許奇,張洪榕,許煒民,錢佳佳,4,黃桂成

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,安徽 合肥 230038;3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)藥信息工程學(xué)院,安徽 合肥 230038;4.南京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院·養(yǎng)生康復(fù)學(xué)院,江蘇 南京 210023)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種持續(xù)進(jìn)行性發(fā)展的關(guān)節(jié)退行性疾病,是老齡患者致殘的主要原因[1]。在OA中,關(guān)節(jié)炎癥是造成細(xì)胞外基質(zhì)降解、氧化應(yīng)激和軟骨細(xì)胞凋亡的重要因素,會(huì)導(dǎo)致軟骨侵蝕和骨損傷的發(fā)生[2-3]。已有大量的研究表明,炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等在OA的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,可通過減少軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原、聚集蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成來破壞軟骨細(xì)胞的代謝平衡[3]。因此,抑制或減輕軟骨細(xì)胞中IL-1β和IL-1β誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的表達(dá)是治療OA進(jìn)展的關(guān)鍵途徑。

高遷移率組蛋白B1(High mobility group box-1 protein,HMGB1)可作為趨化因子激活與炎癥相關(guān)的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,而針對(duì)HMGB1的特異性阻斷可以抑制其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[4-6]。前期研究發(fā)現(xiàn),HMGB1與OA的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān),其表達(dá)隨著OA小鼠病程的進(jìn)行性發(fā)展逐漸增加[7]。大量研究表明,HMGB1分泌至核外可作為促炎細(xì)胞因子激活核因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)信號(hào)傳導(dǎo)途徑,在軟骨細(xì)胞中誘導(dǎo)OA樣表型并促進(jìn)炎癥反應(yīng)[8-9]。

溫經(jīng)通絡(luò)湯是江蘇省名中醫(yī)黃桂成教授的經(jīng)驗(yàn)方,臨床療效確切,在改善患者炎癥與減緩疼痛方面作用顯著[10],但作用機(jī)制研究尚不完善。前期通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩查發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路是溫經(jīng)通絡(luò)湯發(fā)揮OA治療作用的有效通路之一[11]。因此,本研究擬從HMGB1/NF-κB通路入手,通過IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎癥模型,明確HMGB1對(duì)NF-κB通路的調(diào)控作用,并探討溫經(jīng)通絡(luò)湯發(fā)揮改善軟骨細(xì)胞炎癥的可能作用機(jī)制,以期為溫經(jīng)通絡(luò)湯的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1周齡SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠10只,8周齡SPF級(jí)SD大鼠10只,均自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購入,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2021-0006,飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)通過南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(202004A020)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

溫經(jīng)通絡(luò)湯(川桂枝8 g,澤瀉10 g,延胡索15 g,陳皮10 g,蜈蚣2 g,全蝎3 g,制附子10 g,懷牛膝10 g,熟地25 g,膽南星6 g,甘草10 g,土茯苓25 g),共134 g生藥(由江蘇省中醫(yī)院藥劑科提供)。制附子先煎30 min,其余藥材加8倍水浸泡30 min后煎煮2次,合并煎煮液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1.4 g·mL-1,4 ℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(01-172-1ACS,以色列Bioind);Ⅱ型膠原酶(C6885,美國(guó)Sigma-Aldrich);甲苯胺藍(lán)染色液(G3660,北京索萊寶);Murine IL-1β(211-11B-10,美國(guó)PeproTech);RNAi Easy-慢病毒(GIEL248104,上海吉?jiǎng)P基因);Mouse-anti-HMGB1、Mouse-anti-GAPDH、Goat-anti-Mouse、Goat-anti-Rabbit(66525-1-Ig、60004-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2,武漢三鷹);Rabbit-anti-IκBα、Rabbit-anti-p-P65、Rabbit-anti-P65(Ab32518、Ab194726、Ab16502,英國(guó)Abcam);Rabbit-anti-p-IκBα(2859,美國(guó)Cell Signaling);總RNA提取試劑盒、qPCR Master Mix(RC101、Q711-02,南京諾唯贊);RT Master Mix(G490,加拿大Abm);IL-6、PGE2、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒(YFXEM00045、YFXEM00048、YFXEM00031,南京翼飛雪)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

DM1000型生物顯微鏡(德國(guó)Leica),Mini Trans-blot cell電轉(zhuǎn)印槽系列(美國(guó)Bio-Rad),5200 CE型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能),CE IS09001型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城),Nano-300型微量分光光度計(jì)(山東萊索),DMi8研究級(jí)智能倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica),QuantStudio3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI)。

2 方法

2.1 溫經(jīng)通絡(luò)湯含藥血清制備

將10只SPF級(jí)SD大鼠[體質(zhì)量(240±10)g]隨機(jī)分為空白血清組和含藥血清組,每組各5只。根據(jù)人與動(dòng)物體表面積換算法確定含藥血清組大鼠的給藥劑量為14.07 g·kg-1·d-1,每只大鼠灌胃5 mL·kg-1,空白血清組給予等體積生理鹽水。2組均連續(xù)灌胃7 d,每日1次,末次給藥1 h后進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血。將采出的血樣室溫下靜置2 h后,3 500 r·min-1離心15 min,吸出血清于56 ℃水浴鍋中滅活30 min,0.22 μm無菌濾膜過濾除菌后分裝,于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 原代小鼠軟骨細(xì)胞的提取、培養(yǎng)與鑒定

將1周齡C57BL/6小鼠脫頸處死后浸泡于75%乙醇中消毒10 min后移入超凈臺(tái),分離小鼠膝關(guān)節(jié),暴露脛骨平臺(tái)與股骨遠(yuǎn)端,手術(shù)刀片輕輕刮取關(guān)節(jié)表面軟骨成薄片狀,放置于1個(gè)提前加入1%雙抗-PBS溶液的培養(yǎng)皿中,用顯微剪將刮取下的軟骨薄片盡可能剪碎后移入15 mL離心管中,加入5 mL 0.25%Ⅱ型膠原酶溶液于37 ℃培養(yǎng)箱中消化4～6 h,每隔30 min振蕩搖勻1次,直至軟骨組織消化至無明顯組織塊,細(xì)胞成團(tuán)狀簇集后加入5 mL完全培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗)終止消化,將細(xì)胞懸液經(jīng)100 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾,1 000 r·min-1上機(jī)離心5 min后棄上清,加入完全培養(yǎng)基重懸后接種于培養(yǎng)皿內(nèi),24 h后可觀察到細(xì)胞貼壁,待細(xì)胞覆蓋皿底90%時(shí)進(jìn)行傳代,取2～3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用甲苯胺藍(lán)染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

2.3 HMGB1慢病毒轉(zhuǎn)染

將慢病毒以MOI=100,完全培養(yǎng)基+HiTransG P培養(yǎng)條件感染軟骨細(xì)胞16 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d,熒光顯微鏡下觀察并檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染的感染效率。

2.4 軟骨細(xì)胞的分組與干預(yù)

取第3代軟骨細(xì)胞以0.5×105mL-1密度接種于6孔板中,設(shè)置HMGB1慢病毒轉(zhuǎn)染(RNAi-HMGB1)組和陰性慢病毒對(duì)照(RNAi-NC)組,分別采用慢病毒HMGB1與陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,驗(yàn)證慢病毒HMGB1的干擾效率。隨后進(jìn)行分組干預(yù):將細(xì)胞分為空白對(duì)照組,模型(IL-1β誘導(dǎo))組,轉(zhuǎn)染組,10%、15%、20%含藥血清干預(yù)組?？瞻讓?duì)照組不作任何處理,完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng);余下各組均用含10 ng·mL-1IL-1β的完全培養(yǎng)基處理24 h誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型。24 h后模型組更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,轉(zhuǎn)染組采用慢病毒RNAi-HMGB1感染細(xì)胞,含藥血清組分別用含10%、15%、20%含藥血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平

提取各組細(xì)胞總蛋白,BCA定量配平后取蛋白樣本進(jìn)行電泳(150 V恒壓下電泳40 min),采用濕轉(zhuǎn)法以恒流400 mA轉(zhuǎn)膜25 min,后依次進(jìn)行封閉、一抗[HMGB1(1∶2 000)、p-IκBα(1∶1 000)、IκBα(1∶5 000)、p-P65(1∶500)、P65(1∶1 000)、GAPDH(1∶100 000)]孵育,分別對(duì)應(yīng)二抗[Goat-anti-Mouse(1∶10 000)、Goat-anti-Rabbit(1∶10 000)]孵育,曝光后采用Image J分析圖像的灰度值,將目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。

2.6 qPCR檢測(cè)細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平

采取柱式提取法,按試劑盒說明提取細(xì)胞內(nèi)總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度與純度后按比例加入Nuclease-free H2O配平并稀釋濃度至0.1 ng·μL-1,以25 ℃ 10 min;42 ℃ 15 min;85 ℃ 5 min的條件在逆轉(zhuǎn)錄儀上將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后按說明書要求加入設(shè)計(jì)的引物及反應(yīng)試劑,混合后上機(jī)進(jìn)行qPCR反應(yīng)(表1)。

表1 PCR引物序列

2.7 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中炎癥因子的表達(dá)水平

收集各組干預(yù)后的細(xì)胞培養(yǎng)液,3 000 r·min-1離心20 min后仔細(xì)收集上清液,按照ELISA試劑盒說明檢測(cè)細(xì)胞上清中炎癥因子IL-6、PGE-2和TNF-α的表達(dá)水平,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm時(shí)的吸光值進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 小鼠原代軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

倒置顯微鏡下觀察小鼠原代軟骨細(xì)胞呈多邊形,“鋪路石”樣排列,邊界清楚,覆蓋率達(dá)95%以上,細(xì)胞狀態(tài)良好,見圖1A～B;經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后,細(xì)胞核呈深藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)顏色稍淺,核仁清晰,背景清楚,鑒定為軟骨細(xì)胞,見圖1C～D。

注:A,C.×100;B,D.×400

3.2 慢病毒轉(zhuǎn)染干擾軟骨細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)

如圖2所示,倒置熒光顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況,發(fā)現(xiàn)HMGB1慢病毒轉(zhuǎn)染組的熒光豐度較陰性慢病毒對(duì)照組更高。通過Western blot和qPCR檢測(cè)2組HMGB1的蛋白和mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示:HMGB1慢病毒轉(zhuǎn)染組較陰性慢病毒對(duì)照組轉(zhuǎn)染后HMGB1的表達(dá)水平顯著下降(P<0.01),說明慢病毒RNAi-HMGB1轉(zhuǎn)染可成功干擾軟骨細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)水平。

注:與RNAi-NC組比較,

3.3 干擾HMGB1的表達(dá)對(duì)NF-κB通路的影響

通過Western blot和qPCR檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞HMGB1及NF-κB信號(hào)通路的蛋白及mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示:IL-1β誘導(dǎo)炎癥模型中HMGB1蛋白及mRNA的表達(dá)水平較正常培養(yǎng)組均顯著升高(P<0.01),且模型組中p-IκBα/IκBα和p-P65/P65蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.01,P<0.001),NF-κB1、NF-κB2 mRNA表達(dá)水平也顯著上調(diào)(P<0.01),說明在IL-1β誘導(dǎo)的炎癥模型中NF-κB信號(hào)通路被激活。慢病毒RNAi-HMGB1轉(zhuǎn)染可顯著降低炎癥模型中HMGB1的表達(dá)(P<0.01),并有效抑制NF-κB信號(hào)通路的活化,表現(xiàn)為p-IκBα/IκBα和p-P65/P65的蛋白表達(dá)量下調(diào)(P<0.01,P<0.001),NF-κB1、NF-κB2 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05,P<0.01)。見圖3。

注:與空白對(duì)照組比較,

3.4 溫經(jīng)通絡(luò)湯含藥血清對(duì)炎癥因子表達(dá)水平的影響

通過檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-6、PGE-2和TNF-α的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與空白對(duì)照組相比,其余各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的炎癥因子PGE-2和TNF-α均有不同程度的升高(P<0.01);與模型組相比,溫經(jīng)通絡(luò)湯含藥血清對(duì)IL-6、PGE-2和TNF-α的表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,P<0.01),且對(duì)TNF-α的下調(diào)呈一定的劑量依賴性。見圖4。

注:與空白對(duì)照組比較,

3.5 溫經(jīng)通絡(luò)湯含藥血清對(duì)NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響

模型組p-IκBα/IκBα和p-P65/P65的蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組均顯著上調(diào)(P<0.01)。與模型組比較,溫經(jīng)通絡(luò)湯含藥血清能夠不同程度地下調(diào)二者的表達(dá),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。其中對(duì)于p-IκBα/IκBα蛋白相對(duì)表達(dá)量存在一定的劑量依賴性,20%含藥血清的抑制作用最為明顯。15%含藥血清對(duì)p-P65/P65的抑制作用最為明顯(P<0.01)。說明溫經(jīng)通絡(luò)湯含藥血清能夠抑制NF-κB信號(hào)通路的活化水平。見圖5。

注:與空白對(duì)照組比較,

3.6 溫經(jīng)通絡(luò)湯含藥血清對(duì)HMGB1蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示,模型組HMGB1蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組顯著上升(P<0.01),不同濃度的溫經(jīng)通絡(luò)湯含藥血清干預(yù)后,HMGB1的蛋白表達(dá)均有不同程度的下調(diào)(P<0.01)。說明溫經(jīng)通絡(luò)湯含藥血清可以抑制軟骨細(xì)胞炎癥模型中HMGB1的表達(dá)。

注:與空白對(duì)照組比較,

4 討論

OA是一種慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾病,其特征是軟骨基質(zhì)的進(jìn)行性降解直至破壞[12]。隨著病程時(shí)間的逐漸推移,滑膜中各種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生是引起關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)一步被破壞、關(guān)節(jié)韌帶及半月板退化和關(guān)節(jié)囊肥大發(fā)生的重要因素[13]。在OA的治療中常使用抗炎藥物如類固醇和非甾體抗炎藥來緩解關(guān)節(jié)疼痛與腫脹。因此,抑制軟骨細(xì)胞炎癥的發(fā)生是治療OA的有效方法。近年來,傳統(tǒng)中醫(yī)藥以其副作用小、有效性高、多途徑、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)在OA的治療中多有應(yīng)用,并受到廣泛關(guān)注。

溫經(jīng)通絡(luò)湯是黃桂成教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方,在OA患者治療中表現(xiàn)出明顯的抗炎作用,能夠緩解患者的關(guān)節(jié)疼痛與活動(dòng)障礙,并未顯現(xiàn)出明顯的毒副作用。前期研究已表明,溫經(jīng)通絡(luò)湯在前交叉韌帶切斷術(shù)(ACLT)誘導(dǎo)的小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型中可發(fā)揮抗炎、抗血管生成、修復(fù)軟骨損傷的作用[14-16],但尚未進(jìn)行其對(duì)軟骨細(xì)胞炎癥的相關(guān)研究。本研究提示,IL-1β可刺激軟骨細(xì)胞中其他相關(guān)炎性因子包括TNF-α、IL-6和PGE2的表達(dá)水平(P<0.01),加重OA的炎癥反應(yīng)。關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng)會(huì)促使基質(zhì)金屬降解酶和蛋白聚糖降解酶的表達(dá),造成軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解,引起軟骨網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整性被破壞,造成軟骨損傷[17]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)溫經(jīng)通絡(luò)湯含藥血清干預(yù)后,炎癥因子TNF-α、IL-6和PGE2的表達(dá)水平降低(P<0.05,P<0.01),提示溫經(jīng)通絡(luò)湯可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎性損傷。

NF-κB是OA發(fā)生過程中重要的信號(hào)通路,由Rel A(p65)、Rel B、c-Rel、NF-κB1(p50及其前體p105)和NF-κB2(p52及其前體p100)5個(gè)成員組成。在IκB的作用下,NF-κB以非活性形式存在于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞質(zhì)中。在機(jī)體受到刺激后,IκB蛋白發(fā)生磷酸化,并被蛋白酶體降解,使游離的NF-κB復(fù)合物移位到細(xì)胞核中,激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,上調(diào)炎癥細(xì)胞因子等的表達(dá)[18-20]。NF-κB通路是HMGB1發(fā)揮炎癥反應(yīng)的重要通路。本研究發(fā)現(xiàn),小鼠軟骨細(xì)胞發(fā)生炎性損傷之后,HMGB1的表達(dá)水平顯著上升(P<0.01),NF-κB通路被激活;通過慢病毒轉(zhuǎn)染干擾細(xì)胞內(nèi)HMGB1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)NF-κB相關(guān)蛋白及mRNA的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05,P<0.01),表明HMGB1可誘導(dǎo)NF-κB通路的激活,提示HMGB1/NF-κB途徑是改善IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性損傷的有效通路之一。溫經(jīng)通絡(luò)湯含藥血清干預(yù)后,HMGB1的表達(dá)水平較模型組明顯降低(P<0.01),并抑制了IL-1β引起的NF-κB通路的活化(P<0.05,P<0.01),說明溫經(jīng)通絡(luò)湯對(duì)軟骨細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平的抑制可能是通過HMGB1/NF-κB途徑發(fā)揮作用的。

綜上所述,研究軟骨細(xì)胞炎性損傷的病理機(jī)制,對(duì)OA的炎癥嚴(yán)重程度及關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)與修復(fù)將會(huì)有更為重要的研究意義。此次研究闡明了IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性損傷后,抑制HMGB1/NF-κB通路可有效改善小鼠軟骨細(xì)胞的炎癥表型;且HMGB1可能是發(fā)揮治療作用的潛在靶點(diǎn),溫經(jīng)通絡(luò)湯可能通過HMGB1的靶向抑制作用,降低NF-κB通路的活化水平,從而發(fā)揮改善軟骨細(xì)胞炎性損傷的作用。本研究為溫經(jīng)通絡(luò)湯改善關(guān)節(jié)炎癥的治療作用提供了新的證據(jù),也為OA的后續(xù)治療提供了新的研究方向。