賀立虎 王文光 李娟麗

摘要 為獲取生物活性高的繡球菌液體培養(yǎng)菌種，采用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)液體培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以菌絲生物量為指標(biāo)，建立了菌絲生物量與培養(yǎng)pH、溫度、裝瓶量的數(shù)據(jù)模型，得到了適宜的培養(yǎng)條件，即pH為4.5，培養(yǎng)溫度為23.9 ℃，裝液量為114 mL，在此培養(yǎng)條件下，菌絲生物量達(dá)5.9 g/L。

關(guān)鍵詞 繡球菌；菌絲生物量；響應(yīng)面優(yōu)化法

中圖分類(lèi)號(hào) S 646? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2023）23-0044-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.23.010

Application of Response Surface Optimization Method in Culture Conditions of Liquid Spawn of Sparassis crispa

HE Li-hu， WANG Wen-guang，? LI Juan-li

（Yangling Vocational & Technical College，Yangling，Shaanxi? 712100）

Abstract Response surface methodology （RSM） was used to optimize the culture conditions for obtaining high bioactivity Sparassis crispa species， and mycelial biomass was taken as the index， the data model of mycelium biomass， culture pH， culture temperature and culture volume was established， and the suitable culture conditions were obtained. The culture conditions were pH 4.5， culture temperature 23.9 ℃ and culture volume 114 mL， the mycelium biomass reached 5.9 g/L.

Key words Sparassis crispa;Mycelial biomass;Response surface optimization method

基金項(xiàng)目 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院2021年科技創(chuàng)新項(xiàng)目（ZK21-69）；陜西省2023年農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介 賀立虎（1980—），男，陜西合陽(yáng)人，副教授，從事食用菌資源開(kāi)發(fā)與利用研究。

收稿日期 2022-11-20

繡球菌（Sparassis crispa），又名繡球蕈、對(duì)花菌、干巴菌、椰菜菌、蜂窩菌等，為非褶孔菌目繡球菌科繡球菌屬。因其具有超高的激活免疫能力，在日本有“夢(mèng)幻神奇菇”之稱(chēng)。因其含有多種生物活性物質(zhì)，尤以β-葡聚糖含量最高［1］，使其具有抗腫瘤［2］、增強(qiáng)免疫力［3］、保護(hù)胃黏膜、抗氧化［4］、抗衰老［5］、促進(jìn)傷口愈合［6］、提高造血功能［7］等多重保健功效，在保健品市場(chǎng)和化妝品領(lǐng)域受到了追捧［8］。

繡球菌生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境要求嚴(yán)格，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，野生資源產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足市場(chǎng)的需求。經(jīng)過(guò)大量的研究，近年來(lái)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了人工栽培。筆者通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化法研究pH、培養(yǎng)溫度、裝瓶量，旨在為獲取生物活性高的繡球菌液體培養(yǎng)菌種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方法

將繡球菌母種（閩秀1號(hào)）接種于固體培養(yǎng)基（新鮮松針250 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，瓊脂粉15 g，水1 000 mL）［9］上，于25 ℃培養(yǎng)25 d。將培養(yǎng)后的繡球菌菌種定量接種于液體培養(yǎng)基（新鮮松針250 g，葡萄糖20 g，酵母膏10 g，瓊脂粉15 g，水1 000 mL）［7］，采用250 mL錐形瓶，每瓶按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行定量裝樣，于150 r/min恒溫?fù)u床上進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行，培養(yǎng)25 d，進(jìn)行菌絲生物量的測(cè)定。

1.2 菌絲生物量的測(cè)定方法［10］

取恒溫培養(yǎng)25 d的液體培養(yǎng)基25 mL于離心機(jī)中在5 000 r/min下離心10 min，棄去上清液，下層菌絲體用蒸餾水清洗3～4次，吸取表面水分，然后在恒溫干燥箱中于60 ℃條件下烘干至恒重，稱(chēng)取重量計(jì)算每100 mL發(fā)酵液中的菌絲體生物量（g/L）。

1.3 中心組合設(shè)計(jì)（CCD）

依據(jù)pH、培養(yǎng)溫度和裝液量的單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定pH、培養(yǎng)溫度和裝液量的試驗(yàn)范圍，以菌絲生物量為試驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)（CCD），對(duì)繡球菌液體菌種培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2020和Design Expert 11.0.1 軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 pH對(duì)菌絲生物量的影響。

由圖1可知，隨著pH的升高，菌絲生物量快速增加，當(dāng)pH達(dá)到6左右時(shí)，菌絲生物量達(dá)到最大4.8 g/L，然后隨著pH的增加，菌絲生物量快速下降。pH過(guò)大或過(guò)小對(duì)菌絲生物量都有一定的抑制。

2.1.2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生物量的影響。

由圖2可知，溫度對(duì)菌絲生物量呈拋物線(xiàn)式的影響，在低溫區(qū)，隨著溫度的升高，菌絲生物量快速增加，當(dāng)達(dá)到27 ℃左右時(shí)，菌絲生物量達(dá)到最大值5.3 g/L，隨后隨著溫度的繼續(xù)升高，菌絲生物量快速下降。此趨勢(shì)也符合溫度對(duì)微生物影響的一般規(guī)律。

2.1.3 裝液量對(duì)菌絲生物量的影響。

由圖3可知，在40～120 mL的裝液量時(shí)，隨著裝液量的增加，菌絲生物量也隨之增加，當(dāng)裝液量在120 mL時(shí)，菌絲生物量達(dá)到最大為5.2 g/L，隨后隨著裝液量的增加，菌絲生物量略微降低。

2.2 回歸方程的建立及顯著性分析

依據(jù)中心組合設(shè)計(jì)（CCD）進(jìn)行試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到試驗(yàn)指標(biāo)與各因素之間的回歸方程模型（1）。

Y=0.530 4-0.068 4X1+0.046 4X2+0.038 5X3-0.043 7X1X2-0.038 7X1X3-0.063 7X2X3-0.042 8X21-0.025 1X22-0.028 7X23（1）

對(duì)回歸方程模型（1）以5%為置信區(qū)間進(jìn)行顯著性水平分析，回歸方程模型、各因數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

依據(jù)回歸方程顯著性要求，當(dāng)方程顯著性為顯著，失擬性誤差為不顯著時(shí)，方程模型呈顯著性，即與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果具有較好的擬合性。由響應(yīng)面模型方差分析可知，該試驗(yàn)回歸方程模型的F為17.77（判定值F（0.01，9，13）=4.19），呈極顯著性，失擬性誤差的F為2.677（判定值F（0.05，5，8）=3.69），呈不顯著，所以該回歸方程模型呈極顯著性。

在此回歸方程模型中，各因素X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X2X3、X21、X22、X23的P值均小于0.05，表明各因素都呈顯著性。

預(yù)測(cè)擬合度R2為0.593 7，校正擬合度R2為0.872 8，預(yù)測(cè)擬合度≤校正擬合度，說(shuō)明模型是合理的。信噪比值大于4 為理想值，該模型的信噪比為13.495 3，說(shuō)明比值理想，可以被用來(lái)解釋設(shè)計(jì)方案。

2.3 最優(yōu)試驗(yàn)方案確定

依據(jù)二次項(xiàng)中心化組合設(shè)計(jì)，將因素水平帶入方程模型（1）中，可得因素水平回歸方程（2）。

Y=-2.245 46+0.239 838X1+0.094 825X2+0.193 91X3-0.003 646X1X2-0.000 646X1X2-0.000 354X2X1-0.010 702X21-0.000 698X22-0.000 032X23

（2）

由表3可知，各因素之間均有顯著的交互作用（P＜0.05），利用Design Expert 11.0.1軟件進(jìn)行最優(yōu)方案優(yōu)化，當(dāng)pH為4.5、培養(yǎng)溫度為23.9 ℃、裝液量為114 mL時(shí)，可以得到較好的菌絲生物量，依據(jù)方程模型（2）可以得到理論菌絲生物量為5.9 g/L（圖4～6）。

2.4 數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證

在設(shè)定菌絲生物量Y=5.9 g/L的前提下，培養(yǎng)pH、培養(yǎng)溫度、裝液量都在試驗(yàn)因素水平范圍內(nèi)（4＜X1＜8，18＜X2＜30，60＜X3＜120），使菌絲生物量達(dá)到最大，通過(guò)數(shù)學(xué)模型對(duì)繡球菌液體菌種培養(yǎng)條件進(jìn)行預(yù)測(cè)和優(yōu)化，在Design Expert 11.0.1軟件中得出較優(yōu)的解決方案，即理論預(yù)測(cè)菌絲生物量為5.9 g/L，此時(shí)pH為4.5，培養(yǎng)溫度為23.9 ℃，裝液量為114 mL，在此試驗(yàn)條件下，連續(xù)做5次平行試驗(yàn)，測(cè)得菌絲生物量平均值為5.8 g/L，與預(yù)測(cè)結(jié)果吻合度較好，說(shuō)明利用響應(yīng)面分析優(yōu)化繡球菌液體菌種培養(yǎng)是可行的。

3 結(jié)論

該研究采用響應(yīng)面優(yōu)化法（CCD）對(duì)繡球菌液體菌種培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以菌絲生物量為指標(biāo)，建立了繡球菌液體菌種培養(yǎng)與pH、培養(yǎng)溫度、裝液量3個(gè)因素的數(shù)據(jù)模型，用數(shù)據(jù)模型對(duì)菌絲生物量進(jìn)行了預(yù)測(cè)，確定了最佳培養(yǎng)條件。在pH為4.5，培養(yǎng)溫度為23.9 ℃，裝液量為114 mL的培養(yǎng)條件下，菌絲生物量達(dá)5.9 g/L。

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