅡMultiplex Probe One-Step qRT-PCR SuperMix UDG（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

生物安全柜（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、超凈工作臺（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）、全自動核酸提取儀（南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司）、全自動PCR分析系統(tǒng)（西安天隆科技有限公司）、醫(yī)用冰箱（青島海爾特種電器有限公司）、96 孔酶標(biāo)儀（450 nm，北京天石天力醫(yī)療器械技術(shù)開發(fā)中心）、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、微量振蕩器（太倉市實驗設(shè)備廠）、單道移液器（北京大龍儀器設(shè)備有限公司）、離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）、0.2 mL PCR 8-strip Tubes 和Flat 8-strip Caps（沈陽依托生物有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 BVD抗體檢測

試驗前1 h 將試劑盒從冰箱中取出回復(fù)室溫；準(zhǔn)備好足夠的洗滌液工作液備用，一份濃縮液加入9份去離子水，得到工作液。設(shè)置好對照及樣品在抗原包被板的位置，建議將陰性和陽性對照血清分隔加入，所有孔中加入50 μL的BVDV Assay Diluent檢測液，在設(shè)定的對照孔分別加入陽性對照和陰性對照各50 μL，其余作為樣品孔中加入50 μL 的樣品血清。封板膜封好，室溫20～25 ℃中避光孵育60 min；棄去板中的液體，每孔加入300 μL 洗滌液洗板5 次，最后將板孔拍干。所有孔先加入50 μL 的Conjugate酶標(biāo)結(jié)合物，之后每孔加入50 μL的Mab單抗，封板，溫箱37 ℃下暗處避光孵育30 min；每孔加入300 μL 洗滌液洗板5次，板孔拍干；每孔加入100 μL的TMB底物，室溫20～24 ℃下暗處避光孵育15 min 每孔加入100 μL 終止液，酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)，計算樣品阻斷率。

有效性判定：陰性對照的OD 平均值必須大于0.5，陽性對照阻斷率≥50%。

樣品結(jié)果判定：樣品PI值小于40%，即為抗體陰性；PI值大于50%，即為抗體陽性；結(jié)果在陰性和陽性之間為可疑,可在56 ℃下溫育30 min后復(fù)核。

1.2.2 BVD抗原檢測

試驗前待測樣品、所有試劑恢復(fù)到室溫20～25 ℃，用天隆科技動物植物病毒DNA/RNA 快速提取試劑盒提取。試劑盒各組分使用充分融化混勻，離心管內(nèi)的試劑需離心數(shù)秒后使用。

反應(yīng)體系（20 μL）：2×PerfectStartTMMultiplex Probe One-Step Reaction Mix 10 μL、TransScript Ⅱ Multiplex Probe One-Step Enzyme Mix UDG 0.8 μL、RNase-free Water 5.6 μL、上下游引物各0.4 μL、探針0.8 μL、樣本2 μL。引物及探針序列由深圳華大基因科技有限公司合成，見表1。

表1 BVDV引物序列Tab.1 BVDV primers sequence

將配好的試劑放在全自動PCR分析系統(tǒng)機(jī)器中，反應(yīng)程序：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄5 min；94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸30 s，45 個循環(huán)。試驗結(jié)束后記錄試驗數(shù)值。

試驗成立條件判定：陽性對照的CT 值為32～34；陰性對照為無CT值。

樣品結(jié)果判定：樣品有CT 值時，抗體判定為陽性；無CT值時，判定為陰性。

2 結(jié)果與分析

本試驗采用BVDV 的抗原和抗體試劑盒對2021—2022 年在內(nèi)蒙古自治區(qū)6 個荷蘭斯坦牛牛場采集的2 400 份血清樣品進(jìn)行檢驗，抗原檢驗結(jié)果見表2，抗體檢驗結(jié)果見表3。

表2 2021—2022年各牛場血清樣品BVDV抗原檢驗結(jié)果Tab.2 BVDV antigen test results of serum samples in cattle farms from 2021 to 2022

表3 2021—2022年各牛場血清樣品BVDV抗體檢驗結(jié)果Tab.3 BVDV antibody test results of serum samples in cattle farms from 2021 to 2022

由表2 可知，在2 400 血清樣品中，BVDV 抗原陽性數(shù)量為460，占總數(shù)的19.17%。其中鄂爾多斯牛場的陽性數(shù)量最多，占其檢測樣品的28.50%；包頭牛場的陽性數(shù)量最少，占其檢測樣品的10.50%。6個牛場樣品BVDV抗原陽性率的范圍是10.50%～28.50%。

由表3 可知，在2 400 血清樣品中，BVDV 抗體陽性數(shù)量為334，占總數(shù)的13.92%。其中烏蘭察布牛場的陽性數(shù)量最多，占其檢測樣品的19.50%，巴彥淖爾牛場的陽性數(shù)量最少，占其檢測樣品的8.00%。6 個牛場樣品BVDV 抗體陽性率的范圍是8.00%～19.50%。

3 討論

近年來，我國牛養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展。內(nèi)蒙古是我國牛養(yǎng)殖基地最多的地區(qū)，進(jìn)行BVDV 檢測對維護(hù)牛群健康、提高養(yǎng)殖效益、促進(jìn)牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有非常重要的意義。1995 年，申之義等[10]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，內(nèi)蒙古西部地區(qū)BVDV 陽性檢出率為62.5%，最高陽性檢出率為100%。2013 年，童欽[11]對內(nèi)蒙古自治區(qū)的地區(qū)進(jìn)行了BVDV的檢驗，陽性檢出率為58.35%。2014 年，李智勇等[12]對來自內(nèi)蒙古地區(qū)17個牛場的血清進(jìn)行BVDV抗體檢測，發(fā)現(xiàn)抗體陽性平均率為88.9%（共2 391份樣品）；對5個牛場進(jìn)行BVDV的抗原檢測，抗原陽性平均率為3.6%（共222份樣品）。

本試驗于2021—2022 年在內(nèi)蒙古鄂爾多斯、巴彥淖爾、呼和浩特、烏蘭察布、通遼和包頭等6個不同地區(qū)的牛場采集了2 400份的血清樣品，結(jié)果顯示，來自6個牛場的樣品BVDV 抗原陽性率為10.50%～28.50%，抗原陽性平均率為19.17%；樣品BVDV抗體陽性率為8.00%～19.50%，抗體陽性平均率為13.92%。結(jié)果表明，內(nèi)蒙古不同地區(qū)均存在BVDV 感染，但相比前幾年的陽性檢出率呈下降趨勢，也從側(cè)面提示養(yǎng)殖戶已開始重視對相關(guān)的檢測和防控處理。6 個牛場綜合評估中，鄂爾多斯牛場的情況比其他牛場嚴(yán)重，針對鄂爾多斯牛場的陽性抗原檢出數(shù)量和陰性的檢出數(shù)量進(jìn)行分析，推測該牛場可能存在PI牛。PI牛存在免疫耐受現(xiàn)象，終生攜帶BVDV，并且終生向外界排毒[13]。識別PI?？赏ㄟ^檢測抗原和抗體，因為PI牛抗原檢出是陽性，抗體檢出為陰性，說明PI牛不能產(chǎn)生抗體[14]。因此，識別鑒定PI牛、發(fā)現(xiàn)后及時隔離處理是預(yù)防和控制BVDV最為有效的措施，也是對養(yǎng)殖場保護(hù)的一大重要措施。

其他地區(qū)血清樣品BVDV 的檢測結(jié)果表明，牛感染BVDV的原因存在多方面可能。如祁小英[15]研究發(fā)現(xiàn)，新生牛犢和幼齡牛易感性較高；BVDV冬季和夏季的發(fā)病率較高，發(fā)生過BVD 疫情的牛場會出現(xiàn)反復(fù)性暴發(fā)[16]，兩者提示BVDV 存在季節(jié)性和地域性；牛引入來源地的不同，原產(chǎn)地的不同也會影響牛的體質(zhì)；牛群群居環(huán)境的差距，牛場的消殺和清理周期不同也是患病的影響因素之一，每天定期清除排泄物的群體的感染風(fēng)險低于2 d清理一次的群體；此外，接種疫苗情況也是牛感染BVDV 的影響因素之一，應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)氐膶嶋H情況進(jìn)行科學(xué)接種預(yù)防感染等。

綜上，BVD與牛群所處環(huán)境和衛(wèi)生清潔情況以及養(yǎng)殖戶的飼養(yǎng)管理密切相關(guān)。因此，為預(yù)防BVD 蔓延和暴發(fā)須采用綜合性的措施。首先，在日常飼養(yǎng)中應(yīng)定期清理牛棚并進(jìn)行消殺處理，加強(qiáng)對養(yǎng)殖場的蚊、鼠以及其他害蟲的防治以預(yù)防中間宿主傳播，可以安裝滅蠅燈和老鼠夾等。建立健全的消毒管理體系，選擇合適的消毒藥劑與消毒藥品，切斷感染和傳染途徑[17]。其次，犢牛應(yīng)使用高溫消殺后的新鮮乳汁飼喂，也可適當(dāng)服用抗病毒性藥物進(jìn)行預(yù)防[18]。同時注意加強(qiáng)對人員進(jìn)出的管理，進(jìn)入牛棚前更換消毒潔凈的工作服，嚴(yán)禁無關(guān)人員和接觸其他動物的人員進(jìn)入，避免交叉感染[19]。新購入的牛應(yīng)先進(jìn)行單獨隔離，避免不同來源的動物在同一個圈舍中飼養(yǎng)[20]，以預(yù)防疾病的傳播和擴(kuò)散。牛場必須建立健全的衛(wèi)生檢疫體系，定期監(jiān)測病毒抗體水平。提高飼養(yǎng)管理水平，應(yīng)根據(jù)牛的身體供應(yīng)健康平衡的營養(yǎng)飼料，嚴(yán)格把控食物的來源，嚴(yán)禁選用劣質(zhì)和霉變的飼料[21]，也要定期檢測水源質(zhì)量，降低感染率。

目前，治療BVD一般采用收斂止瀉[22]和強(qiáng)心補(bǔ)液兩種方法，補(bǔ)液一般選擇靜脈注射葡萄糖等[23]。近年來，隨著中草藥在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用愈發(fā)廣泛，使用中草藥也成為治療BVDV的新選擇。劉玲利[24]研究表明，苦參堿和淫羊藿苷對BVDV具有抑制作用。預(yù)防BVD仍以接種疫苗為主，根據(jù)本地區(qū)養(yǎng)殖場BVD流行病學(xué)的實際情況，針對性接種牛病毒性弱毒疫苗和豬瘟兔化弱毒疫苗等，從而高效地防范BVDV感染[25]。

4 結(jié)論

本研究調(diào)查了內(nèi)蒙古地區(qū)6 個牛養(yǎng)殖場內(nèi)BVDV 的抗體、抗原水平，結(jié)果顯示，BVD在內(nèi)蒙古自治區(qū)部分地區(qū)的牛養(yǎng)殖場存在感染情況。針對這種傳染性疾病，養(yǎng)殖戶首先需要了解病毒的流行特點和危害，遵循預(yù)防大于治療的原則采取相應(yīng)的預(yù)防措施；若發(fā)現(xiàn)疑似癥狀的病牛應(yīng)立即隔離診斷治療，病死牛進(jìn)行無害化處理，防止病毒蔓延傳播。綜上所述，應(yīng)高度重視BVD 的預(yù)防、診斷和治療，建立科學(xué)的疾病預(yù)防、診斷、治療管理體系，及時對病牛和周邊環(huán)境做出相應(yīng)處理，保障牛群安全。